Resumen: El centro de investigación y Desarrollo de nuestro Departamento, el año en curso, ha logrado difundir nuestro quehacer científico en los siguientes eventos. 1.- XII Congreso Chileno de Medicina Veterinaria. Realizado en Chillán del 24 al 26 de Octubre. Med vet Claudia Lopez presentó el trabajo: EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD BIOLÓGICA DEL VENENO DE LA ARAÑA DE LOS RINCONES (Loxosceles laeta) PARA LA PRODUCCIÓN DE UN ANTIDOTO NACIONAL. Lopez Claudia; Martinez Jocelinne, Vasquez Abel, Gonzalez Pamela , Gonzalez Patricia. Consultas [email protected] Estandarización y validación de un ELISA (Enzime Linked Immunoadsorbent Assay) para la determinación de niveles séricos de anticuerpos antitetánicos. INTRODUCCIÓN El tétanos es producido por Clostridium tetani, un bacilo Gram positivo, anaerobio estricto con capacidad de formar esporas que permanecen viables en el medio ambiente durante largos periodos de tiempo. Este microorganismo, de amplia distribución geográfica, es eliminado en heces de hombre y animales; al contaminar una herida y darse la condición de anaerobiosis puede revertir a la forma vegetativa, liberando la exotoxina tetanoespasmina, responsable del cuadro clínico. Esta toxina neurotrópica, impide la liberación de neurotransmisores inhibidores a nivel de Sistema nervioso central, especialmente Glicina y GABA, lo que lleva a convulsiones y parálisis espástica. A nivel periférico, interfiere en la liberación de acetilcolina en el músculo, lo que se traduce en contracciones tónicas y espamos musculares (1). El tétanos es una enfermedad de baja morbilidad y alta mortalidad. La incidencia mundial es de un millón de casos anuales, siendo una de las 10 causas de muerte mas frecuentes en países en vías de desarrollo (2), no así en países desarrollados, donde gracias a la aplicación de programas de vacunación se ha logrado una tasa de incidencia que fluctua entre 0,03 a 0,04 casos por 100.000 habitantes (3). En Chile, el tétanos es una enfermedad de bajo riesgo con casos esporádicos, manteniendo cifras promedio de 14 casos anuales. En 1997 la tasa de incidencia fue de 0,05 y la tasa de mortalidad de 0,02 por cien mil habitantes (4) La prevención de la enfermedad se logra a través de la vacuna: Toxoide Tetánico, obtenido por inactivación de la toxina tetánica con formaldehído (5). En Chile, esta vacuna se introdujo en 1975 como método de control del Tétanos, alcanzando hacia 1998 coberturas sobre el 90% en la tercera dosis (4). La eficacia de la vacuna es de casi 100% luego de la tercera dosis, sin embargo el título disminuye en el transcurso del tiempo, por lo que se sugiere dar un refuerzo cada 10 años, considerando 0,01 UI/mL el título protector mínimo de anticuerpos antitétanos (6). La cuantificación de anticuerpos antitetánicos en la población, es una necesidad creciente en el sistema de salud, tanto para verificar protección post vacunación contra tétanos como en el apoyo diagnóstico de inmunodeficiencia primaria en niños (ref). Existen variados métodos serológicos para la titulación de anticuerpos antitétanos, sin embargo los mas utilizados son la hemoaglutinación pasiva y ELISA(referencias). Existen kits comerciales para la determinación y cuantificación de anticuerpos antitétanos en sueros humanos, los que no están disponibles para estudios epidemiológicos a gran escala, por el alto costo que significa su adquisición. La estandarización y validación de un ELISA, con antígeno local (toxoide tetánico del Instituo de Salud Pública de Chile), abre la posibilidad de disponer de una metodología rápida, en el momento oportuno. Asi mismo, realizar estudios epidemiológicos a gran escala que se pueden enfocar en diversos grupos etarios, adquiriendo de esta manera