fcs687s - Tesis Electrónicas UACh

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UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE
Facultad de Ciencias
Escuela de Ciencias
Susceptibilidad de Arcobacter Butzleri a metales pesados
Tesis de Grado presentada como parte de los requisitos para optar al Grado de
Licenciado en Ciencias Biológicas.
Profesor Patrocinante: Dr. Heriberto Fernández J. – Instituto de Microbiología
Clínica – Facultad de Medicina.
Gabriela Andrea Solís Luna
Valdivia Chile 2004
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RESUMEN
El género Arcobacter es considerado como patógeno emergente capaz de producir
diarreas en humanos y distintos cuadros infecciosos en animales.
Se aísla frecuentemente de deposiciones de animales, carcasas de pollos, mariscos
filtradores y aguas contaminadas. En este trabajo se determinó la susceptibilidad de 50 cepas de
A. butzleri aisladas de diferentes reservorios frente a mercurio (Hg), cromo (Cr), plata (Ag),
fierro (Fe), níquel (Ni), cobalto (Co), molibdeno (Mo), manganeso (Mn) y plomo (Pb), mediante
el método de doble dilución en agar. Los rangos de concentración usados fluctuaron entre 100 y
0.01 mmol/L .
Los resultados mostraron que el 100% de las cepas fueron resistentes a Mo, Mn, Ni, Co,
Pb y Fe, en cambio la totalidad de las cepas fue sensible a Hg, Ag y Cr.
El comportamiento de las cepas frente a la mayoría de los metales pesados fue poco
homogéneo ya que se encontró una gran dispersión en los valores de CIM obtenidos. Además,
según la variación de las CIM se pudo determinar 18 resistotipos diferentes.
SUMMARY
The genus Arcobacter have been considered as an emergent group associated to infectious
diarrhea in humans and to different infections in animals.
Arcobacter species have been frecuently isolated from animals fecal samples, chicken
carcasses, mussels and from surface water.
In this work ,the susceptibility of 50 A. butzleri strains isolated from different sources to
mercury (Hg), chromium (Cr), silver (Ag), níckel (Ni), cobalt(Co), iron (Fe), manganese (Mn),
molybdenum (Mo) and lead (Pb) was determined, using the agar double dilution method. The
concentration ranges used varied from 100 to 0.01 mmol/L.
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All the strains were resistant to Mo, Mn, Ni, Co, Pb and Fe and susceptible to Hg, Ag y
Cr. The CIM values of most of the strains showed a high variability, indicating a non
homogeneous behavior.
Having in consideration the CIM variability, it was possible to determine 18 resistotypes
among the strains under study.
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1. INTRODUCCION
El género Arcobacter y sus especies han sido considerados como patógenos emergentes y
su significación clínica en los seres humanos alude a infecciones tales como diarreas y
bacteremias (Anderson et al., 1993; Mansfield & Forsithe, 2000; On et al., 1995).
El género Arcobacter (del latín arcus: arco y del griego bacter: bacteria) pertenece a la
familia Campylobacteraceae, clase Proteobacteria, división Gracillicutes y posee cuatro
especies, Arcobacter butzleri, A. cryaerophilus, A. skirrowii y A. nitrofigilis (Atabay et al., 1998;
Fernández et al., 2000; Vandamme et al., 1991; Vandamme et al., 1992).
Este género se caracteriza por agrupar a bacilos Gram negativos, no esporulados que
presentan una morfología curva, helicoidal o en forma de S itálica. Son móviles por flagelación
monótrica o anfítrica que les proporciona una motilidad característica con giros sobre su propio
eje descrito como en forma de sacacorchos. Su tamaño puede oscilar entre 0,2 a 0,9 m de ancho
y 1,0 a 3,0 m de largo (Fernández et al., 2000; Vandamme et al., 1991; Mansfield & Forsithe,
2000).
Para su primer aislamiento requieren de ambiente microaerofílico. Sin embargo, si los
medios contienen substancias capaces de secuestrar oxígeno, es posible aislarlo en aerobiosis.
Para los subcultivos posteriores sólo necesitan de un ambiente aerobio y de un rango de
temperatura que va desde 15 ºC a 37 ºC con un óptimo de 26 ºC. Además, poseen un
metabolismo quimioorganotrófico utilizando aminoácidos o intermediarios del ciclo de los ácidos
tricarboxílicos como fuente de energía, por lo que los carbohidratos no son fermentados ni
oxidados. Son oxidasa positivo, catalasa positiva o variable (Fernández et al., 2000; Tee et al.,
1988; Vandamme et al., 1992; Cancino, 2002).
Considerados inicialmente como bacterias muy semejantes a Campylobacter, fueron
incorporadas a este género, aunque se diferenciaban por ser bacterias aerotolerantes y crecer a
26 ºC. Más tarde, los estudios de hibridación del DNA-RNA permitieron demostrar que no
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existen relaciones fenotípicas con Campylobacter, por lo cual se propuso un nuevo género
denominado Arcobacter (Fernández, et al., 1995b; Vandamme et al., 1991; Vandamme et al.,
1992).
Los primeros aislamientos de estas bacterias fueron realizados por Ellis et al. (1977) a
partir de fetos bovinos abortados. Posteriormente fueron asociados a mastitis bovinas y a abortos
de bovinos, ovinos, porcinos y equinos (Fernández et al., 1995b; Fernández et al., 2000).
De las cuatro especies de este género, sólo dos están asociadas a infecciones en humanos.
Este es el caso de A. butzleri, que ha sido aislado de deposiciones diarreicas, pacientes con
bacteremias, peritonitis y apendicitis y el caso de A. cryaerophilus, aislado a partir de pacientes
con bacteremias y diarreas. Respecto a A. skirrowii, sólo ha sido aislado de prepucio de toros, de
fetos abortados de bovinos, ovinos y porcinos como también de deposiciones diarreicas de estos
animales. Finalmente, A. nitrofigilis sólo está asociado a raíces de plantas no registrándose
ningún caso de infección humana o animal (Anderson et al., 1993; Atabay et al., 1998; Fernández
et al., 1995b; Fernández et al., 2000; Harras et al., 1998; Kiehlbauch et al., 1991; Mansfield et al.,
2000; On et al., 1995; Tee et al., 1988).
