Introducción Martes, 28 de septiembre de 2004 Introducción Microbiología es la ciencia que estudia los microorganismos. Es difícil definir qué es un microorganismo. La definición intuitiva es de un microorganismo que no se puede ver en el ojo humano, es decir de tamaño menor que 0.1 mm. Pero hay organismos minúsculos que no son microorganismos, como los ácaros y sus parecidos, por tanto esta ciencia se define por sus métodos de trabajo más que por tamaño. Los organismos estudiados son las bacterias, los virus, los hongos, las algas y los protozoos. También se estudian agentes no convencionales, como los priones. Los métodos de trabajo de la microbiología: Aislamiento del microorganismo estudiado Cultivo axénico – cultivo de una especie única. Esterilización del medio para asegurar el estudio de una especie. Historia de la microbiología AV Leeuwenhoek era el primer en construir un instrumento que permite ver los microorganismos – el microscopio. También describió unos ejemplos de microorganismos. Redi demostró que no existe la generación espontánea (la idea que vida sale del material no vivo) en un experimento de moscas y carne. En el experimento se veía que las moscas solo pueden reproducirse cuando tienen acceso a la carne, para depositar allí sus huevos. Cuando no podían llegar a la carne, no aparecieron moscas. Pasteur descubrió la fermentación y demostró que la causan los microorganismos. También desarrollo la pasterización, calentamiento del alimento (como leche) para eliminar patógenos. Tyndall descubrió las formas termo-resistentes, que sobreviven el proceso de pasterización. Microorganismos y enfermedades Fracastoro, un científico italiano del siglo XVI, pensaba que organismos invisibles provocan algunas enfermedades. Bossi, otro científico italiano del siglo XVIII, relacionó la enfermedad del gusano de seda con un hongo que le ataca. Lister introdujo la idea de cirugía antiséptica utilizando fenol para eliminar microorganismos patógenos. R. Koch relacionó enfermedades con bacterias. La bacteria Bacilus anthracis con la enfermedad ántrax carbunclo (de vacas). Desarrolló los métodos clásicos de la investigación microbiológica (aislamiento, cultivo axénico), las herramientas (placas de Petri) y productos utilizados (agar- 1 Introducción Jueves,30 de septiembre de 2004 agar). Los postulados de Koch son muy importantes en los estudios de microbiología. Postulado 1. El microorganismo patógeno sospechoso debe estar presente en todos los casos de la enfermedad y ausente en el animal sano. Postulado 2. El microorganismo sospechoso debe cultivarse en cultivo axénico (puro). Postulado 3. Las ululas de un cultivo axénico del microorganismo aislado deben causar la enfermedad en animales sanos. Postulado 4. El microorganismo debe ser reaislado y ser idéntico al microorganismo original. Pasteur desarrolló las vacunas. Demostró científicamente que la reducción patógena puede evitar la enfermedad. Desarrollo vacunas contra la cólera de los pollos (1879), el carbunclo (1881) y la rabia (1885). En una vacuna, el agente infeccioso de baja patogenidad estimula el sistema defensivo y ayuda enfrentar la enfermedad cuando el individuo está expuesto de nuevo al mismo agente patógeno. Procariotas y eucariotas Los microorganismos se encuentran en diferentes niveles de organización: Unicelular (bacterias, hongos) Multicelular (bacterias, hongos) Cenocítica (hongos, algas) Procariotas. Células que se caracterizan por carencia de núcleo y otros orgánulos. Eucariotas. Células que se caracterizan por su material genético envuelto de envoltura nuclear doble. También contienen orgánulos celulares, como mitocondrias, aparato de golgi y retículo endoplasmático. Clasificación de microorganismos Haeckel (1866) o Diferenciación celular elevada Vegetal Animal o Diferenciación celular baja – protistas (algas, protozoos, bacterias, hongos) Clasificación de los cinco reinos (Whittaker, 1969) Clasificación Woese (1974). Comparación del segmento 16S del rRNA, se estudia este segmento porque es muy conservado y casi cualquiera 2 Procariotas y eucariotas Martes, 5 de octubre de 2004 mutación en él produce una célula no viable, ya que no puede sintetizar proteínas. Clasificación de tres dominios: o Bacteria o Archea o Eucaria Otros postulados: o Dos imperios (Mayr) Eucariotas Procariotas Eubacterias Archaebacteria o Tres dominios con transferencia lateral de genes (Doolittle). Comparación a nivel genética demuestra transmisión de genes entre grupos. o Anillo de la vida. En la reexaminación del genoma entero se observa que antes de la formación del eucariota había fusión de los dos tipos de procariotas: eucariota y archaebacteria. Bacterias Clasificación en función de la presencia o ausencia de pared celular. En la presencia de pared celular, de que tipo es. Presencia de pared celular (clasificación según la reacción a un tipo de pared celular). o Gram positivo o Gram negativo Pared celular ausente – micoplasmas Archaea o archaebacteria. Aunque su nombre indica diferentemente, las archaebacterias son más evolucionadas en realidad que las eubacterias. La composición de su pared y membrana celular es completamente distinta de la eubacteriana. Viven en ambientes extremos: son termófilas extremas (temperatura mínima de 82º, temperatura optima de 105º), algunas son acidófilas, metanógenas y halófilas. 