ART.+CIENTIF+Ing+Gomez. 2

CARACTERIZACIÓN
(Ullucus tuberosus)
BIOQUÍMICA DE LAS PROTEÍNAS DE OLLUCO
BIOCHEMISTRY CHARACTERIZATION OF THE PROTEINS OF OLLUCO
(Ullucus tuberosus)
*NARCIZO GÓMEZ VILLANES*
RESUMEN
El trabajo de investigación se realizó en los laboratorios de biotecnología del Instituto de
Desarrollo e Investigación en Biotecnología (IDIB) de la Universidad Nacional del Centro del
Perú y de Química Bioorgánica del Centro de Investigación de Bioquímica y Nutrición
(CIBN) de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos, con el objetivo de evaluar el
contenido proteico de 50 variedades promisorias de olluco así como la variabilidad proteica y
complejidad bioquímica. El contenido proteico de olluco liofilizado fue determinado en forma
indirecta por el método de semimicro Kjeldahl,
encontrándose un contenido alto de
proteínas que están en un rango de 10,07 a 11,55 g /100g, de contenido medio de
proteínas siendo el rango 7,00 a 9,98 g /100 g y de bajo contenido de proteínas siendo el
rango de 5,60 a 6,65 g /100 g. También se ha caracterizado las proteínas de las
variedades promisorias de olluco mediante la técnica de electroforesis no denaturante en
gel de poliacrilamida (ND - PAGE) y de electroforesis con SDS en gel de poliacrilamida
(SDS - PAGE), encontrándose variabilidad proteica por presentar dos grupos de bandas
proteicas uno de 14 - 24 kD y el otro de 24 – 60 kD.
Palabras clave gel de poliacrilamida, variabilidad proteica
ABSTRACT
The present research was carried out in the laboratories of Biotechnology of the
Institute of Development and Investigation in Biotechnology (IDIB) of the National
University of the Center of the Peru and of Bioorganic chemistry of the Investigation
Center of Biochemistry and Nutrition (CIBN) of the National University of San
Marcos, with the objective to evaluate the protein content of 50 promissory varieties
of olluco as well as the protein variability and biochemical complexity. The protein
content of liofilized olluco was determined in indirect form by the semimicro Kjeldahl
method, by finding a high content of proteins in a range from 10,07 to 11,55 g /100g,
a half content of proteins in a range from 7,00 to 9,98 g /100 g and a low content of
proteins in a range from 5,60 to 6,65 g /100 g. It has also been characterized the
proteins of the promissory varieties of olluco by means of the technique of
electrophoresis non denaturant in polyacrylamide gel (ND - PAGE) and of
electrophoresis with SDS in polyacrylamide gel (SDS - PAGE), finding protein
variability because it is presented two groups of bands proteins one of 14 - 24 kD
and the other of 24-60 kD.
Key words polyacrylamide gel, protein variability
____________________________________________________________________
*Profesor Asociado a T.C. – Departamento de Cultivos y Fitomejoramiento, Facultad de
Agronomía – Universidad Nacional del Centro del Perú.
INTRODUCCIÓN
El olluco (Ullucus tuberosus Caldas) en
el Perú es el segundo tubérculo en
importancia luego de la papa. Es parte de
la alimentación de la población peruana
de todas las clases sociales.
Existen estudios realizados por diferentes
investigadores que enfocan los aspectos
nutricionales. Estos estudios muestran
que el olluco tiene un aporte nutricional
de energía 62 kcal/ 100 y un contenido de
ácido ascórbico de 15, 40 mg/100g y que
además representa una buena variante
nutricional por su contenido de proteínas
reportándose como valor máximo un total
de 15,7% sobre la base de peso seco
(Pietila y Tapia 1991).
Se han realizado estudios sobre la
caracterización
morfológica
de
las
accesiones pertenecientes al Banco de
Germoplasma de olluco del Instituto
Nacional de Investigación Agraria (INIA),
Programa Nacional de Investigación de
Recursos Genéticos y Biotecnología
(PRONIRGEB), Estación Experimental
Santa Ana – Huancayo. Utilizando los
descriptores morfológicos propuestos por
Arbizu
(1994),
modificados
por
INIA – PRONIRGEB (1985), logrando
identificar 343 morfotipos, encontrándose
además que el 14% de las entradas serian
posibles duplicados.