Estas bacterias poseen un hábitat muy variado, siendo encontradas en raíces de plantas,
reservorios de aguas, deposiciones de animales, carcasas de pollos y hasta en mariscos
filtradores. Así, entonces, podemos reconocer claramente las vías de transmisión para el hombre,
dadas por el consumo de alimentos, como carne y subproductos avícolas y por la ingesta de aguas
y mariscos contaminados (Boer et al., 1996; Jacob et al., 1998; Rodríguez, 2001).
Con respecto a los mecanismos de patogenicidad, aún son inciertas las respuestas a
muchas interrogantes en este sentido, debido a las escasas investigaciones sobre esta bacteria.
Fernández et al.(1995a) describieron, en una primera comunicación, que la toxigenicidad y la
capacidad de invadir el epitelio podrían ser posibles mecanismos de patogenicidad en A.
cryaerophilus. Otros investigadores asocian la presencia de citotoxinas a un posible mecanismo
agresor (Mansfield et al., 2000). Siguiendo la línea de escasa información del género Arcobacter,
muy poco se conoce sobre la susceptibilidad antimicrobiana y en mayor frecuencia sólo se ha
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informado sobre la resistencia de cepas de A. butzleri (Harras et al., 1998; Kiehlbauch et al.,
1992; On et al., 1995).
De toda la información recopilada, aún no se ha publicado ningún trabajo referente al
comportamiento de este género frente a metales pesados,
aunque si existe un amplio
conocimiento de los mecanismos de resistencia a iones de metales tóxicos en otros géneros
bacterianos, las transformaciones microbianas y las interacciones de éstos con los metales
pesados (Suárez & Reyes, 2002; Summers & Silver,1978).
La resistencia bacteriana a metales pesados se ha estudiado en los últimos 20 años y se ha
podido establecer los mecanismos que están involucrados, como es el caso de los mecanismos
codificados en plásmidos, responsables de la resistencia a metales como mercurio (Hg), arsénico
(As), cadmio (Cd), zinc (Zn), cobalto (Co), níquel (Ni), cobre (Cu), cromo (Cr) y telurio (Te).
Además, existen otros mecanismos de resistencia a estos metales que incluyen transformaciones
enzimáticas o proteínas transportadoras que bombean los iones fuera de la célula (Silver &
Phung, 1996; Suárez & Reyes, 2002; Silver & Misra, 1984).
El mecanismo de resistencia a los iones mercúricos es el mejor conocido y consiste en la
reducción enzimática del Hg+2 a la forma no tóxica y volátil Hg0 (Summers & Silver, 1972;
Summers & Silver, 1978) por efecto de la reductasa mercúrica bacteriana (Summers & Silver,
1978; Cervantes & Silver, 1996). Los iones Hg+2 son muy tóxicos para las bacterias debido a
que éstos se unen ávidamente a los grupos sulfhidrilos e inhiben la síntesis de macromoléculas y
la acción enzimática. Todos estos sistemas de resistencia mercuriales es una propiedad común
tanto para bacteria Gram positivas como Gram negativas codificados por genes plasmidiales.
(Clark et al., 1977; Summers & Silver, 1978; Weiss et al., 1977; Nakahara et al., 1979; Cervantes
& Silver, 1996)
Los iones de plata también son tóxicos para las bacterias debido a que interfieren con la
respiración (Bragg & Rainnie, 1974). Silver (1981), reportó que la resistencia a iones de plata
en una cepa de E. coli, mediada por un plásmido, podría deberse a que las bacterias resistentes
pueden extraer iones Ag+ de un precipitado de cloruro de plata mediante una bajísima absorción,
en comparación con la avidez con que las bacterias sensibles, carentes del plásmido, absorben los
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iones tóxicos (Cervantes & Silver, 1996; Silver & Misra, 1984). Por lo tanto, parece ser que la
resistencia a plata se debe a una función que está probablemente localizada en la superficie de la
célula y que evita que éstas extraigan los iones plata, los cuales están en forma insoluble o que
son liberados lentamente (Foster, 1983).
Cabe citar que otros mecanismos de resistencia a metales pesados están comúnmente
basados en nuevos sistemas de transporte de membrana que expelen los iones tóxicos desde el
citoplasma bacteriano (incluyendo Co, Ni, Zn y probablemente Cu y Cr) (Cervantes et al., 1991).
La resistencia a plomo (Pb), también se ha estudiado, como es el caso en Staphylococcus
aureus donde podría estar relacionada con la acumulación intracelular de cristales de fosfato de
plomo y el caso de Alcaligenes
que se asocia con depósitos en el espacio periplásmico
(Cervantes & Silver, 1996; Diels et al., 1995).
La resistencia a Cr, en especial al cromato (Cr VI) y a Cu, tóxicos para las bacterias,
poseen mecanismos de resistencia mediado por plásmidos. Estos actúan, para el caso de Cr como
inhibidor competitivo del transporte del sulfato descrito en Pseudomonas y Alcaligenes, y para
Cu se ha citado que pueden participar en la formación de radicales libres que dañan las
macromoléculas celulares en P. syringae y E. coli (Cervantes & Silver, 1996; Cervantes-Vega,
1986; Summers & Jacoby, 1978; Cha & Cooksey, 1991; Trevors, 1987). También, existen
referencias sobre mecanismos de resistencia mediados por plasmidios a compuestos de arsénico,
níquel, boro, antimonio, telurio y talio (Silver, 1996; Summers & Jacoby, 1977; Summers &
Jacoby, 1978; Summers & Silver, 1972), pero poco se conoce acerca de los
sistemas
involucrados en éstos.
