Estudio QSAR de compuestos de coordinación de - DePa

7.
ESTUDIO QSAR DE COMPUESTOS DE COORDINACIÓN DE COBRE DEL
TIPO [Cu(N-N)(GLICINA)]NO3.
Juan Carlos García Ramos
Tutora: Dra. Lena Ruiz Azuara
Departamento de Química Inorgánica y Nuclear
1. Introducción.
El cáncer es la segunda causa de muerte en México según los últimos informes de la Secretaría de
Salud. Para combatir este mal se emplean principalmente la quimioterapia, la radioterapia, la
cirugía y más recientemente la inmunoterapia, la terapia hormonal, la hipertermia han hecho sus
aportaciones, sin embargo, la quimioterapia sigue siendo un recurso indispensable de tratamiento.
Es por esa razón que diversos grupos de investigación se han dado a la tarea de encontrar
compuestos
que
cumplan con los
requerimientos
necesarios para
funcionar como
quimioterapéuticos tal como hasta el momento lo ha realizado el cis-platino y sus derivados, pero
disminuyendo en lo posible los efectos secundarios producidos por estos (náusea, vómito,
ototoxicidad, neuropatías y principalmente nefrotoxicidad)1, así como el costo de producción que
tienen.
Considerando estos requerimientos un grupo de investigadores de la FQ-UNAM desarrolló una
serie de compuestos de coordinación con cobre, eligiendo este metal debido a que resultaba más
familiar al organismo con lo cual se esperaba una disminución en la toxicidad, la facilidad para
estabilizar diferentes estados redox hace factible participación en ciclos catalíticos y una ventaja
adicional, con un precio mucho menor que el de los otros metales empleados con este propósito,
a esta familia de compuestos se les registró con el nombre de CASIOPEINAS® 2.
En los diversos estudios realizados con estos compuestos se ha mostrado que presentan actividad
citotóxica, citostática y antineoplásica3,4, por esta razón es de gran importancia el obtener toda la
1
S. Fricker. Metal Compounds in Cancer Therapy, 1a Ed., Chapman-Hall, Londres, 1994.
Dirección General de Invenciones, Marcas y Desarrollo Tecnológico (SECOFI) Registros Número 18801-120579
y 18802-120580. U.S.A. Patent Number 5-107,005. (1992), U.S. Patent Re35, 458, Feb. 18. (1996).
3 I. Gracia-Mora, L.Ruiz-Ramírez, et al. Journal of Inorganic Biochemistry; an Interdisciplinary Journal. Vol 43,
Elsevier, Oxford, (1991).
2
41
información posible de estos sistemas para poder establecer las propiedades físicas y químicas
responsables de la actividad de estos compuestos y poder de esta manera elaborar correlaciones
estructura-actividad que permitan el mejoramiento de las características de estos compuestos para
la función que desempeñaran. El presente trabajo muestra una comparación entre la actividad
mostrada por los compuestos representada por los índices CI50 y los potenciales de media onda
determinados, empleando la voltamperometría cíclica.
2. Condiciones experimentales.
Se realizó la prueba de inhibición de la proliferación celular en células de cáncer cervico-uterino
(HeLa) . A partir de un cultivo Stock a confluencia obtenido del pase correspondiente para cada
línea celular, se prepara una dilución celular de 104 células/ml del cual se agregará un volumen de
20 μL a cada pozo de la microplaca. En los pozos donde se colocan las células ya debe haber 100
μL de medio adicionado con suero fetal bovino (SFB). En seguida se incuban a 37 °C y 5% de
CO2 por 24 horas para que se recuperen de la tripsinización. Al término de las 24 horas se aspira
el medio y se adicionan 90 μL con SFB y 10 μL de cada una de las concentraciones de los
compuestos que se agregan inmediatamente después de la preparación de la disolución para evitar
la descomposición, en este caso las concentraciones empleadas fueron 1, 10, 100 y 300 μg/ mL y
se incuban por 24 horas. Después se aspira el medio y se fijan las células con 200 μL de ácido
tricloroacético al 10% durante una hora a 4 °C. Se lavan 5 veces con agua y se dejan secar a
temperatura ambiente. Una vez secas las placas se procede a la tinción, se adicionan 100 μL de
una disolución de sulforrodamina-B al 0.4 % a cada uno de los pozos con células y se dejan
incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después se lavan 4 veces con ácido acético
al 1 %, cuidando aspirar el ácido en cada lavado. Se dejan secar a temperatura ambiente. Una vez
secas, el colorante que ha sido incorporado por las células se solubiliza con 100 μL de tris-base
10 mM (pH 10.5) durante 5 minutos y con agitación suave. Finalmente el colorante celular se lee
en un lector de microplacas a 564 nm.