información local de la población vacunada y la protección real de la población chilena al tétanos. MATERIAL Y MÉTODOS Antígeno Como fuente antigénica para el ELISA se utilizó Toxoide tetánico producido en el I.S.P (lote 049.00-01). El toxoide tetánico fue obtenido de la toxina de Clostridium tetani, por detoxificación 2 con formaldehído, diálisis y concentración, y proceso de purificación mediante corte con Sulfato de amonio y diálisis posterior (1). Anticuerpos antitoxoide tetanico Patrón primario: Inmunoglobulina antitetánica humana NIBSC (National Institute for a Biological Standards and Control), tercera preparación estándar internacional (NIBSC.UK.EN6 3QG). El liofilizado de cada ampolla tiene un total de 120 Unidades Internacionales (UI) de Inmunoglobulina antitetánica humana (2). Patrón secundario de referencia Suero obtenido de un adulto normal, vacunado con vacuna DT (Difteria-tétanos); con alto título de anticuerpos antitetánicos (según kit comercial ELISA). El suero fue estabilizado por congelación y descongelación en 3 días consecutivos. Luego se centrifugó y se adicionó PMSF (Phenyl Methyl Sulfonyl Fluoryde) como inhibidor de proteasa y mertiolato, ambos reactivos en concentración final al 1%. El suero tratado fue almacenado a -20°C hasta ser utilizado. Se utilizó una dilución de trabajo de 1 UI/mL en buffer fosfato salino (PBS) 0.01 M/suero equino 2% (v/v) (REF). Títulación de anticuerpos El título de anticuerpos antitetánicos del patrón secundario de referencia, fue obtenido mediante técnica de ELISA, utilizando el Kit Comercial Virotech® (datos del fabricante). Curva de Calibración Tanto el patrón primario NIBSC, como el Patrón Secundario de Referencia se llevaron a una solución de trabajo de 1 UI/mL. Se realizaron dos escalas de calibración , con cada punto en duplicado, obteniéndose 4 absorbancias para cada uno de los seis puntos: (50 mUI/mL, 20 mUI/mL, 10 mUI/mL, 5 mUI/mL, 2 mUI/mL y 1 mUI/mL) Concentración de Proteína 3 La concentración de proteína del toxoide tetánico (lote 0-49.00-01) se determinó mediante Método Bradford (4). Muestras problema Se utilizaron dos muestras de suero de individuos normales (GH y MR), sin referencia del título de anticuerpos antitétanos. ELISA (Enzimoinmunoensayo) Se utilizaron placas de ELISA de poliestireno (Nunc F16 467466, superficie Maxisorp, (faltan datos del fabricante) activadas con 100 l de una solución de 80 g/ml de toxoide tetánico (en PBS 0.01 M, pH 7.2) durante 60 minutos a 37°C y después toda la noche a 4°C. La placa fue lavada una vez con PBS 0.01 M pH 7.2. La placa se bloqueó con 300 l/pocillo de leche descremada al 1% en PBS 0.01 M pH 7.2 durante 60 minutos a temperatura ambiente, luego de lo cual fue lavada con PBS 0.01 M pH 7.2 Posteriormente, la placa fue incubada con 100 l/pocillo de las diferentes muestras de suero durante 60 minutos a 37°C. La dilución de las muestras de suero problema utilizadas fue de 1:100 en PBS 0.01 M pH 7.2. La curva de calibración con los anticuerpos antitoxoide tetanico se realizó con 6 puntos en duplicado (50, 20, 10, 5, 2, y 1 UI/ml). Al término de la incubación, la placa fue lavada 6 veces con PBS 0.01 M pH 7.2. Luego se incubó 60 minutos a 37°C con el segundo anticuerpo, una anti IgG conjugada con fosfatasa alcalina (Sigma A-3152) diluída 1/800 en PBS 0.01 M/suero equino 2%. Después de lavar con PBS 0.01 M pH 7.2, se agregó 100 l/pocillo de paranitrofenilfosfato (1 mg/mL en buffer Carbonato/bicarbonato pH 9.6, 0.05 M) durante 30 minutos en oscuridad, a temperatura ambiente. La reacción colorimétrica fue detenida agregando 50 l/pocillo de NaOH 3M. La absorbancia fue determinada a 405 nm en un lector ELISA (Marca del equipo) (6), restando el valor de absorbancia del blanco (3). El valor de absorbancia fue transformado a UI/mL, en base a la curva de calibración de Patrón secundario de referencia, utilizando el software Statgraphics. Análisis estadístico El análisis estadístico se realizó en el software estadístico Statgraphics 5.0. Se evaluaron los parámetros Linealidad, Precisión, Exacitud y Límite de detección (5). 