La información recopilada respecto a los mecanismos de resistencia bacteriana a metales
pesados ha tenido diversas aplicaciones en los ecosistemas, siendo utilizadas algunas bacterias
como indicadores biológicos de contaminación. Además su capacidad de bioabsorber y
biotransformar los metales puede ser utilizada como una importante herramienta en el tratamiento
biológico de desechos contaminados con estos elementos (Suárez & Reyes, 2002).
Las actividades productivas humanas y la industrialización emergente en la zona de
Valdivia, son causantes de contaminación continua con diferentes metales pesados en el medio
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ambiente. Debido a una posible presión selectiva que podrían ejercer los metales sobre bacterias
aisladas de este ecosistema, es importante conocer la sensibilidad y resistencia bacteriana a estos
compuestos.
Siendo A. butzleri una bacteria emergente en microbiología clínica y veterinaria, aislada
también del medio ambiente, en este trabajo nos hemos propuesto determinar el comportamiento
in vitro en cepas aisladas de agua, hígado de pollo, mariscos, material fecal de aves y bovino a
metales pesados. Para ello se propone la siguiente hipótesis y objetivos:
1.1. HIPOTESIS DE TRABAJO
Las cepas de A. butzleri, independientemente de su origen, son susceptibles a la acción
antimicrobiana de sales de metales pesados.
1.2. OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Establecer, en términos de susceptibilidad o resistencia, el comportamiento de A. butzleri
frente a sales de metales pesados.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
Determinar la susceptibilidad cuantitativa de 50 cepas de A. butzleri a nueve sales de
metales pesados, mediante el método de doble dilución en agar.
Establecer, en estas cepas, los niveles de resistencia a estas sales de metales pesados,
según su origen.
Establecer los patrones de susceptibilidad y resistencia (resistotipos) que pudieran
presentarse, según origen de las cepas estudiadas.
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2. MATERIALES Y METODOS
2.1. MATERIALES
2.1.1. Cepas bacterianas
Fueron estudiadas 50 cepas de A. butzleri que formaban parte del cepario del Instituto de
Microbiología Clínica de la Universidad Austral de Chile, mantenidas bajo congelación, en leche
esterilizada, a -30°C.
La distribución de las cepas de acuerdo con su fuente de origen se muestran en la Tabla
Nº1.
TABLA 1. Distribución de 50 cepas de A. butzleri analizadas, según fuente de origen.
FUENTES DE ORIGEN
Macerado de hígado de pollo
Macerados de mariscos
Fecas de bovino
Fecas de pato doméstico
Fecas de pelícano
Aguas del río Calle - Calle
TOTAL
NUMERO DE CEPAS
12
18
5
2
7
6
50
2.1.2. Reactivos y Medios de Cultivo
Los reactivos y medios de cultivo utilizados en la fase experimental se indican a
continuación, en orden alfabético: alcohol-acetona, alcohol, agar-agar; ,agar Mueller - Hinton,
caldo CASO, fucsina, lugol, peróxido de hidrógeno (H2O2), reactivo de oxidasa: dihidrocloruro,
sales de metales pesados: AgNO3, NiSO4, HgCl2, Pb (C2H3O2), K2CrO4, MnSO4, FeSO4, CoO y
NaMoO4, tioglicolato, violeta de metilo.
2.1.3. Equipos
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Autoclave Orthmann, Balanza Chyo , Horno Pasteur Orsa, Incubadora Orthmann,
Microscopio óptico, de contraste fase y de fluorescencia Carl Zeiss, Refrigerador Sindelen,
Vortex Thermoline, Freezer Siemens.
2.1.4. Otros
Aceite de inmersión,
algodón, asa de siembra, matraces de vidrio de 250 ml,
cubreobjetos, gradillas, inoculador de Steers, lápiz marcador, matraces Erlenmeyer, mechero,
membrana de filtración, pinzas, pipetas graduadas de 0.1, 1, 5 y 10 ml, pipetas Pasteur, placas
Petri, portaobjetos, probeta de 500 y 1000 ml, tubos de ensayo, varilla de agitación.
2.2. METODOS
2.2.1. Recuperación de las cepas
A partir de las alicuotas congeladas en leche, las cepas de A. butzleri fueron recuperadas
en agar sangre mediante siembra por estrías y en tubos con caldo tioglicolato e incubadas en
aerobiosis a 26 ºC por 48 horas. Terminado el periodo de incubación se examinaron todas las
placas macroscópicamente y a las colonias sospechosas, que presentaban un tamaño alrededor de
1 mm de diámetro, translúcidas, lisas, convexas, de contorno regular y de aspecto húmedo, se les
realizó una tinción de Gram para determinar morfología típica, de bacilos Gram negativos curvos
o en S itálica (Ver Figura 1). Además, a manera de recomprobación, las colonias sólo fueron
sometidas a las pruebas de catalasa y oxidasa (ambas positivas), ya que se trabajó con cepas
puras, previamente identificadas, que no requerían de reidentificación mediante la batería de
pruebas bioquímicas correspondiente.
FIGURA 1. Recuperación de cepas de A. butzleri .
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2.2.2. Método de Doble Dilución en Agar para establecer concentración inhibitoria mínima
(Método de Ericsson & Sherris).
Luego que las cepas de A. butzleri fueron recuperadas, se determinó la susceptibilidad a nueve
sales de metales pesados utilizando el método de Ericsson y Sherris (1971), descrito inicialmente
para establecer concentración inhibitoria mínima (CIM) frente a antibióticos. Para establecer la
CIM frente a metales pesados,
se utilizó una serie de placas con agar Mueller-Hinton
conteniendo las sales en concentraciones progresivas (inicialmente en dilución logarítmica en
base 10 y, en una segunda etapa, en diluciones al doble, con el objeto de obtener datos más
12
precisos de la susceptibilidad o resistencia). Posteriormente, las cepas fueron sembradas en estas
placas mediante un inoculador de Steers y se dejó incubar por 48 horas a 26º C en aerobiosis
determinándose la mínima concentración de la sal capaz de inhibir el desarrollo microbiano
(CIM). Para control de crecimiento, se utilizó una placa de agar Mueller-Hinton sin la adición de
sales de metales pesados.