3 Procariotas y eucariotas Martes, 5 de octubre de 2004 Virus Los virus necesitan células vivas para reproducirse. Utilizan la maquinaria sintetizadora de la ulula para formar nuevas copias. Los virus constan de materia genética en forma de RNA o DNA y una cápsula proteica. Agentes subvirales Viroides Solo asociados a patologías vegetales. Formados por material genético en forma de ssRNA (cadena simple) que contiene entre 246 y 375 bases nitrogenadas. Carecen de cápsula y envoltura – son realmente RNA libre, por tanto son muy frágiles. Pasan directamente de una progenitora a sus descendientes. Satélites de RNA circulares Patógenos de plantas. En los animales se ha descubierto sólo uno, relacionado con la hepatitis: agente de la hepatitis Δ, que coopera con el virus helper HBV. Para poder multiplicarse necesita la ayuda de otro virus, que tiene la suficiente información genética para poder multiplicarse (virus helper). Consta de una molécula de ssRNA de aproximadamente 1,700 bases. Priones Son los agentes causales de enfermedades como Scrapie, BSE, Kuru y CJD. Son proteínas que son capaces de modificar la conformación de otras proteínas muy parecidas, cambiando su grado de hidrosolubilidad, que como consecuencia produce agregados en el tejido. Microscopia DEF. Resolución de un microscopio óptico (d): 1. Diámetro del objeto más pequeño que se ve 2. Distancia mínima a la que tiene que estar separados dos puntos para poderlos apreciar como distintas. d 0.612 n sin λ – Longitud de onda α – mitad del ángulo formado por el cono de luz al penetrar el objeto n – índice de reflexión d ojo – 0.1-0.2 mm d microscopio óptico – 0.2 µm d microscopio electrónico 0.1-0.2 nm (en muestras biológicas el límite es 2 nm) 4 Microscopia Jueves, 7 de octubre de 2004 Lupa binocular – permita ver células vivas como no hace falta fijar las muestras, por tanto se utiliza en fecundación en Vitro y en botánica (células gruesas) Microscopio óptico Para conservar muestras, hay que fijar la muestra, tantas muestras de tejido sólido como de suspensión celular. Tipos de microscopios ópticos: Microscopios de campo claro Microscopio óptico convencional (d = 0.2 µm). Aumenta por 1000-1200. Hay que teñir la muestra o que ella misma sea colorada para verla. No se puede ver células vivas en este microscopio. Microscopio óptico de contraste de fases. Aumenta por 400. Este microscopio transforma el retraso en la onda de luz que ha pasado a través de partes de la célula a cambios en la longitud de onda, que se ven como cambios de color. Este microscopio es útil para ver células que es importante mantenerlas vivas. Microscopio óptico contraste inferencial Nomarski. Aumenta por 400. Se ven células sin teñirlas, por tanto se puede mantenerlas vivas. Este tipo de microscopio se caracteriza por producir una imagen tridimensional con la textura de la célula. Por tanto, es útil en experimentos de transgenia y fecundación en Vitro. Microscopio invertido. Tiene los mismos elementos del microscopio óptico convencional, pero ordenados de otra forma – el ocular es la parte inferior del microscopio. Microscopios de campo oscuro Solo la luz que atraviesa el objeto llega al ocular (se basa en el efecto Tyndall). Permite mayor resolución. Microscopio de fluorescencia. Este microscopio es útil para ver células que no hace falta mantenerlas vivas (el proceso las mata). El microscopio se basa en dos elementos: 1. Lámpara de mercurio – emite radiación UV. 2. Fluorocromos – moléculas que se caracterizan por que emiten radiación visible al ser agitadas por radiación UV. La ventaja de este tipo de microscopio óptico es la información que nos provee: Identificación de proteínas: para detectar una proteína específica dentro de la célula, se usan anticuerpos especiales marcados con fluorocromos. Después, se lava la célula y sólo quedan teñidas las proteínas unidas a los anticuerpos. 5 Microscopia Jueves, 7 de octubre de 2004 Identificación de ADN: para detectar un segmento específico de ADN, se usan segmentos complementarios a esta secuencia de ADN marcados con fluorocromos. Después, se lava la célula y se quedan sólo las secuencias marcadas con los fluorocromos. Microscopio confocal Cuando hay en células grandes fluorocromos, no se puede distinguirlos en las diferentes profundidades – hay demasiados fluorocromos para obtener buena resolución. El microscopio confocal dirige luz en foco a las diferentes profundidades y así toma diferentes imágenes de las diferentes profundidades de la célula, en buena resolución. Microscopio electrónico En cualquier tipo microscopio electrónico, hay que fijar la célula, por tanto no se puede ver la célula y mantenerla viva. Microscopio electrónico de transmisión. Para poder ver el imagen bien, hace falta que 50-90% de los electrones pasen a través de la muestra. La imagen se forma así: en la pantalla de visualización, donde no llega ningún electrón, hay un punto oscuro, y donde llega un electrón un punto claro. Los átomos con Nº atómico más alto no dejan pasar a los electrones mientras que los átomos con Nº atómico más bajo si que los dejan pasar. Como en una muestra biológica los átomos tienen Nº atómico muy cercano uno al otro, resulta que el contrasto no es muy bueno. Para mejorar el contrasto, se añade a la muestra sales de metales, como el osmio, que se adhiere bien a los lípidos. En este tipo de microscopio también se puede detectar proteínas específicas usando anticuerpos que están marcadas con elementos densos. Esta técnica se llama Immunogold. Microscopio electrónico de rastreo (scanning). En este tipo de microscopio se ven los electrones que se reflejen de la muestra y se ve la superficie de la muestra. No se puede cortar tallas, sino la imagen es plana. Para que el reflejo de la muestra sea más fácil, se puede cubrir la muestra en metales pesados. Este tipo de microscopio no tiene buena resolución. Para obtener buena resolución y mantener la sensación tridimensional, se usa el microscopio electrónico de transmisión y criofractura. Criofractura: se congelan las muestras en N2 líquido a -196º, y luego se rompen las muestras. Se produce una fractura, que en general separa las dos capas de la membrana celular. Luego, la muestra está cubierta en platina, en ángulo no directo (no toda la superficie esta cubierto por la platina). Después, la muestra está cubierta en carbono, en ángulo directo (cubre todo el superficie). Por ultimo, se lava la muestra en un solvente fuerte que disuelva toda la materia orgánica. 