Diferentes
métodos
de
análisis
electroforético han sido ensayados como
electroforesis en gradiente de porosidad
(poroPAGE) usando una gradiente de
poliacrilamida entre 12 a 25%
y
encontraron en el olluco dos grupos
principales de bandas entre 6,5 – 12 kD y
entre 25 – 58 kD. En electroforesis
discontinua con SDS (SDS – disc –
PAGE) y electroforesis en gradiente de
porosidad con SDS (SDS – poro PAGE)
revelaron para el olluco 21 bandas para
muestras no reducidas y 25 bandas para
muestras reducidas (Akbar y col., 1993).
MATERIALES Y MÉTODOS
Se utilizaron 50 variedades promisorias de
olluco, procedentes del Banco de
Germoplasma del Instituto Nacional de
Investigación Agraria (INIA), Programa
Nacional de Investigación de Recursos
Genéticos y Biotecnología (PRONIRGEB),
Estación Experimental Santa Ana –
Huancayo.
Determinación de nitrógeno total mediante el
método de semi micro Kjeldahl
Para la digestión se pesó 0,5 g de
muestra liofilizada de cada variedad de
olluco, se colocaron en balones y se
agrego 2 g de mezcla de sales y 4 mL de
ácido sulfúrico concentrado, se calentó a
460 °C durante 2 horas. Las muestras
digeridas fueron diluidas con 15 mL de
agua destilada y luego se procedió a la
destilación en un equipo de destilación
semi micro Kjeldahl, el sulfato de amonio
presente en la muestra digerida, es
atacada con 15 mL de hidróxido de sodio
al 50%, liberando el amoniaco que es
recepcionado en 10 mL de ácido bórico al
2% con indicador rojo de metilo
enmascarado. La titulación se realizó en
una bureta de vidrio de 100 mL utilizando
como titulante ácido clorhídrico valorado al
0,1 normal. Para la determinación del
contenido de proteína de olluco se usó el
factor 6,25, para convertir el nitrógeno
total en proteína cruda.
Electroforesis en geles de poliacrilamida
denaturante (SDS - PAGE)
Para obtener las proteínas totales de
olluco, los tubérculos se congelaron
a – 20 °C durante 24 horas, se pesaron y
descongelaron. Para la obtención de
extractos se utilizó una extractora de
jugos, así mismo para evitar la oxidación
se adicionó una solución antioxidante
compuesta de sulfito de sodio al 20% y
bisulfito de sodio al 15% de concentración
final. El extracto se centrifugó a 3 000 rpm
durante 10 minutos con la finalidad de
remover el almidón y demás restos y el
sobrenadante se guardó en refrigeración a
una temperatura de –20 °C hasta el
momento de ser usado. Para hacer uso
del
extracto
para
los
análisis
electroforéticos se procedió de la siguiente
manera. Se tomó 1 mL de extracto de
olluco y se precipitó con 4 volúmenes de
minutos. Se enfrió con agua, luego se
agregó 5 l de amidoblack. Las muestras
fueron aplicadas en un gel de
poliacrilamida al 12% (SDS – PAGE). La
electrofóresis se realizó en una cámara
electroforética de tipo vertical durante 6
horas, para lo cual se usó una corriente
constante de 10 a 40 miliamperios. Una
vez terminada la corrida electroforética los
geles fueron teñidos durante toda la noche
con
una
solución
colorante
de
coommassie blue R – 250 al 1 % en 40
mL de ácido acético, 12 mL de ácido
tricloroacético 10%, 40 mL de metanol y
160 mL de agua destilada. Posteriormente
fueron decoloradas con una solución de
10 mL de ácido acético y 60 mL de
metanol y 140 mL de agua destilada. Se
usaron estándares de proteína (SIGMA)
de pesos moleculares (PM) que van de 14
200 a 66 000 daltons.