4 Linealidad Tanto el patrón primario como el patrón secundario fueron evaluados mediante coeficiente de correlación (r2), coeficiente de determinación (r) y análisis ANOVA al 99% de nivel de confianza. Precisión Se analizaron dos muestras problema (GH y MR) en días diferentes (2, 3 y 5). A estas muestras se les aplicó un análisis ANOVA de una vía, además se hizo el análisis de una variable de las absorbancias obtenidas de una serie de repeticiones del patrón secundario sobre la curva de patrón primario NIBSC y viceversa. Exactitud Para el cálculo de exactitud se utilizó el Test de t de Student. Para predecir el valor de X (patrón primario), se consideraron 10 valores de absorbancia del patrón primario (Y) sobre una curva de patrón Secundario, al 95% del nivel de confianza. Límite de detección El límite de detección se calculó en base al promedio de 32 valores blancos más 3 desviaciones estándar (L.D.= Promedio bl. + 3D.S.) (9, 10). RESULTADOS Y DISCUSIÓN El Patrón Secundario de referencia se tituló frente al Patrón primario Internacional NIBSC, resultando un valor de 4.6 UI/mL. Tanto el patrón primario de referencia, como el patrón secundario mostraron linealidad apropiada con un coeficiente de correlación (r2) de 0.9887 y 0.9874; y coeficiente de determinación ( r ) de 97.75% y 97.49%, respectivamente. El valor de P en el análisis de varianza es menor que 0,01, lo que demuestra una relación estadisticamente significativa entre absorbancia y concentración al 99% del nivel de confianza. El valor de P-para Falta de ajuste en la tabla ANOVA es mayor o igual a 0.10, lo que determina que el modelo seleccionado para el estudio de los datos en ambos casos, es adecuado. Curva de calibración Patrón primario Concentraci Absorbanc Absorbanc Absorbanc Absorbanc ón ia ia ia ia 5 (mUI/mL) 50 20 10 5 2 1 1 0.835 0.515 0.338 0.159 0.066 0.040 2 0.882 0.540 0.357 0.149 0.061 0.043 3 0.701 0.426 0.296 0.154 0.065 0.024 4 0.778 0.449 0.252 0.150 0.048 0.030 Patrón Primario (modelo raíz cuadrada de X) a b s o r b a n c i a 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 10 20 30 40 50 concentración Curva de calibración Patrón secundario Concentraci Absorbanc Absorbanc Absorbanc Absorbanc ón ia ia ia ia (mUI/mL) 1 2 3 4 50 0.897 0.916 0.702 0.700 20 0.554 0.580 0.448 0.461 10 0.373 0.385 0.289 0.294 5 0.162 0.165 0.139 0.159 2 0.061 0.051 0.051 0.059 1 0.034 0.034 0.026 0.029 6 Patrón Secundario (modelo Doble recíproco) a b s o r b a n c i a 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 10 20 30 40 50 concentración Las muestras GH y MR tienen un valor P en el análisis de varianza mayor o igual a 0.05, por cuanto no hay diferencias significativas de las medias entre un día y otro, al 95.0% del nivel de confianza. Así mismo se demuestra que los grupos son homogéneos, es decir no hay diferencias estadísticamente significativas entre valores de un mismo día. El coeficiente de variación de las muestras GH y MR fue de 13.286% y 11.79%, respectivamente. Tanto para Patrón Primario y Secundario de referencia se calculó la presición en base a el coeficiente de variación, el que resultó 1.85% y 8,1% respectivamente. Ambas muestras presentaron distribución normal de los datos. La exactitud del método es tolerable, según el Método T de Student, , ya que el valor del Patrón Primario obtenido, no es significativamente diferente de 60. El límite de detección fue de 0.049 de densidad óptica