2.2.2.1. Metales pesados utilizados
Las sales de metales pesados fueron obtenidos de fuentes comerciales estándares y se prepararon
soluciones stock en agua destilada, se esterilizaron por filtración y fueron mantenidas a 4ºC y
todas a la concentración de 1 mol/L: AgNO3, NiSO4, HgCl2, Pb (C2H3O2), K2CrO4, MnSO4,
FeSO4, CoO y NaMoO4.
2.2.2.2. Preparación de las placas
Se prepararon una serie de placas Petri de 9 cm de diámetro mediante una mezcla de 2 ml de la
dilución de cada sal de metal pesado, con 18 ml de agar Mueller- Hinton.
En una primera etapa se realizaron diluciones logarítmicas base 10 y las concentraciones que
obtuvo cada placa Petri fue de 100; 10; 1; 0.1 y 0.01 mmol/L para cada uno de los metales
(Figura 3).
Esta primera determinación permitió fijar rangos de susceptibilidad para cada una de las cepas.
Posteriormente se ensayaron las dobles diluciones, para cada uno de los metales, con el objeto de
obtener datos más precisos de la susceptibilidad o resistencia (Figura 4). La Tabla Nº2, muestra
las concentraciones finales con que se trabajó para cada sal de metal pesado en esta segunda
etapa.
TABLA 2. Concentraciones utilizadas para cada sal de metal pesado.
SAL DE METAL PESADO
FeSO4
Pb ( C2H2O2 )
MnSO4
NaMoSO4
HgCl2
CONCENTRACION ( mmol/L )
1-2-4-8
1-2-4-8
10-20-40-80
10-20-40-80
0.01-0.02-0.04-0.08
13
AgNO3
K2CrO4
NiSO4
CoO
0.01-0.02-0.04-0.08
0.01-0.02-0.04-0.08
1-2-4-8
10-20-40-80
2.2.2.3. Preparación del inóculo
El inóculo fue preparado a partir de un cultivo de 48 horas en caldo CASO, incubado a 26º C.
Posteriormente, cada cultivo fue diluido 1:5 en agua destilada estéril.
La finalidad de esta dilución es obtener un botón de crecimiento de 5 a 8 mm de diámetro sobre
la placa con agar Mueller-Hinton (Cancino, 2002).
2.2.2.4. Siembra en placas
Las placas fueron sembradas desde la menor a la mayor concentración mediante un inoculador de
Steers calibrado, de 32 vástagos, cada uno de los cuales deposita una gota de aproximadamente
0,001 ml de la suspensión bacteriana (Figura 2).Se utilizó como control de viabilidad una placa
de agar Mueller-Hinton sin metales pesados.
2.2.2.5. Incubación y lectura de las placas
Las placas fueron incubadas a 26º C por 48 horas en aerobiosis y se estableció como CIM a la
menor concentración de cada sal de metal pesado que inhibía completamente el crecimiento
macroscópico de las cepas.
Se determinó como nivel de resistencia la presencia de desarrollo bacteriano a una concentración
igual o mayor a 1.0 mmol/L de metal pesado, según las recomendaciones de Nakahara et al.
(1978) y Mohammad (2002).
FIGURA 2. Placa Petri sembrada con inoculador de Steers.
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FIGURA 3. Representación Esquemática de Dilución Logarítmica base 10 (primera etapa)
15
FIGURA 4. Representación Esquemática de Doble Dilución para FeSO4 (segunda etapa)
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2.2.3. Determinación de patrones de susceptibilidad y resistencia (resistotipos).
Los patrones de susceptibilidad y resistencia (resistotipos) fueron establecidos una vez conocidas
todas las concentraciones inhibitorias mínimas (CIM) para cada una de las 50 cepas, para los
nueve metales pesados en estudio. Los resistotipos corresponden a los perfiles o patrones de
resistencia y susceptibilidad presentados por cada cepa en estudio.
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3. RESULTADOS
En Tabla Nº3 se observa las CIM obtenidas mediante el método de doble dilución en agar para
cada una de las nueve sales de metales pesados.
TABLA 3. CIM de 50 cepas de A. butzleri a nueve sales de metales pesados.
R: resistente
S: sensible
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El comportamiento de las cepas estudiadas fue muy poco homogéneo, ya que se encontró una
gran dispersión en los valores de CIM obtenidos, los que oscilaron entre 0.01 y >100 mmol/L,
con un total de diez CIM distintas.
En esta Tabla se puede apreciar también los rangos de resistencia (4 a >100 mmol/L)
y
susceptibilidad ( 0.01 a 0.1 mmol/L ) y, además, se puede observar que los valores de CIM más
frecuentemente encontrados son 8 y >100 mmol/L para las cepas resistentes y los más
frecuentes para las cepas susceptibles fueron 0.08 y 0.04 mmol/L.
Todas las cepas de A. butzleri fueron susceptibles a Hg, Ag y Cr, presentando una CIM menor a 1
mmol/L.
Los niveles de resistencia más altos (100 %) para todas las cepas en estudio correspondieron a
Mo y Co, con CIM >100 mmol/L.
En la Tabla Nº4 se muestra la distribución de las CIM de todas las cepas de A. butzleri
resistentes y en la Tabla Nº5, la de las cepas sensibles a las nueve sales de metales pesados,
según su origen.
TABLA 4. Distribución de 50 cepas resistentes de A. butzleri frente a seis metales pesados,
según origen y CIM.
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CIM : Concentración inhibitoria mínima expresada en mmol/L.
En la Tabla Nº4 se observa que todas las cepas de A. butzleri independientemente de su fuente de
origen presentaron resistencia a Mn, Ni, Mo, Co, Pb y Fe.
Para el caso de Mn y Ni se obtuvieron dos CIM distintas. Para Mn se determinó las CIM de 10 y
20 mmol/L y para Ni, las CIM de 4 y 8 mmol/L.