Electroforesis en geles de poliacrilamida no
denaturante (ND– PAGE)
Las proteínas totales de olluco fueron
tratadas con una solución de sucrosa al
60% para dar densidad y amidoblack al
0,003 % como indicador de corrida. Se
utilizó el sistema discontinuo, con geles de
separación de concentración 12 % a pH 8,8
y el gel de stacking o concentrador a una
concentración de 5% a pH
6,8. La
electrofóresis, la coloración y decoloración
de los geles se siguió el mismo
procedimiento descrito para los geles
denaturantes.
RESULTADOS
DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO PROTEICO
Cuadro 1. Contenido proteico de 50
variedades promisorias de olluco
Variedades
HNCO-062
SA-323
HNCO-072
HNCO-98
HNCO-010
AYA-26-A
SA-343
AYA-24
HNCO-059
SA-339
HNCO-083
HNCO-058
SA-264
HNCO-040
AYA-04
HNCO-085
AYA-01
SA-110-B
HNCO-038
SA-177
SA-179
HNCO-09
HNCO-087
SA-136
AYA-17
g/100g
Peso seco
11,55
11,32
11,20
10,85
10,85
10,68
10,68
10,33
10,33
10,07
9,98
9,80
9,80
9,80
9,45
9,45
9,45
9,45
9,10
8,75
8,75
8,75
8,75
8,40
8,40
Variedades
HNCO-076
HNCO-080
AYA-060
HNCO-011
HNCO-016
SA-051
HNCO-28
SA-12-A
SA-262
SA-138
SA-207
SA-342
HNCO-55
HNCO.018
HNCO-045
SA-353
HNCO-067
HNCO-017
HNCO-019
HNCO-061
SA-110
HNCO-88
SA-350
SA-060
SA-042
g/100g
Peso seco
8,40
8,40
8,40
8,05
8,05
7,70
7,70
7,70
7,70
7,70
7,35
7,05
7,00
7,00
7,00
7,00
6,65
6,65
6,65
6,30
6,30
6,30
5,95
5,95
5,60
En el cuadro 1
se observa que, el
contenido de proteína en las 50
variedades
promisorias
de
olluco
liofilizado varía entre 11,55 g/ 100g como
valor máximo y 5,60 g /100g como valor
mínimo. En la figura 1 se observa que del
total de variedades, el 20% tienen alto
contenido de proteínas, el 62% tienen un
contenido medio de proteínas y el 18%
tienen un bajo contenido de proteínas
Fig. 1. Rangos de contenido de
proteínas de olluco (Ullucus tuberosus)
35
62%
Número de variedades
acetona fría, luego se centrifugó a 3 000
rpm por 5 minutos se descartó el
sobrenadante y el sedimento fue
resuspendido por buffer de muestra/agua
(1:1), según el sistema discontinuo
descritos por Laemili (1960) que contiene
Tris – HCl pH 6,8, 0,5M, SDS 10%,
glicerol 20% y 2 – mercaptoetanol 10%, y
se llevó a un volumen final de 250 l, se
homogenizó bien y luego se centrifugó a
12 000 rpm, durante 5 minutos, luego se
calentó la muestra en baño maría por 3
30
Bajo
25
Medio
20
Alto
15
10
20%
18%
5
0
5,60-6,65
7,00-9,98
% de proteínas
10,07-11,55
ANÁLISIS ELECTROFORÉTICO
Fig.2. Gel de poliacrilamida denaturante
con sodio dodecil sulfato (SDS – PAGE) al
12%, de proteína total extraída de 9
variedades promisorias de olluco
Fig. 4. Gel de poliacrilamida no
denaturante (ND-PAGE) al 12%, de
proteína nativa total extraída de 10
variedades promisorias de olluco
66,000
45,000
36,000
29 000
24 000
20,100
14,200
DISCUSIÓN
En la figura 2, el análisis electroforético de
las proteínas de olluco, muestran un grupo
de proteínas con pesos moleculares de
24 a 60 kD aproximadamente. Y otro
grupo de proteínas, cuyo peso molecular
está en el rango de 14 a 24 kD. Las
proteínas menos abundantes son las de
peso molecular que probablemente
estaría en el rango de 5 kD a 10 kD. Se
observa una gran variedad de pesos
moleculares entre proteínas.