y niveles de antitoxina de 0,0015UI/mL. Según los resultados obtenidos en la medición de los parámetros: linealidad, presición, exactitud y límite de detección, se concluye que el Método ELISA para la determinación de anticuerpos antitétanos en sueros humanoses capaz de discriminar entre diferentes títulos de anticuerpos antitetánicos con la prtesición adecuada; la técnica puede ser utilizada en el apoyo diagnóstico de inmunodeficiencia primaria en niños, medición de título para verificar protección post vacunación contra tétanos y en estudios epidemiológicos a gran escala, destinados a conocer la protección de diferentes grupos etarios contra tétanos. REFERENCIAS 7 1. Martinez B., E. (FIR II), Pellicer J., M.A. (FIR I). Terapéutica en cuidados intensivos.pag: 819-824. Barcelona. 2. Worldwide Vaccines. Epidemiología Difteria, Tétanos, Tos Ferina. (www.worldwidevaccines.com/public/diseas/dtp10_sp.asp). 3. Vacunas contra Tétanos y Difteria.(www.mpsp.org/Boletines/Boletin2/tedif.htm). 4. Departamento de Epidemiología, MINSAL. Situación del Tétanos y Tétanos neonatal en Chile 1987-Primer Semestre 1998.(www.epi.minsal.cl/enf_trans/archivos/tetanos.htm). 5. Protocolo de Tétanos y Tétanos Neonatal. Consejería de Bienestar Social Dirección General de Salud Pública y Consumo. Instituto Nacional de Salud. (www.juntaex.es/consejerias/syc/dgspc/spub/ProtocoloEDO/Tetanos.pdf ) 6. (www.aventispasteur.com.ar/vademecum/hexavac.asp) 7. NIBSC. Instruccions for use: The 1st International Standard for TETANUS IMMUNOGLOBULIN, HUMAN Code:TE-3. Version 3, 1998. 8. VIROTECH®. Tetanus ELISA for detection of IgG antitoxin antibodies against Tetanus in human serum. 9. Chaloner-Larsson G, Anderson R, Egan A. A WHO guide to good manufacturing practice (GMP) requirements. Part 2: Validation. Validation of analytical assays. WHO Geneva; 1997. p.65-95. 10. Broughton PMG, Bergonzi C, Lindstedt G, Loeber IG, Malan PG, Mathieu M, et al. Guidelines for a user laboratory to evaluate and select a kit for its own use. Part 1. Quantitative tests. European Comittee for Clinical Laboratory Standard 1986; 3:3. Referencia hemoaglutinaciön pasiva http://193.146.50.130/bes/bes9816.pdf) 1.- Ministerio de Salud Pública de Chile. Manual de Procedimientos Toxoide Tetánico. Primera Edición, 1983. 8 2.3.- 4.-REFERENCIA BRADFORD 5.-Asociación Española de Farmacéuticos de la Industria. Validación de Métodos analíticos.} 6.-REFERENCIA ELISA 7.9.-Circular No4F/14. Actualiza vigilancia epidemiológica del tétanos. Departamento de Epidemiología. División programa de Salud. Ministerio de Salud. República de Chile. 1996. 10.- Med Vet Patricia Gonzalez presentó el trabajo. DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE ANTICUERPOS ANTITÉTANOS EN SUEROS EQUINOS MEDIANTE ELISA. Gonzalez Patricia, Hernandez Gastón, Rivero Bárbara., Rojas H., Lopez Claudia, Vasquez Abel. Consultas [email protected] RESUMEN DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE ANTICUERPOS ANTITÉTANOS EN SUEROS EQUINOS MEDIANTE ELISA (Quantification and detection of tetanus antibodies in horse serum by ELISA method).1Gonzalez, P., 2Hernández, G., 1Riveros, B., 3Rojas, H., 4López C., 1Vasquez, A. 1Centro de Investigación y Desarrollo. 2Subdepartamento de Vacunas y antitoxina. 4 Bioterios. Departamento de Producción,. Instituto de Salud Pública de Chile. 