En las fuentes de origen correspondientes a macerado de hígado de pollo, macerado de mariscos,
fecas de bovino se encontraron cepas que tuvieran una CIM de 20 mmol/L a Mn Las cepas con
CIM de 10 mmol/L a Mn, se distribuyeron más ampliamente entre los distintos reservorios que
las cepas con CIM de 20 mmol/L, a excepción de las cepas aisladas de aguas del río Calle-Calle,
en que todas ellas sólo fueron resistentes a esta última concentración.
En el caso de Ni, todas las cepas presentaron una CIM de 4 mmol/L, con excepción de una
única cepa con una CIM de 8 mmol/L, proveniente de material fecal de bovino.
Frente a Fe y Pb, las cepas mostraron un comportamiento muy homogéneo con sólo una CIM
correspondiente a 8 mmol/L. Muy similar fue el comportamiento frente a Mo y Co, donde todas
las cepas aisladas fueron resistentes a una CIM mayor a 100 mmol/L.
TABLA 5. Distribución de 50 cepas sensibles de A. butzleri a tres metales pesados, según
origen y CIM.
20
CIM : Concentración inhibitoria mínima expresada en mmol/L.
En la Tabla Nº5, se muestra el comportamiento de todas las cepas de A. butzleri sensibles a Hg,
Ag y Cr, donde se observa que los valores de sensibilidad oscilaron entre 0.01 y 0.1 mmol/L.
En el caso de Hg, se obtuvieron cuatro CIM distintas, correspondientes a 0.01, 0.02, 0.04 y 0.08
mmol/L. Las cepas aisladas de macerado de hígado de pollo, mariscos y muestras fecales de
bovino presentaron CIM de 0.01, 0.02 y 0.04 mmol/L. Las cepas aisladas de material fecal de
pato sólo fueron inhibidas a las CIM de 0.02 y 0.08 mmol/L, las aisladas de material fecal de
pelícano fueron susceptibles a 0.02 y 0.04 mmol/L y las cepas aisladas de aguas del río CalleCalle fueron inhibidas por una CIM de 0.01 mmol/L.
Con respecto a Ag, se determinaron dos CIM (0.04 y 0.08 mmol/L) y todas las cepas en estudio
presentaron una mayor frecuencia de sensibilidad a 0.08 mmol/L. Las CIMs para Cr fueron
0.04, 0.08 y 0.1 mmol/L. Todas las cepas aisladas de material fecal de pato presentaron una CIM
de 0.04 mmol/L. Las cepas provenientes de macerado de hígado de pollo, material fecal de
bovino, de pelícano, macerado de mariscos y de agua fueron inhibidas por 0.08 mmol/L Las
cepas susceptibles a una CIM de 0.1 mmol/L fueron las cepas aisladas de macerado de hígado de
pollo, macerados de mariscos y las de origen fecal de bovino.
21
La Tabla Nº6, muestra los 18 patrones de susceptibilidad y resistencia (resistotipos) establecidos
en este estudio, basados en la variación de las CIM.
TABLA 6. Patrones de susceptibilidad y resistencia (resistotipos) a nueve metales pesados,
según variación de la CIM.
Resistotipo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
Hg
CIM
0.02
0.04
0.02
0.04
0.01
0.01
0.02
0.02
0.02
0.02
0.02
0.01
0.01
0.01
0.01
0.04
0.02
0.08
Ag
CIM
0.08
0.08
0.08
0.08
0.04
0.04
0.08
0.04
0.04
0.04
0.08
0.04
0.08
0.04
0.08
0.08
0.08
0.08
Cr
CIM
0.04
0.04
0.1
0.08
0.1
0.08
0.1
0.08
0.08
0.04
0.08
0.08
0.08
0.04
0.04
0.1
0.08
0.04
Mn
CIM
10
10
10
10
20
10
20
20
10
20
20
20
20
10
20
10
10
10
Ni
CIM
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
8
4
Mo
CIM
>100
>100
>100
>100
>100
>100
>100
>100
>100
>100
>100
>100
>100
>100
>100
>100
>100
>100
Co
CIM
>100
>100
>100
>100
>100
>100
>100
>100
>100
>100
>100
>100
>100
>100
>100
>100
>100
>100
CIM : Concentración inhibitoria mínima expresada en mmol/L.
Todas las cepas estudiadas fueron resistentes a seis metales pesados ( Mn, Ni, Mo, Co, Fe y Pb )
y susceptibles a tres metales pesados (Hg, Ag y Cr). De acuerdo a los distintos niveles de
tolerancias a los nueve metales pesados, fueron determinados 18 resistotipos en las cepas
analizadas.
La Tabla Nº7 muestra la distribución de los 18 resistotipos obtenidos, según origen de las cepas
de A. butzleri.
TABLA 7. Distribución de los patrones de susceptibilidad y resistencia (resistotipos) a nueve
metales pesados, según origen de las cepas de A. butzleri.
Fe
CIM
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
22
El resistotipo 4 fue el más frecuentemente encontrado, correspondiendo a un 22%, con una alta
frecuencia de distribución en la cepas provenientes de material fecal de pelícano (42.9%),
macerado de hígado de pollo (25%) y de macerado de mariscos (22.2%).
El segundo resistotipo más frecuente fue el 1 (12%), siendo las cepas aisladas de macerados de
hígado de pollo, de macerados de mariscos, material fecal de bovino y pato quienes mostraron
este comportamiento.
Del total de las cepas, el resistotipo 13 se presenta con una frecuencia del 10%, y la frecuencia
de distribución más alta fue para las cepas aisladas de aguas del río Calle-Calle (50%). Los
resistotipos 11,12 y 17 tuvieron una frecuencia del 8%.
Las frecuencias más bajas fueron para los resistotipos 3, 5, 8, 9 y 10 con 4% para cada uno,
seguido de los resistotipos 2, 6, 7, 14, 15, 16 y 18, los cuales tuvieron sólo una frecuencia del 2%.
Analizando los datos según origen de las cepas, entre las cepas aisladas de macerados de hígado
de pollo y de macerados de mariscos se encontró el mayor número de resistotipos (9 y 10
respectivamente).