El estudio electroquímico se realizó con un potenciostato-galvanostato EG & G PARC modelo
263-A, empleando un arreglo convencional de tres electrodos, un electrodo de trabajo un disco de
4
L Ruiz-Ramírez., M. E. de la Rosa., I Gracia., A. Mendoza., G . Pérez., G. Ferrer-Suerta, M. Breña, P.Gutiérrez,
E. Pimentel y M. Cruces, J. of Inorganic Biochemistry, 59 (2-3), (1995) ,206.
42
carbón vítreo (0.071 cm2), un alambre de platino como contra electrodo y plata/nitrato de plata
0.1 M como electrodo de seudo referencia. Se emplearon disoluciones de KNO3 0.1 M y bis-trispropano como amortiguador de pH (7.0 - 7.4), como electrolito soporte. El volumen fue de 5 mL
con una proporción de disolventes agua-etanol 60-40 %, esto se logró mezclando 2.5 mL de
electrolito soporte, 0.5 mL de solución amortiguadora y 2 mL de etanol. Esta disolución se
burbujea con nitrógeno por veinte minutos y posteriormente se adiciona la masa correspondiente
de cada compuesto para tener una concentración final de 1 mM.
3. Resultados y discusión.
En este trabajo se emplearon cinco compuestos que tienen una formula general
[Cu(N-
N)(glicina)]NO3, cuya estructura general y relación de sustituyentes se muestra en la Figura 1.
Compuesto
Sustituyente
JC01
4,7-difenil
JC02
4,7-dimetil
Cu<II>
JC03
5,6-dimetil
O
JC05
3,4,7,8-tetrametil
JC06
H
+
6
5
7
4
8
3
9
N
H2N
N
2
NO3 -
O
Figura 1. Estructura general de los compuestos empleados y la relación de sustituyentes.
3.1 Actividad biológica.
Hay que tener en cuenta que este resultado no nos dice el mecanismo por el cual se está
llevando a cabo la inhibición, ya que este experimento no está diseñado para ello, sólo nos indica
las concentraciones a las cuales se presenta. Ya que partimos con 106 células , sólo determinamos
las concentraciones al final del experimento y hacemos las evaluaciones con respecto al control
negativo sin seguir el crecimiento de la línea con respecto al tiempo, asumimos pues, que el
crecimiento es el mismo o muy parecido ya que las condiciones de crecimiento son las mismas.
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Compuesto
JC01
JC02
JC03
JC05
JC06
Sustituyente
4,7-df
4,7-dm
5,6-dm
3,4,7,8-tm
H
CI50 (mM)
3.42x10-4
1.22x10-4
4.32x10-5
3.66x10-5
9.79x10-5
pKa
1.85
1.76
1.71
1.78
1.8
Control
Cis-platino
4.26x10-4
---
Tabla 1. Resultados de actividad de inhibición de la proliferación celular comparado con cis-platino
De estos valores podemos observar que todos los compuestos probados están por debajo del valor
de CI50 mostrado por el cis-platino, en uno de ellos, el [Cu (3,43,7,8-tetrametil-1,10fenantrolina)(glicina)]NO3 éste valor es hasta 12 veces menor que el que presenta el cis-platino,
esto da un panorama muy alentador acerca de la actividad inhibitoria de crecimiento celular que
presentan estos compuestos en esta línea tumoral.
3.2 Estudio electroquímico.
En la figura 2 se presentan los voltamperogramas típicos a 0.1 V/s para el compuesto
JC05 ([Cu(3,4,7,8-tetrametil-1,10-fenantrolina)(glicina)]NO3) obtenidos en dirección anódica y el
estudio de variación de potenciales. En el barrido de potencial que se realizó en dirección
anódica, se observa un proceso de oxidación irreversible a un potencial de pico anódico de
Epa=0.705 V (IIa). Cuando se alcanza el potencial de inversión anódico E+ y el barrido de
potencial es ahora en sentido negativo, se observan dos señales de reducción a potenciales de
pico catódico de Epc= 0.347 V (Ic) y en Epc= 0.657 V (IIc). Cuando se alcanza el potencial de
inversión catódico E y el barrido de potencial es de nuevo en sentido positivo, se observa un
solo proceso de oxidación en Epa= –0.229 V (Ia). Cuando se inicia el barrido de potencial en
sentido negativo (dirección catódica) se observan el mismo número de señales a valores de
potencial iguales. En el estudio de inversión de potenciales para conocer la dependencia de las
señales pudimos observar que al hacer el barrido en valores cercanos a -0.5V se identificaba un
proceso cuasireversible monoelectrónico con una diferencia de potenciales de pico Ep= 95 mV.
Este proceso es el que empleamos para determinar el potencial de media onda que se empleara en
las correlaciones de acuerdo a la formula E1/2=(Epa+Epc)/2.