6 Microscopia Jueves, 7 de octubre de 2004 Las partes del molde hechos de platina no dejan pasar a los electrones, y se ven áreas oscuros, mientras las áreas donde hay solo carbono dejan pasar a los electrones y se ven áreas claras. Observación de microorganismos Observación de microorganismo en fresco Los microorganismos se observan libres de cualquiera manipulación. Este método se utiliza cuando se quiere ver si los microorganismos son móviles y viables. Se ha de utilizar microorganismos en cultivos líquidos y jóvenes. Es difícil observar los microorganismos en este método ya que hay poco contraste y cuesta enfocar el microscopio. Técnicas En porta excavado (Koch) Entre porta y cubreobjetos normales Tinciones Se utilizan para aumentar el contraste, por el uso de colorante. Antes de teñir la muestra, hace falta extender los microorganismos (disminuir el numero de microorganismos por unidad de superficie) para poder distinguirlos mejor. También hay que fijar los microorganismos a la porta. La fijación se hace mediante la coagulación del protoplasma, por deshidratación (al aire libre o con calor). Colorantes Los colorantes son compuestos orgánicos que tienden a unirse a determinadas zonas del microorganismo. Hay tres grupos de colorantes: Catiónicos o básicos. Tienden a unirse a cargas negativas. ejemplos: violeta de genciana, safronina. Aniónicos o ácidos. Tienden a unirse a cargas positivas. Ejemplos: eosina, fucsina. Liposolubles. Tiñen lípidos. Muchas veces se usan mordientes para facilitar la tinción. Los mordientes facilitan la penetración del colorante a la célula. Ejemplo: lugol. 7 Observación de microorganismos Jueves, 14 de octubre de 2004 Tipos de tinciones El tipo de tinción depende de la finalidad de la observación. Tinción simple Sirve para aumentar el contraste. Se utiliza un solo colorante, normalmente catiónico. Por este tipo de tinción se observan el tamaño de los microorganismos, su forma y su disposición. Tinción diferencial Diferencian las células por propiedades tintoriales. También permiten observación de tamaño, forma y disposición. Se usan más de dos colorantes (catiónicos), mordiente y descolorante. Tinción de Gram Diferencia dos grupos grandes entre las bacterias: Gram positivos y Gram negativos. Técnica: Extensión y fijación 1º colorante – violeta de Genciana Cubrir con lugol (mordiente) Decolorar con alcohol-acetona. Punto critico! 2º colorante – safronina (colorante de contraste) Variabilidad bacteriana frente la tinción de Gram Las bacterias Gram negativos son muy constantes, pero los positivos no lo son tanto, especialmente los cultivos viejos, que pierden la facultad de retención de color. Aparte, las endosporas no se tiñen bien. Teoría de la composición de la pared celular Las bacterias Gram positivos tienen una pared celular de capa gruesa de peptidoglicanos con pocos muy pequeños. Una vez ha penetrado el colorante, no sale fácilmente y la disolución de alcohol-acetona cierra los poros aun más y dificulta la salida del colorante de la célula. Las bacterias Gram negativas tienen la pared celular más delgada con menos enlaces peptídico entre los peptidoglicanos y poros de diámetro mayor. Aparte, tienen una capa lipidica que es eliminada por la disolución alcohol-acetona. La disolución alcohol-acetona elimina el colorante inicial y el colorante de contraste se ve claramente. Tinción AAR (Ácido-Alcohol Resistente) Permite diferenciar especies de géneros incluidos en la división actinobacteria en dos grupos: AAR+ y AAR-. 8 Observación de microorganismos Jueves, 14 de octubre de 2004 Tinción de estructuras Permite la diferenciación de estructuras especiales, como flagelos, esporas y cápsula. Tinción de flagelos Se basa en la precipitación del colorante alrededor del flagelo. Se utiliza mordiente y un cultivo muy joven, ya que el flagelo es una estructura muy delicada que se destruye muy fácilmente. Esta tinción no se hace en las practicas de microbiología I, ya que es muy difícil de ejecutar y de ver en microscopio óptico (el diámetro del flagelo es menor que la resolución del microscopio óptico). Tinción de esporas La tinción de esporas se basa en la composición química de la espora, que es parecida a la de composición de la pared celular de células AAR+. La técnica utilizada es similar a la tinción de AAR (dos colorantes). Se tiñen cultivos viejos, que tienen más esporas. Se observan la presencia de esporas, su forma y disposición y si provocan alteraciones en la forma de la célula vegetativa. Tinción de cápsula Unos microorganismos producen acumulo de sustancias a su alrededor que funciona como otra capa protectora. Hay dos métodos de teñir la cápsula: indirectamente (teñir el fondo para ver la célula rodeada por la cápsula) y directamente (teñir la capsula, no se ve tan bien). Nutrición bacteriana Los nutrientes se dividen en dos grupos: esenciales y útiles. 