23
Para las cepas de bovino, los resistotipos más frecuentes fueron 1, 4, 9, 13, y 16 (20% para cada
uno). Para las cepas provenientes de material fecal de pato y pelícano, mostraron sólo dos
resistotipos. Por último, en las cepas aisladas desde aguas de río, el resistotipo 13 fue el más
frecuente ( 50%).
24
4. DISCUSION
Debido a la relación de A. butzleri con cuadros clínicos en el hombre, como diarreas, septicemias,
endocarditis, bacteremias (Kiehlbauch et al., 1991; On et al., 1995; Yan et al., 2000; Mansfield &
Forsythe, 2000) y también ser responsables de infecciones y abortos en animales (On et al.,
2002; Higgins et al., 1999; De Oliveira et al., 1997; Wesley et al., 2000), surge la necesidad de
conocer el comportamiento de A. butzleri, en términos de susceptibilidad y resistencia, a metales
pesados, los cuales pueden ser encontrados en el medio ambiente producto de las distintas
actividades humanas o bien por contaminación de origen animal.
Se trabajó con 50 cepas de A. butzleri aisladas de macerados de hígado de pollo, macerado de
mariscos, fecas de bovino, pato doméstico, pelícano y de aguas del río Calle-Calle, a las cuales se
les determinó la susceptibilidad a sales de metales pesados mediante el método de doble dilución
en agar.
Para efectos de la discusión de nuestros resultados es necesario dejar en claro que no existen
antecedentes bibliográficos acerca de la susceptibilidad a metales pesados en esta especie y
tampoco en ninguna de su género. Por lo tanto, nuestros resultados serán contrastados con los
obtenidos por otros autores estudiando otras bacterias Gram negativas, aisladas de diferentes
fuentes.
No obstante lo anterior, existen antecedentes de la susceptibilidad a metales pesados en el género
Campylobacter, como es el caso de Kazmi et al. (1985), quienes demostraron que las cepas de
este género presentaban una alta susceptibilidad a cloruro de cadmio. Otro estudio fue el
realizado por Stern et al. (1988), referentes a cepas de C. jejuni y su respuesta a combinaciones
de sulfato ferroso y cloruro de cadmio y, por último, cabe citar a Epoke et al. (1992), quienes
realizaron una investigación sobre el efecto in vivo de cloruro de cadmio sobre intestino de ratas
colonizados por C. jejuni.
25
El género Arcobacter fue relacionado con el género Campylobacter y sus especies consideradas
inicialmente como bacterias aerotolerantes semejantes a Campylobacter (aerotolerant
Campylobacter-like organisms), las que fueron incorporadas primero al género Campylobacter,
conformando la especie C. cryaerophyla (Neil et al., 1985). Actualmente, integra el género
Arcobacter recibiendo la denominación de A. cryaerophilus (Vandamme & De Ley, 1991;
Vandamme et al., 1992).
Los resultados de la Tabla Nº3, muestra el comportamiento poco homogéneo de todas las cepas
analizadas, ya que para el caso de Hg, Ag, Cr, Mn y Ni, las cepas presentaron distintas CIM,
encontrándose más de un valor de CIM para cada metal, con un total de 10 CIM distintos en las
cepas analizadas a las nueve sales de metales pesados, a diferencia de los trabajos de Moraga et
al. (2003) quienes determinaron la resistencia de metales pesados en Pseudomonas y Alcaligenes,
aisladas de la bahía de Iquique (Chile) y en donde sus resultados sólo muestran un valor de CIM
para cada metal analizado.
Los resultados expuestos en la Tabla Nº4, muestra que el 100% de las cepas estudiadas fueron
resistentes a Mn, Ni, Mo, Co, Fe y Pb.
Con respecto a Ni, los resultados obtenidos en esta investigación difieren con los obtenidos por
Moraga et al. (2003) quienes encontraron que sólo un 36.4% de las cepas de Pseudomonas y
Alcaligenes fueron resistentes a este metal. Resultados similares mostraron Sabry et al. (1997)
en Egipto, determinando una resistencia del 40% a Ni, valor muy por debajo del obtenido en este
estudio.
En relación a Pb, existe una coincidencia de nuestros resultados con los obtenidos por Moraga et
al. (2003), quienes también obtuvieron un 100% de resistencia a este metal. Sabry et al. (1997)
reportaron valores similares correspondientes a un 94% de resistencia a este metal. Sin embargo,
difiere bastante de los niveles de resistencia obtenidos por Mohammad (2002), en Irán, quien
determinó sólo un 62% de resistencia en cepas de Pseudomonas aeruginosa aisladas de pacientes
quemados.
Todas nuestras cepas fueron resistentes a Co. Muy diferentes fueron los resultados que
obtuvieron Sabry et al. (1997), los que determinaron una marcada sensibilidad (83%) en bacteria
26
aerobias heterótrofas, aunque más tarde Bhattacharya et al. (2000) determinaron un 37% de
resistencia a este metal a partir de cepas de Vibrio parahaemolyticus aisladas de camarones, en
Calcuta, India.
De acuerdo a la Tabla Nº5, el 100% de las cepas analizadas fueron sensibles a Hg, Ag y Cr.
Con respecto a Hg, los resultados obtenidos en este estudio muestran similitud con los datos
publicados por Mohammad (2002), quien determinó una frecuencia de sensibilidad de un 91%
a este metal.
Opuestos fueron los resultados obtenidos por Nakahara et al. (1978) en Japón, quienes
determinaron un 65,8% de resistencia a mercurio en cepas de Klebsiella pneumoniae de
aislamiento clínico. También determinaron niveles de resistencia a este metal, Marques et al.
(1979), Cervantes-Vega et al. (1986) y De Vicente et al. (1990), en España, en cepas de P.
aeruginosa aisladas desde medio ambiente, con un 75%, un 31% y un 25% de resistencia
respectivamente.
En relación a Ag, nuestros resultados difieren completamente de los obtenidos por Marques et al.
(1979), quienes informaron sólo frecuencias de resistencia de un 11% en cepas de P. aeruginosa.