El proceso que nos interesa es aquel en el que se ven involucrados Ic y Ia .Tomando en
cuenta esta consideración se realizó el análisis de los voltamperogramas obtenidos para los
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compuestos JC01, JC02, JC03 y JC06. A continuación se presenta el resumen de los resultados
obtenidos en la tabla 2.
JC01
JC02
JC03
JC05
JC06
IIc
-0.559 -0.616 -0.588 -0.657 -0.552
Ia
-0.210 -0.254 -0.228 -0.229 -0.209
Ic
-0.255 -0.343 -0.312 -0.348 -0.290
E1/2 -0.242 -0.299 -0.283 -0.285 -0.262
Tabla 2. Valores de potenciales de pico de los compuestos estudiados.
60
60
N
E+
N
Cu<II>
Ia
Ia
H2N
30
30
O
IIa
I / A
I / A
IIa
O
0
0
Ic
Ic
-30
-30
IIc
-1.0
-0.5
0.0
0.5
+
E / V | Fc -Fc
1.0
E-
-1,0
IIc
-0,5
0,0
0,5
1,0
+
E / V | Fc -Fc
Figura 2.- Estudio de voltamperometría cíclica en dirección anódica de JC05 1mM en una mezcla agua etanol (60
40 %) en presencia de KNO3 0.1 M, v=0.1 V/s, electrodo de carbón vítreo de 0.071 cm 2 de área(izquierda) y estudio
de variación de potencial en las mismas condiciones experimentales (derecha).
3.3 Correlaciones.
El interés principal de nuestro trabajo es encontrar un parámetro fisicoquímico que pueda
proporcionar información sobre la posible actividad biológica que presentan estos compuestos.
El primer antecedente para la correlación de los parámetros electrónicos de los
compuestos de Cu, fueron los valores de pKa de las correspondiente fenantrolinas coordinadas,
en su forma libre, sin embargo, en este caso solamente estábamos tomando la distribución
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electrónica de una parte de la molécula y no del compuesto en su totalidad (Figura 3 a), por lo
cual se piensa en el E1/2 como el descriptor electrónico de la molécula. Con la información
obtenida en el estudio electroquímico, se construyó la gráfica de E1/2 vs log[1/CI50] (figura 3b).
En la figura se observó que los compuestos JC01, JC03, JC05 y JC06 presentan un
comportamiento lineal con el E1/2. El compuesto JC02 se aleja mucho del comportamiento
observado. Dado que la estabilidad relativa expresada en los valores de E1/2, esta diferencia es
difícil de explicar con este parámetro. Sin embargo el resultado de la comparación de los cuatro
compuestos restantes presentó una mejor correlación que la observada en la Figura 3a.
2.6
JC05
JC05
JC03
2,5
2.4
JC03
JC06
2,0
log(1/CI50)
log (1/CI50)
2.2
JC02
2.0
JC02
1.8
1.6
JC01
1,5
1.4
5,0
JC06
5,5
6,0
6,5
pKa
7,0
JC01
-0.48 -0.49 -0.50 -0.51 -0.52 -0.53 -0.54 -0.55 -0.56
E1/2 (V)
Figura 3. Correlación entre a) pKa vs actividad biológica y b)E ½ vs actividad biológica.
Los datos que surgen de la correlación encontrada favorece un acercamiento para la
predicción de la actividad biológica de este tipo de compuestos. Simultáneamente el
comportamiento de JC02 obliga a la reflexión sobre el mecanismo de acción del compuesto en la
célula, el cual puede involucrar un proceso redox. Esta reflexión se hace con base en el valor de
E1/2 para JC02, que resultó el más negativo de los cinco compuestos empleados ya que los efectos
de los sustituyentes en las fenantrolinas sobre el valor de E1/2 no es apreciable. Si la actividad
biológica de las Casiopeínas® esta relacionada con un intervalo de potenciales redox presentes en
la célula, es necesario el diseño de estrategias experimentales complementarias para aclarar cual
es la influencia de este parámetro en las actividades presentadas por los compuestos.
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4. Conclusiones
El estudio de inhibición de la proliferación celular para estos compuestos muestra que tienen una
mayor actividad que el cis-platino en la línea celular HeLa.
El estudio electroquímico permitió identificar las señales Ia y Ic que forman parte de un sistema
cuasi reversible monoelectrónico cuyos valores de E1/2 muestran en general una correspondencia
con la actividad biológica.
Las diferencias en los valores de E1/2 para cada uno de los compuestos permiten establecer que
no hay diferencias significativas debidas a la posición y tipo de sustituyentes en las fenantrolinas
coordinadas al cobre.
El comportamiento que presentan los compuestos al correlacionar los valores de E1/2 con las
actividades biológicas presenta una alternativa para la descripción de la potencialidad de
actividad biológica de las Casiopeínas®.
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