80-90% agua. Es el nutriente principal. H, O, C, N, P, S. forman los 95% del peso seco de la célula. K, Mg, Ca, Fe. Macronutrientes – necesarios para el crecimiento. Mn, Co, Cu, Mo, Zn. Micronutrientes. Necesarios pero en menores cantidades. Los macronutrientes y los micronutrientes en conjunto forman los 5% del peso seco de la célula. La célula normalmente consigue H, C y O a partir del mismo compuesto. La célula consigue su P a partir de fosfato inorgánico (fosfato sódico, fosfato potásico). Los microorganismos se distinguen por su fuente de C: Autótrofos. El dióxido de carbono es su fuente única de carbono. Heterótrofos. Utilizan compuestos orgánicos como fuente de carbono. Hay gran diversidad entre estos microorganismos. 9 Nutrición bacteriana Martes, 19 de octubre de 2004 Nitrógeno y azufre Los organismos obtienen N y S a partir de compuestos inorgánicos: nitratos, sulfatos y sales sulfuradas, o a partir de compuestos orgánicos: aminoácidos o peptonas. Hay bacterias que fijan el nitrógeno atmosférico. Estas bacterias son muy importantes para la agricultura, y no suelen ser patógenas. Factores orgánicos de crecimiento Hay diferentes tipos de factores de crecimiento: Aminoácidos. Síntesis de proteínas Purinas y pirimidinas. Vitaminas. Bacterias del rumen necesitan unos determinados ácidos grasos para crecer. Auxótrofos. Necesitan un factor de crecimiento. Protótrofos. No necesitan ningún factor de crecimiento. Oxigeno El oxigeno tiene papel importante en el metabolismo de los microorganismos, que se clasifican según su necesidad del elemento: Aerobios. Necesitan oxigeno. Ejemplo: pseudomonas. Anaerobios estrictos. No necesitan oxigeno. Lo contrario – el oxigeno los mata. Ejemplo: clostridium. Anaerobios facultativos. Pueden preformar tanto metabolismo aerobio como anaerobio. Ejemplo: escherichia coli. Anaerobios aerotolerantes. No necesitan oxigeno y nunca lo utilizan, pero no es toxico para ellos. Ejemplo: lactobacillus. Microaerobios. Necesitan oxigeno pero en una concentración baja, de 2-10%. Ejemplo: campylobacter. Fuente de carbono, de energía y de electrones Fuente de carbono Fuente de energía Fuente de electrones Autótrofos – CO2 Fotórofos – luz Litótrofos – inorgánicos Compuestos Heterótrofos - com- Quimiótrofos - compuestos Organótrofos - compuestos puestos orgánicos inorgánicos y orgánicos orgánicos 10 Cultivos de los microorganismos Jueves, 21 de octubre de 2004 Cultivos de los microorganismos Los microorganismos son muy pequeños – se hacen estudios de sus poblaciones – se hacen crecer en unas condiciones definitivas. Hay diferentes tipos de cultivo: cultivo puro o axénico y cultivo mixto. Hay dos tipos de operaciones: Aislamiento. Separar uno de los microorganismos de una población mixta. Cultivo. Nutrientes y condiciones adecuadas. Factores que influyen el cultivo de microorganismos 1. Factores físicos. a. Temperatura b. Radiación 2. Factores químicos a. Nutrientes b. Antimicrobianos c. pH d. Agua e. CO2 y oxigeno Temperatura La actividad de las reacciones químicas es proporcional a la temperatura, es decir, a mayor temperatura hay mayor crecimiento, pero si sube mucho la temperatura, se puede destruir toda la población. Temperaturas cardinales: temperatura mínima y máxima. Temperatura optima – la que produce crecimiento máximo. La temperatura óptima siempre está más cerca a la temperatura máxima que a la mínima. Clasificación de microorganismos según la temperatura: Psicrófilas. Crecen en temperaturas bajas. -10-20º. Mesófilas. Son los más importantes: los patógenos. Temperaturas entre 20-45º (37º). Termófilas. Viven en temperaturas mayores que 45º. Hipertermófilas. Viven en temperaturas entre 90-110º. pH Cada microorganismo tiene pH mínimo, óptimo y máximo. 11 Cultivos de los microorganismos Jueves, 21 de octubre de 2004 Clasificación de microorganismos por el pH: Acidófilos. pH entre 1-5.5. Neutrófilos. pH entre 5.5-8. la mayoría de los microorganismos. Alcalófilos. pH entre 8.5-11. Bacterias: 6.5-7.5 Hongos: 4-6 (son más acidófilos) El crecimiento modifica el pH del medio; para amortiguar estos cambios se suele utilizar soluciones buffer. Presión osmótica (salinidad) Clasificación de los microorganismos por presión osmótica: Osmófilos (osmotolerantes). Crecen en concentraciones elevadas de azúcar. Halófilos. Necesitan sal (cloruro sódico) o Moderados. 1-2% a 15% Microorganismos marinos – 3-3.5% o Halófilos extremos Halotolerantes. Pueden crecer en concentraciones elevadas de sal pero no lo necesitan. Medios de cultivo Los medios de cultivo se pueden distinguir según diferentes criterios: Según su composición: o Definitivos o sintéticos. Contienen composición y concentraciones definidas. o Indefinidos o complejos. Contienen algún componente que no se conoce su composición (como extracto de carne). Son muy utilizados como medio de cultivo. Según su consistencia (contenido de agar, que no es nutritivo): o Líquidos o Sólidos (1.5-2% de agar) o Semisólidos (0.5-1% de agar) o Blandos (0.05-0.1% de agar) Según su composición y aplicación: o Generales. Permiten el crecimiento de muchos organismos no exigentes. o Enriquecidos. 