Khor & Jegathesan (1983) también obtuvieron frecuencia de resistencia en bacterias Gram
negativas del 21% a este metal. Más tarde, estudios realizados por Grewal y Tiwari (1990) en
cepas de E. coli determinaron un 71.8% de resistencia y en 1999, los mismos investigadores
obtuvieron un 93% de resistencia, pero en cepas de Klebsiella pneumoniae.
Nuestros resultados respecto a Cr, muestran un mayor porcentaje de sensibilidad en comparación
con la investigación realizada por Mohammad (2002), quien obtuvo un 85% de sensibilidad a
este metal. Distintos fueron los resultados que obtuvieron De Vicente et al. (1990) y CervantesVega (1986), quienes determinaron frecuencias de resistencia de un 6% y un 3% respectivamente
a este metal.
La mayoría de las substancias metálicas que se acumulan en las células bacterianas pueden ser
transformadas a compuestos de menor toxicidad por ciertos complejos enzimáticos (Suárez &
Reyes, 2002). El caso mejor estudiado es el del mercurio, que posee un mecanismo de resistencia
27
mediado por plasmidios, que permite la reducción enzimática de Hg+2 a la forma no tóxica Hg0
(Cervantes & Silver, 1996).
En nuestro estudio los resultados muestran que las cepas analizadas sólo presentaron una alta
sensibilidad a este metal, por lo que se podría deducir que éstas cepas no poseen plásmidos que
les confiera tal resistencia, sino más bien para el caso específico de las cepas aisladas desde
ambientes acuáticos ocurriría el proceso normal de la transformación del Hg0, que se encuentra
en forma elemental en la atmósfera, oxidándose fotoquímicamente al ion mercúrico Hg+2, forma
bajo la cual entra a los ambientes acuáticos (Madigan et al., 1997). El Hg+2 se absorbe en la
materia orgánica particulada donde es metabolizado por los microorganismos, produciendo el
metilmercurio (CH3Hg+). Los compuestos orgánicos del Hg se unen a proteínas, actuando como
potentes toxinas produciendo finalmente la muerte del microorganismo y también de células
animales (Olson et al., 1979; WHO, 1991; Stein et al., 1996; Madigan et al., 1997).
Algunos metales como Co y Ni sirven como micronutrientes y son usados en procesos redox, en
la estabilización de moléculas a través de interacciones electrostáticas, como componentes de
varias enzimas y en la regulación de la presión osmótica (Bruins et al., 2000).
El plásmido pMOL28 es el responsable de conferirle resistencia a Alcaligenes eutrophus CH34
a Co y a Ni ,y el sistema de resistencia mejor descrito para estos metales, es el descrito para esta
bacteria, el cual consiste en un sistema de antiportador protón/catión, formado por proteínas de
las membrana interna y externa y de una proteína transmembranal que funcionan como dímeros
(Diels et al., 1995, Cervantes & Silver, 1996). Quizás, la resistencia que presentaron nuestras
cepas a Ni y a Co, se deba a este tipo de sistema pero sólo estudios posteriores podrían verificar
nuestros supuestos.
La sensibilidad a la Ag podría deberse a que es un agente antimicrobiano potente y que actúa
principalmente como inhibidor de la respiración microbiana (Bragg & Rainnie, 1974)
La sensibilidad a Cr, podría verse alterada si los microorganismos tuviera plásmidos para
conferirles resistencia (Cervantes & Silver, 1992), pero en este estudio se obtuvo un 100% de
sensibilidad en todas las cepas analizadas por lo que suponemos que este comportamiento es
debido a la carencia de plasmidios.
28
La resistencia que mostraron nuestras cepas a plomo, puede deberse a que existen sistemas de
resistencia codificados por plásmidos para este metal, como fuera verificado por Silver (1998)
para otros microorganismos.
La alta frecuencia de resistencia a Fe se podría deber, a que éste es un nutriente esencial en el
crecimiento de las bacterias y juega un papel fundamental en la respiración celular, siendo un
componente clave de los citocromos y de las proteínas que contienen hierro y azufre implicadas
en el transporte de electrones (Amaro et al., 1990).
Existe un estudio realizado por Paredes (1998), quien determinó presencia de metales pesados en
dos especies de bivalvos del estuario de Valdivia y la Bahía de Corral, concluyendo que, para el
caso de los metales Pb y Ni, usados también en nuestras investigaciones, las concentraciones de
éstos metales se encuentra bajo los límites internacionales y nacionales permitidos para ambas
especies de bivalvos. Al tratar de relacionar la alta resistencia que presentaron nuestras cepas
aisladas a partir de macerados de mariscos de la misma zona geográfica a Pb y Ni, con los
resultados anteriormente descritos, se deduce que no existe relación aparente entre la resistencia
observada y los niveles de concentración de éstos metales determinados en mariscos.
De igual manera se trató de relacionar la cantidad de metales pesados en el agua, con la
resistencia de éstas bacterias aisladas de columnas de agua del río Calle-Calle. Según
investigaciones realizadas por Quiroz et al. (1992), en la zona urbana del río de Valdivia se
encontraron niveles altos de concentraciones de Zn, Pb y Cu.
Contreras (1998), evidenció menores concentraciones de Cd, Hg, Cr, y Zn en sedimentos del
sistema estuarino de Valdivia y también bajas concentraciones de Cr, Cu, Ni, Pb y As, en
comparación con estudios de Quiroz et al. (1992) y Villalobos (1997), por lo que concluyó que
probablemente los metales pesados hayan permanecido en suspensión en la columna de agua. A
pesar de estos datos, no podemos sustentar que la resistencia de las cepas aisladas de A. butzleri
de columnas de agua del río Calle-Calle se deba a la continua exposición de los microorganismos
a metales pesados suspendidos en el agua, aunque también es dable pensar que ellos podrían
ejercer una presión selectiva, al igual como ocurre con las drogas antimicrobianas (Podschun,
1998)
29
Nuestros resultados muestran que todas las CIM obtenidas abarcan un amplio rango de valores,
desde 0.01 mmol/L a valores superiores a los 100 mmol/L.(Tabla Nº3). Esto demuestra el
comportamiento muy poco homogéneo de las cepas de A. butzleri sometidas a este tipo de
análisis.