3 Facultad de Medicina Veterinaria. U de Concepción. Email: [email protected] El tétanos es una enfermedad aguda inducida por la toxina de Clostridium tetani, siendo la única enfermedad en su género prevenible por vacunación, debido a que no se transmite entre individuos, ya que penetra en el organismo a través de una herida. En la actualidad no existe un programa de inmunización en equinos, como tampoco un método de evaluación de niveles de anticuerpos antitetánicos. Por otra parte, los equinos son utilizados en algunas regiones del mundo para la producción de antitoxina tetánica de uso humano. P ara evaluar la respuesta inmune inducida en estos equinos o determinar los niveles protectivos en animales inmunizados con toxoide tetánico, existe una prueba biológica in vivo, la cual es de alto costo por el número de animales de laboratorio empleados, toma varios días y no permite analizar un gran número de muestras. Por este motivo, se hizo necesario desarrollar una metodología sencilla, rápida y que permita analizar una gran cantidad Introducción: de muestras en un corto periodo de tiempo. El desarrollo de esta metodología permite evaluar el estado inmunológico de un plantel equino para analizar la necesidad y tiempo de vacunación, de la misma forma puede ser de gran utilidad a los productores de antitoxina tetánica de origen equino a la hora de determinar el momento de realizar una sangría con fines productivos. Objetivo: Cuantificar anticuerpos antitétanos en sueros equinos. Método: Se utilizaron placas de ELISA sensibilizadas con toxoide tetánico como antígeno de captura. En cada placa se realizo una curva de calibración (2, 5, 10, 20, 50, 100 y 150 mUI/ml) con suero antitetánico equino de referencia (ISP). Las determinacion de la concentración de anticuerpos en estudio se interpolaron de la curva estándar. Resultados: El método ELISA utilizado permite discriminar entre sueros equinos con títulos de 9 anticuerpos altos y bajos. y ha permitido evaluar la respuesta en el tiempo de equinos inmunizados antitetánica ISP. con vacuna 2.- Congreso latinoamericano de Microbiologia e Higiene de los Alimentos. realizado en Santiago del 10 al 14 de Noviembre. BQ Viviana Cachicas presentó los trabajos: DISEÑO Y EVALUACIÓN ESTADÍSTICA DE SUSPENSIONES BACTERIANAS CUANTITATIVAS PARA CUMPLIR REQUISITOS DE CONTROL DE CALIDAD. Silva Susy; Mena Gladys; Muñoz fabiola; Morales lorena; Zazopulos M(1). Cachicas Viviana. (1) UFSM. Consultas [email protected] EVALUACIÓN DE ESTERILIDAD COMERCIAL POSTERIOR A UN TRATAMIENTO TÉRMICO DE FÓRMULAS LÁCTEAS EN TRES UNIDADES DE SEDILES DE HOSPITALES DE SANTIAGO DE CHILE. Cachicas Viviana; Mena Gladys; Muñoz fabiola; Borges Verónica. Consultas [email protected] EVALUACIÓN DE KIT PARA DETERINACIÓN DE Cyclospora cayetanensis EN FRAMBUESAS. Cachicas Viviana, Uribe P. (1)., Espejo R(2). (1). (2).INTA Univerisidad de Chile. Consultas [email protected] 3.- XXIV Congreso Chileno de Microbiología a realizarse en 4 a 6 Diciembre en Punta de Tralca: BQ Abel Vasquez presenta los trabajos CLONAMIENTO, EXPRESION Y PURIFICACION DEL GEN DE LA NUCLEOPROTEINA DEL VIRUS RESPIRATORIO SINCICIAL. Vásquez Abel(1),Manzur M(2), Riveros Barbara (1), González Patricia (1), Maldonado E (3), Avendaño LF (2), Fernández JA(2). (1)Centro de Investigación y Desarrollo, Departamento de Producción, Instituto de Salud Pública. Programas de (3)Biología Celular y Molecular y (2) Virología, ICBM, Facultad de Medicina Universidad de Chile. [email protected] Consultas [email protected] CLONAMIENTO, EXPRESION Y PURIFICACION DEL GEN DE LA NUCLEOPROTEINA DEL VIRUS RESPIRATORIO SINCICIAL. (Cloning, expression and purification of nucleoprotein gene from respiratory syncytial virus) Vásquez A(1),Manzur M(2), Rivero B (1), González P (1), Maldonado E (3), Avendaño LF (2), Fernández JA(2). (1)Centro de Investigación y Desarrollo, Departamento de Producción, Instituto de Salud Pública. Programas de (3)Biología Celular y Molecular y (2)Virología, ICBM, Facultad de Medicina Universidad de Chile. <[email protected]> Introducción: El VRS es el principal agente causal de bronconeumonia en lactantes menores de 2 años. El análisis de la respuesta