12 Cultivos de los microorganismos Jueves, 21 de octubre de 2004 o De enriquecimiento. Contienen algún componente que favorece el crecimiento de un microorganismo que esta en baja proporción en un cultivo mixto. o Selectivos. Permiten el crecimiento de pocos microorganismos. Por ejemplo, celulosa como única fuente de carbono permite sólo el crecimiento de microorganismos que se nutren de celulosa. o Diferenciales. Distinguen visualmente diferentes microorganismos. Muchos medios de cultivo son selectivos y diferenciales a la vez. Aislamiento de microorganismos Cada microorganismo se considera como un UFC – unidad formadora de colonias. Técnica de aislamiento 1. Tinción de Gram de una muestra. da información sobre la diversidad de microorganismos en la muestra. 2. Siembra en estría. Objetivo – separar las colonias. 3. Incubación a 37º durante 24-48 horas. 4. Observar colonias. ¿Cuáles son diferentes? 5. De cada colonia diferente, hacer una tinción de Gram. utilizar solo ½ de la colonia, para tener el resto para seguir estudiando el microorganismo. 6. Cultivar en tubo la mitad restante (tantos tubos como colonias). 7. Incubar a 37º durante 24-48 horas. 8. Comprobar cultivo axénico (tinción Gram) 9. Identificación. 13 Aislamiento de los microorganismos Jueves, 21 de octubre de 2004 Incubación Anaerobios facultativos y aerobios se incuban en una estufa normal, a 37º. Normalmente crecen mejor en estufas con 5% de CO2. Anaerobios estrictos Anaerobios estrictos han de incubarse en medios libres de oxigeno. Hay unos métodos de conseguir incubación libre de oxigeno: Cubrir el tubo con agar y vaselina. Introducir una sustancia reductora al medio de cultivo (elimina el oxigeno disminuyendo el potencial Red-Ox del medio). Eliminar el oxigeno. Estufas a anaerobiosis o jarras especiales. Microaerobios Incubación con vela – la vela elimina la mayoría del oxigeno pero deja lo suficiente para satisfacer las necesidades de los microaerobios. Jarras GASPAK y otros con sobres especializados para eliminar parcialmente el oxigeno del medio. Conservación de los microorganismos Subcultivos. Se utilizan tubos de tapones atornillados. Se guardan en refrigeración (4º) hasta 2-4 meses; sin embargo, muchos organismos pueden aguantar sólo 10-14 días. Congelación. Los microorganismos se congelan (-70º) dentro de una sustancia crioprotectora (glicerol) y se conservan durante años. No todos los microorganismos pueden aguantar este método de conservación. Liofilización. Congelación y deshidratación por sublimación (calentar al vacío). Produce ‘polvo’ de microorganismos. Para recuperar los microorganismos, hay que rehidratarlos proveyendo nutrientes específicos. Nitrógeno liquido Colección de cultivo tipo Sirve de referencia en estudios e investigación. Se obtiene el microorganismo idéntico en todos los estudios que se hacen de una especie concreta. Muchos países tienen cultivos tipo con acceso libre para investigadores. En las investigaciones se conoce la especie, la colección y el depósito del cual se ha extraído el microorganismo. Morfología de los microorganismos 14 Aislamiento de los microorganismos Martes, 26 de octubre de 2004 La morfología bacteriana es muy diversa. Las dimensiones varían entre 0.2-2 µm de amplitud y 2-8µm de longitud. La forma de las bacterias es muy variada: Muchas bacterias tienen forma regular, pero algunas son pleomorfas: en función de la edad del cultivo, del medio etc. se cambia la forma del microorganismo. Algunas bacterias tienen prosteca, que es una prolongación de la pared y membrana celular. Puede haber una prosteca única, o unas prolongaciones (forma estrellada). Las prostecas son características de las bacterias acuáticas. Se supone que se utilizan para aumentar la superficie para absorber más nutriente y también se cree que retrasa la sedimentación. Algunas bacterias son filamentosas, es decir, forman colonias pluricelulares con una estructura bien definida de filamento. Algunas colonias de bacterias se parecen a las colonias de hongos: esta tipo de bacterias se conoce como actinomiceto. Las colonias son peludas y recuerdan a las colonias de hongos de aspecto macroscópico. La formación de colonias depende de la forma de dividirse. En los cocos: si se quedan pegadas en parejeas, son diplococos. Si no se separan, y forman una cadena, son estreptococos. Cuando hay dos planos de división, los cocos se quedan en tétradas. Cuando hay 3 planos de división, los cocos producen sarcinos (cubo y regular) o agregados al azar (racimo) que se produce por la división tridimensional - estafilococos. Los bacilos pueden formar diplobacilos o estreptobacilos (en cadenas). Pared celular La pared celular es responsable de la diversidad morfológica de las bacterias. La pared celular es responsable de la rigidez y forma de la bacteria, y también la protege de la lisis por presión osmótica elevada. Estructura de la pared celular 15 Aislamiento de los microorganismos Martes, 26 de octubre de 2004 En las bacterias Gram positivas, la pared celular está compuesta por peptidoglicanos (una capa de 10-80 nm), que consta los 40-90% del peso seco de la pared celular. En las bacterias Gram negativas, los peptidoglicanos representan solo 5-10% del peso de la pared celular. Ésta se rodea por una membrana externa formada principalmente por lipopolisacáridos, proteínas y fosfolípidos. El elemento común en los dos grupos son los peptidoglicanos. Peptidoglicanos Los peptidoglicanos están formados por aminosacáridos acetilados: Nacetilglucosamina (NAG) y N-acetilmurámico (NAM). Del NAM sale una cadena de aminoácidos que puede variar. NAM y NAG forman cadenas intercaladas …G-M-G-M-G…. entre los NAM se forman enlaces que se producen entre los aminoácidos de la cadena peptídica. Éstos se conocen como puentes interpeptídicos o intercatenarios. A veces, las