Como se obtuvo variados valores de CIMs y no sólo uno para cada metal, fue escogido este
criterio para determinar resistotipos para cada una de las cepas analizadas.
En nuestro estudio, se logró obtener 18 resistotipos (TablaNº6). De acuerdo a la distribución de
éstos, según el origen de las cepas de A. butzleri (Tabla Nº7), el resistotipo 4 fue el que presentó
la frecuencia más alta (22%), seguido del resistotipo 1, con una frecuencia del 12% y el
resistotipo 13 que sólo presentó una frecuencia del 10%. Estos resultados muestran que para el
caso del resistotipo 4, ninguna cepa aislada de material fecal de pato y de las aguas del río Calle–
Calle presentó este patrón. Respecto al resistotipo 13, cabe destacar que sólo a las cepas aisladas
de las aguas del río Calle –Calle, de macerados de mariscos y las aisladas de material fecal de
bovino se les determinó solamente este patrón.
Según el origen de las cepas, las únicas que presentaron una distribución
más o menos
homogénea entre los 18 patrones distintos, fueron las cepas provenientes de macerado de hígado
de pollo y de mariscos, a diferencia del resto de las cepas y sus respectivos orígenes, a las que se
les pudo determinar dos, tres y hasta cinco resistotipos diferentes.
Es posible que, al igual que la determinación de resistotipos frente a antibióticos, la
determinación de resitotipos frente a metales pueda tener aplicación como marcador
epidemiológico (Elek & Higney, 1970; Sharma et al., 2003). Sin embargo, para una efectiva
utilización de éstos, sería necesario primero un estudio comparativo con métodos de marcaje
epidemiológico de reconocida discriminación.
La investigación realizada permitió conocer el comportamiento de cepas de A. butzleri en
términos de susceptibilidad y resistencia en condiciones de laboratorio.
Se determinaron
resistencias a concentraciones muy altas ( >100 mmol/L) como sensibilidad a concentraciones
muy bajas ( 0.01 mmol/L). Por último, cabe mencionar que los datos de esta investigación
podrían servir de base para estudios posteriores tendientes a conocer mejor la epidemiología de
30
esta bacteria, como también explorar la posibilidad de utilizar la actividad antimicrobiana de las
sales de metales pesados como elemento inhibidor de la microbiota acompañante en medios
selectivos.
De acuerdo a los resultados obtenidos, la hipótesis es rechazada para el caso de los metales de
Mn, Fe, Pb, Ni, Co, y Mo en donde las cepas de A. butzleri, independientemente de su origen, no
fueron susceptibles y es aceptada para los metales de Hg, Ag y Cr.
31
5. CONCLUSIONES
Todas las cepas fueron resistentes a Mn, Fe, Pb, Ni, Co y Mo.
El 100% de las cepas fueron sensibles a Hg, Ag y Cr.
El comportamiento de todas las cepas de A. butzleri analizadas frente a la mayoría de los metales
pesados fue poco homogéneo ya que se encontró una gran dispersión en los valores de CIMs
obtenidos.
Los niveles de resistencia establecidos en este estudio fluctuó de 4 mmol/L a > 100 mmol/L.
Se encontró una alta resistencia a Mo y
Co. El 100% de las cepas fue resistente a una
concentración mayor a 100 mmol/L.
Se determinaron según la variación de las CIMs, 18 resistotipos, siendo el resistotipo 4 el que
mostró la más alta frecuencia (22%) respecto al número total de cepas estudiadas.
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ANEXOS
ANEXO 1
PRUEBAS DE IDENTIFICACION PRESUNTIVA PARA EL GENERO ARCOBACTER
Prueba de la catalasa:
La catalasa es una enzima que se encuentra en la mayoría de las bacterias aerobias, que en
presencia de peróxido de hidrogeno (H2O2) hace que éste se desdoble en agua y oxígeno.
Procedimiento: En un portaobjeto se deposita un pequeño inóculo de la cepa a estudiar y se le
adiciona una gota de peróxido de hidrogeno (H2O2). En una reacción positiva se observa un
desprendimiento de burbujas.
Prueba de la oxidasa:
38
Esta se basa en la producción de la enzima oxidasa, la que al encontrarse con el oxígeno
atmosférico, citocromo C y el reactivo de oxidasa, oxida el reactivo para formar indofenol,
compuesto coloreado.
Procedimiento: La prueba consiste en impregnar un papel filtro con gotas del reactivo sobre la
cual se coloca un inóculo de la cepa en estudio, la cual es extraída con una pipeta pasteur para
evitar falsos positivos que se puedan obtener al utilizar asa de micrón. La reacción positiva se
visualiza después de 10 seg. por un cambio de color gradual de rosa pálido a púrpura oscuro.
ANEXO 2
MEDIOS DE CULTIVO
AGAR SANGRE
Base Agar Bacteriológico OXOID N ° 1 - 15 g
Caldo Tripticasa de Soya - 30 g
Extracto de levadura 1% - 10 g
Sangre - 50 ml
Agua destilada - 1000 ml
AGAR MUELLER HINTON
Agar Base OXOID - 38 g
Agua Destilada - 1000 ml
CALDO TIOGLICOLATO
Base Caldo OXOID - 29 g
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Agua Destilada - 1000 ml
CALDO CASO
Caldo Base MERCK - 30 g
Agua Destilada - 1000 ml
Todos los agares fueron disueltos en agua destilada y llevados a ebullición
para luego
esterilizarlos en autoclave (121º C por 15 min.) y distribuirlos más tarde en placas Petri. Para el
agar sangre se esterilizó el agar base y luego se enfrió aproximadamente hasta 50ºC para poder
adicionar la sangre.
En el caso de los caldos, también fueron disueltos en agua destilada, llevados a ebullición y
esterilizados en autoclave (121 º C por 15 min.) pero fueron alicuotados en tubos con 4 ml de
caldo cada uno.