inmune contra antígenos definidos del virus es fundamental para estudios epidemiológicos y de inmunoprofilaxis contra esta infección viral. El VRS posee 2 antígenos inmunodominantes en su envoltura (glicoproteínas GyF). Sin embargo, la variabilidad antigénica de estas proteínas puede ser un obstáculo en el análisis de la respuesta inmune contra el VRS. El gen N es el más conservado entre todos los aislados virales de VRS descritos y estudios recientes indican que la proteína que codifica este gen es reconocida por anticuerpos y linfocitos T de sujetos inmunes contra el VRS Objetivo: Clonar, expresar y purificar la 10 proteína del gen codificante de la nucleoproteína (N) del VRS, grupo A Mon3/88, cepa prototipo de aislados VRS del Cono Sur. Métodos: Se diseñaron partidores complementarios a los extremos 5' y 3' del gen N del VRS A2 (GenBank). Se obtuvo el cDNA por RT-PCR utilizando como templado RNA de células Hep-2 infectadas con VRS A Mon3/88. El cDNA fue clonado en el vector PUC19 y analizado en secuenciador automático. El gen N fue posteriormente subclonado en el vector de expresión pET15b y transformado en E.coli BL21. La proteína expresada fue purificada en columna Ni-NTA y analizada por SDS-PAGE y Western Blot Resultados. El secuenciamiento parcial del gen ( 60% extremo 5') revela un 97% de homología con el gen N de cepas VRS obtenidas en otras zonas geográficas. La proteína fue expresada después de 2 horas de inducción a 30°C en presencia de ITPG. El análisis mediante SDS-PAGE mostró una banda de 45 Kda aprox. La proteína fue soluble bajo las condiciones utilizadas en la expresión y purificada utilizando los residuos de histidina ubicados en el extremo N-terminal de la proteína. Sueros de sujetos hiperinmunes para el VRS reaccionan con la proteína recombinante en Western-Blot. Conclusiones: El análisis de secuenciación indica que el gen clonado corresponde al gen N del VRS. La purificada posee propiedades bioquímicas e inmunológicas concordantes con la proteína previamente descrita. Esta proteína será utilizada en estudios de respuesta inmune (celular) contra el VRS. El uso de la nucleoproteína N en estos estudios podría respresentar una ventaja sobre las glicoproteínas G y F, en las cuales la extensa varianción antigénica representa una limitante para la detección de respuesta inmune contra el VRS. 11 IDENTIFICACION DEL EXPOSITOR Abel Eduardo Vásquez Veloso Centro de Investigación y Desarrollo, Departamento de Producción, Instituto de Salud Pública de Chile. Av. Marathon 1000, Ñuñoa. Santiago. tel: 3507516 [email protected] Modalidad: Panel AMPLIFICACION Y CLONAMIENTO DEL GEN psa A DE S. pneumoniae EN E. coli. Velasquez Francisco (1) , Torres Jeannette(1), Riveros Barbara(1)., Maldonado Aurora(2), Seoane M(2), Quiroga Clarita(1), Sein Jorge(1), Vásquez Abel(1). (1)Centro de Investigación y Desarrollo, Departamento de Producción. (2)Sección Bacteriología, Departamento de Laboratorios de Salud. Instituto de Salud Pública de Chile. Vasquez Abel [email protected] BQ Viviana Cachicas presenta publicación en Anales de Sociedad de Microbiología : ANALISIS COMPARATIVO DE AISLADOS CLÍNICOS Y CEPAS DE VACUNAS DE Bordetella pertussis MEDIANTE AMPLIFICACIÓN ALEATORIA DE FRAGMENTOS DE DNA (RAPD). Viviana Cachicas(1, Abel Vasquez(1, Cecilia Carmona(2, Soledad Prat(2, Ivan Calderón(3 (1Perez. (3 ). (1)Centro de Investigación y Desarrollo, Departamento de Producción. (2)Sección Bacteriología, Departamento de Laboratorios de Salud. Instituto de Salud Pública de Chile. (3) , Estudiante Bioquímica USACH. 4.- Taller de Normativa Sediles por SESMA BQ Viviana Cachicas presenta trabajo de difusión CERTIFICACIÓN DE CICLO DE ESTERILIZACIÓN DE FÓRMULAS LÁCTEAS Consultas: [email protected] [email protected] 12