uniones se producen por una cadena polipeptídica intermedia que une los dos anejos peptídicos de los NAM. Cuanto mayor es el número de puentes interpeptídicos, más rígida sea la pared celular. Gram positivos La pared de las bacterias Gram positivas contienen, aparte de la gruesa capa de peptidoglicanos, los ácidos teicoicos. Éstos se unen a los peptidoglicanos. Son polímeros de ribitol-P o glicerol-P. Los ácidos teicoicos tienen elevada densidad de cargas negativas (por su riqueza de iones de fosfato) y parece que tienen un papel en el control de paso de iones por la pared celular. Los ácidos teicoicos son los antígenoss de superficie de las bacterias gram positivas (son capaces de desencadenar respuesta de síntesis de anticuerpos). Las bacterias Gran postilas también presentan ácidos lipo-teicoicos, que se unen directamente a la membrana plasmática de la bacteria. Su composición química es idéntica a la de los ácidos teicoicos de la pared celular, la única diferencia es en el hecho que se une a lípidos de membrana. Las bacterias Gram positivas normalmente no tienen ácidos grasos en su pared celular, pero algunas si que los tienen en la pared, como el género Micobacterium. 16 Morfología bacteriana Jueves, 28 de octubre de 2004 Gram negativos La capa de peptidoglicanos se encuentra en el espacio periplástico, y está cubierta de la membrana externa (no es la membrana plasmática). La membrana externa es una bicapa de fosfolípidos. La composición de esta membrana es muy parecida a la de la membrana plasmática; algunos de los fosfolípidos son sustituidos por lipopolisacáridos. Lipopolisacáridos Los lipopolisacáridos son complejos y formados por unas subunidades: Lípido A. la parte hidrofóbica del lípido. Constituido mayoritariamente por ácidos grasos. Tiene la acción endotóxica de algunas bacterias. Core polisacárido. La parte que formada por cadena polisacárida. Cadena lateral ‘O’. es una cadena de N repeticiones de sacáridos. Es hidrófila y se encuentra en la región más externa de la membrana externa de la pared. Las cadenas laterales tienen el carácter antígeno somático o ‘O’. Función de la membrana externa Elevada carga negativa. Regula paso de iones. Aumenta la resistencia de la bacteria. Frente agentes como la lisozima o la penicilina, que actúan a nivel de los peptidoglicanos de la pared celular. Dejar el paso de nutrientes por porinas. Limitar el periplasma – enzimas y proteínas. Micoplasmas Las micoplasmas son bacterias que no presentan pared celular – protoplastos de vida libre. Su membrana celular es muy resistente (rica en esteroles) para recompensar la ausencia de la pared celular como elemento protector. Las micoplasmas son resistentes a la penicilina y otros antibióticos que actúan a nivel de la pared celular y su formación, ya que no la presentan. Al no tener pared celular, son pleomorfas, y pueden atravesar los filtros que retienen el resto de las bacterias. Los micplasmas tienen requisitos muy específicos, son muy exigentes; sus medios de cultivo son muy complejos y muy enriquecidos. Sus colonias tienen aspecto de ‘huevo frito’ excavado en el medio, de >1 mm de diámetro (hace falta el uso de lupa para verlas). Formas L (de instituto Lister) 17 Morfología bacteriana Jueves, 28 de octubre de 2004 Las formas L son bacterias que han perdido la capacidad de sintetizar los peptidoglicanos. Se puede encontrar formas L de Gram positivos y negativos. Las formas L pueden crecer solo en medios isoosmóticos. Son resistentes a penicilina y otros elementos que actúan a nivel de la pared celular. Se pueden obtener por mutaciones espontáneas o por tratamientos en el laboratorio, como cultivar en medio rico en penicilina, y aislar las bacterias que sobreviven y crecen en este medio. Si al quitar la penicilina vuelven a sintetizar los peptidoglicanos, son formas L inestables, si siguen igual son formas L estables. Estructuras externas Cápsula y capas mucosas Algunas microorganismos sintetizan y secretan polímeros orgánicos, sobre todo polisacáridos, formando una capa sobre la pared celular. La nomenclatura de estas capas depositadas puede ser muy variada. El glicocálix es un término general; sus dimensiones varían en función de la especie. La cápsula es una capa rígida que queda fuertemente adherida a la pared celular. Se observa por tinción negativa (tinta china). Las bacterias que la tienen producen colonias de aspecto mucoso. La capa mucosa es una capa laxa no tan adherida como la cápsula, por tanto no se puede observar por tinción negativa, sólo se aprecia a microscopio electrónico y en el hábitat natural (no en el laboratorio). Los ingredientes de la cápsula/capa mucosa se obtienen a partir de procesos metabólicos habituales – no dependen de nutrientes externos. Sin embargo, algunas bacterias forman cápsula sólo cuando algún nutriente específico es presente. La cápsula no es estructura esencial para el funcionamiento celular. Aun así, es importante para la supervivencia en el hábitat natural del microorganismo. Funciones de la cápsula: Facilita la adhesión a otras células, tejidos o superficies (factor de colonización). Dificulta la fagocitosis de la bacteria. Protege la bacteria frente la desecación. Se piensa que puede actuar como reservorio de nutrientes. Factor de virulencia. Las bacterias patógenas con capsulas, al perder la cápsula pierden su poder patógeno. Capacidad antigénica – antígeno K. 18 Estructuras externas Jueves, 28 de octubre de 2004 Fimbrias y Pili Algunas bacterias tienen fibras extracelulares – fimbrias y Pili, que