Fig.3. Gel de poliacrilamida no denaturante
(ND-PAGE) al 12%, de proteína nativa total
extraída de 10 variedades promisorias de
olluco
Los tubérculos andinos como la oca,
olluco y la mashua representan una buena
variante nutricional por su contenido en
proteínas. Collazos y col., (1975) reportan
que, el contenido proteínico en base
húmeda es muy similar en estas especies
de 1.0 a 1,5%; pero hay una considerable
variación nutricional especialmente en el
contenido de proteínas cuando la muestra
es deshidratada; así el porcentaje de
proteína en las 50 variedades promisorias
analizadas fluctúa entre 11,55 % como
valor máximo y 5,60 % como valor mínimo
(cuadro 1), en estudios realizados por
Pietila y Tapia (1991) reportan que, el
porcentaje de proteína sobre la base de
peso seco está entre 15,7 % como valor
máximo y 5,1 % como valor mínimo. Así
mismo Samanez (1974) reporta que, los
porcentajes de proteína de 20 clones de
olluco están en rangos de 5,1 a 8,35 %.
Estos resultados al ser comparados con
los obtenidos en el presente trabajo se
observan que existen diferencias en el
porcentaje de proteínas sobre la base de
peso seco, las causas de estas
diferencias, probablemente se debe a
factores externos como fotoperiodo, riego,
los niveles de nitrógeno disponibles para
la planta, que podría haber afectado
marcadamente en la concentración
relativa de las proteínas de los tubérculos,
pero se puede
sugerir que en esta
especie existe una apreciable variación
genética con respecto al contenido
proteico
del
tubérculo,
debido
probablemente al carácter genético que
gobierna a cada variedad. Se podría
también atribuir que posiblemente se
produjo alteraciones de las regiones
regulatorias de genes de proteínas de
reserva que provocaron sus niveles de
expresión.
en el gen que la codifican. Las 15
variedades restantes presentan bandas
diferentes, esto me hace suponer que las
variantes alélicas en un locus dado
codifican para proteínas similares en
estructura, pero que difieren en alguna
parte de la secuencia de sus aminoácidos,
lo cual probablemente se traduce en
cambios en la movilidad electroforética de
las proteínas. Lo que me hace pensar
que existe variabilidad genética entre
estas accesiones.
La caracterización bioquímica de las
proteínas totales de olluco mediante
electrofóresis denaturante (SDS – PAGE)
Figura 2, demuestran que las proteínas
están divididos en dos grupos principales
de bandas proteicas uno de 14 - 24 kD y
el otro de 24 – 60 kD aproximadamente,
esta alta variabilidad proteica
hace
pensar que las proteínas presentes en el
olluco son bioquímicamente complejas.
Similares resultados fueron reportados por
Espinoza (1998) para proteínas de
mashua a pesar de ser una especie
genéticamente
diferente,
presentan
también dos grupos de bandas uno
formado por proteínas con
pesos
moleculares de 24 a 70 kD y el otro por
proteínas medianamente abundantes, con
pesos moleculares en el rango de 14 a 23
kD. Por otro lado resultados semejantes
fueron reportados por
Akbar y col.,
(1993) en Poro PAGE, detectándose que
las proteínas del olluco están divididos en
dos grupos principales uno entre 8 – 12
kD y el otro entre 25 - 58 kD, lo que
confirma la complejidad de las proteínas
del olluco.
REFERENCIAS
Así mismo, mediante electroforesis no
denaturante
(ND – PAGE) (Figuras 3
y 4), se observa dos grupos de posibles
duplicados formados por las variedades
HNCO-040, SA-177 y un segundo grupo
formado por las variedades HNCO-55,
HNCO-061 y HNCO-088 por presentar
bandas similares, es decir las proteínas
tienen la misma movilidad electroforética,
esto podría deberse a que no hay
variaciones en la secuencia de los
aminoácidos de la proteína, lo que
implicaría que no hay variaciones alélicas
1. PIETILA
y
TAPIA.
Investigación Sobre el
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