tampoco son esenciales para la supervivencia del microorganismo. Los dos son apéndices filamentosos en la superficie de la bacteria y se parecen a los flagelos pero no tienen capacidad de movimiento. Fimbrias Son apéndices muy delgados y rígidos, presentes en bacterias Gram negativas y en algunas Gram positivas. No son esenciales para la bacteria. Son más cortos y numerosos que los flagelos. Sirven de estructuras de fijación. Están formados por proteínas que tienen estructura helicoidal. Pili (pelos sexuales) Tienen estructura parecida a la de las fimbrias, pero son más largos y amplios y menos numerosos – cada célula tiene entre 1 y 10 pili. No son estructuras esenciales para le supervivencia bacteriana. Participan en la conjugación bacteriana (transferencia de DNA entre dos bacterias), también sirve como estructuras de fijación. Membrana plasmática La membrana celular es una estructura imprescindible para la supervivencia del microorganismo. Se encuentra debajo de pared celular (si es presente) y forma la barrera osmótica – limita el contenido de la célula y permite la entrada y salida de nutrientes y deshechos. La membrana está formada por una bicapa de fosfolípidos (20-30% del peso seco de la membrana) que tienen una región polar (orientada hacia el exterior de la bicapa) y apolar (orientada hacia el interior de la bicapa) y proteínas de membrana. Las proteínas de la membrana plasmática constan más de 50% del peso seco. Se encuentran intercaladas entre los fosfolípidos de la membrana plasmática. Hay tres clases de proteínas de membrana: Permeasas – proteínas transportadoras Enzimas biosintéticas (síntesis de lípidos, peptidoglicanos etc.) Enzimas de producción de ATP La membrana plasmática no contiene esterol, excepto en el genero de micoplasma. 19 Membrana plasmática Martes, 2 de noviembre de 2004 Transporte de nutrientes Difusión pasiva. El mecanismo más sencillo. No requiere ningún enzima ni consumo de energía. Siempre se produce a favor del gradiente. Difusión facilitada. Es un mecanismo específico, ya que requiere la presencia de proteínas de transporte. Las permeasas permiten el paso de sustancias hidrófilas a través de la membrana plasmática siempre a favor del gradiente. Transporte activo. Mecanismo especifico que tiene lugar gracias a proteínas especializadas y especificas para cada soluto. requiere suministro de energía, ya que lleva a cabo contra el gradiente. Translocación de grupo. Es un mecanismo exclusivo de los procariotas. Consta de la modificación química del sustrato a otro compuesto químico durante el transporte. Las proteínas que se encargan de este tipo de transporte consumen poca energía y tienen actividad catalítica. Este mecanismo no se produce ni a favor del gradiente ni contra ello porque al cambiar el sustrato ya no hay gradiente de concentraciones. Ejemplo: PTS transporta hexosas y tiene actividad fosforilante de hexosas a hexosa-P. La membrana plasmática presenta grosor bastante regular (como se observa a microscopio electrónico), pero a veces se observan también plegamientos o excavaciones de la membrana denominados mesosomas. Éstos suelen aparecer durante la replicación celular y se piensa que tiene algún papel en la división celular. A veces aparecen unidas al cromosoma bacteriano, y se cree que pueden intervenir también en la replicación del DNA. Estructura interna de la bacteria Región nuclear La bacteria presenta una región nuclear, que no se puede considerar un núcleo de verdad, ya que no está limitado por membrana. Se observa una región más electrodensa que contiene una molécula circular de DNA muy replegada. La carga negativa de esta región se debe a los grupos fosfato del DNA, que se neutralizan por la presencia de iones Mg2+ y poliaminas (espermina y espermidina). Citoplasma bacteriano El citoplasma bacteriano contiene diferentes estructuras: Ribosomas Enzimas Gránulos de material de reserva 20 Estructura interna de la bacteria Martes, 2 de noviembre de 2004 Orgánulos envueltos de membrana Nunca presentan RER ni mitocondria. Ribosomas Los ribosomas están formados por RNA (60%) y proteínas (40%). Tienen diámetro de unos 20 nm y sus constante de sedimentación es de 70S (a diferencia de los ribosomas eucariotas, que son de 80S). Como los ribosomas eucariotas, los ribosomas bacterianos se construyen por dos subunidades: Subunidad pequeña. Formada por una molécula de RNA 16S y 20 proteínas. Subunidad grande. Formada por una molécula de RNA 23S, una de 5S y 35 proteínas. Los ribosomas forman agregados denominados poliribosomas. Gránulos de reserva Gránulos metacromáticos/volutina/polisulfato. Contienen acumulo de fosfato inorgánico que sirve de reserva para la célula. Tienen efecto metacromático – cuando se tiñen de colorante básico (como el azul de metileno, azul) se observan rojos. Inclusiones de azufre. Sirven como reserva de azufre inorgánico. Las presentan dos grupos de bacterias: o Bacterias rojas, fotosintéticas. Sirve de fuente de electrones. o Bacterias filamentosas, no fotosintéticas. El SH2 sirve S SO42 como fuente de electrones: SH 2 reserva Materiales orgánicos no nitrogenados de reserva. Reserva de carbohidratos. Normalmente las bacterias utilizan una única sustancia de reserva. o Glicanos (polímeros de glucosa) Almidón (no ramificado) Glicógeno (ramificado) o PHB (poliéster del ácido β-hidroxibutirico). Exclusivo de los procariotas. 21 Estructura interna de la bacteria Martes, 2 de noviembre de 2004 Orgánulos intracelulares envueltos de membrana Los orgánulos están envueltos de una membrana unitaria (una capa) normalmente proteica (excepto los magnetosomas). Hay diferentes tipos de orgánulos: Vacuolas de gas. Presentes en microorganismos acuáticos (bacterias rojas, bacterias verdes). Constad de aire envuelto de proteínas y sirve para flotar. Cuando hay cambio de presión hidrostática, las vacuolas colapsan y las bacterias sedimentan. Carboxisomas. Son cuerpos poliédricos que contienen la enzima ribulosa-difosfato-carboxilasa que fija CO2. presentes en bacterias autótrofas. Clorosomas. Vesículas con pigmentos fotosintéticos que suelen localizarse debajo de la membrana plasmática. Presentes en un único grupo de bacterias fotosintéticas. Magnetosomas. Los presentan microorganismos acuáticos denominados magnetotácticos. Contienen cristales de magnetita envueltos de membrana compleja (proteínas, fosfolípidos etc.). las bacterias que los presentan tienen orientación magnética muy desarrollada y se encuentran en los polos norte y sur. Movilidad bacteriana Flagelos bacterianos Los flagelos son prolongaciones filamentosas helicoidales en la superficie de la bacteria (tanto Gram + como -). Normalmente se presentan en bacterias de forma bacilo. Su función es de movilidad, por tanto no son estructuras vitales. Los flagelos se observan mediante tinciones especiales que sedimentan el colorante alrededor del flagelo. El estudio del flagelo se hace en separado de la célula. El flagelo presenta tres regiones bien diferenciadas: Filamento helicoidal. Tiene diámetro de unos 13 nm, formado por flagelina. Se encuentra en la parte más alejada de la superficie de membrana. Tiene una propiedad importante – autoagrupación. Las subunidades se montan por sí solos espontáneamente. Gancho. De diámetro menor que el filamento. Está formado de una proteína muy similar a la flagelina. Su función es de transmitir el movimiento de rotación al filamento helicoidal. Cuerpo basal – la parte fijada en el interior de la célula. Es un cilindro insertado en un sistema de anillos o discos. Se observa una diferencia entre las bacterias Gram positivas y Gram negativas: o Gram positivas. Tienen los anillos externos (L y R) y también un par de anillos internos (S y M). 22 Movilidad bacteriana Lunes, 8 de noviembre de 2004 El anillo L se inserta en la membrana externa. El anillo R se inserta por debajo de la capa de peptidoglicanos. o Gram negativos. Solo tienen los anillos S y M. Estos dos anillos se sitúan a nivel de la membrana plasmática, justo tocando el espacio periplasmático. El anillo S el más externo, y el M es más profundo. Esta diferencia entre las bacterias Gram positivas y Gram negativas hace pensar que sólo los anillos S y M son imprescindibles para el funcionamiento del flagelo. Los anillos proporcionan el movimiento del flagelo, que se propaga por el cuerpo basal. Características de los flagelos Tienen actividad antigénica – son los antígenos flagelares (AgH) que se localizan a nivel de la flagelina. La síntesis del filamento flagelar se realiza a nivel del citoplasma. Los nuevos componentes del flagelo salen del citoplasma y se deposita en la punta del flagelo. La distribución de los flagelos y su número son unas características taxonómicas que ayuda identificar el microorganismo. Varios tipos de distribución: o Polar Distribución monótica. Un flagelo en un polo. Distribución lofótica. Uno o más flagelos en uno o dos polos. Distribución anfítrica. Un flagelo a cada polo o Perítrica. Distribución de flagelos por toda la superficie de la bacteria. Las bacterias Gram positivas tienen prácticamente todos la distribución perítrica, mientras que las bacterias Gram negativas son más diversas. División de los flagelos. o Polar. Una célula queda con el flagelo original y la otra sintetiza un flagelo completamente nuevo. o Perítrica. Cada célula hija recibe parte de los flagelos originales y sintetiza nuevos flagelos entre los flagelos originales. Funcionamiento de los flagelos 23 Movilidad bacteriana Lunes, 8 de noviembre de 2004 Los flagelos son rotores helicoidales semirígidos que giran alrededor de su eje longitudinal. Tienen dos tipos de movimientos: De avance o traslación (correra) – se mueve linealmente. producida por giros en dirección contra el reloj. De rotación voltereta. Se produce por giros en dirección del reloj. Los anillos S y M giran uno contra el otro. Si se elimina la pared celular, los flagelos quedan intactos, pero la bacteria queda inmóvil, ya que el flagelo es afuncional. Parece que el anillo S está relacionado con la pared celular. Bacterias de flagelación polar se mueven más rápidamente por movimientos de voltereta; en bacterias de flagelación perítrica el movimiento es más lento. Los flagelos no están sincronizados – el movimiento no es 100% eficaz. Movimientos tácticos Movimientos tácticos son movimientos que se producen como respuesta a señal externa en bacterias móviles. Hay diferentes tipos de taxis. Quimiotaxis Se produce por la detección de gradientes químicos. Puede ser quimiotaxis positivo (desplazamiento hacia el gradiente de concentraciones) o quimiotaxis negativo (desplazamiento en el sentido contrario). El quimiotaxis es posible gracias a quimiorreceptores, que son proteínas específicas a diferentes sustancias. Cuando captan cierta sustancia, activan el motor flagelado, produciendo el movimiento. Aerotaxis La aerotaxis es la respuesta al gradiente de oxigeno. Los aerobios tienen aerotaxis positivo, los microaerobios tienen poco aerotaxis positivo y los anaerobios estrictos tienen aerotaxis negativo. Fototaxis La fototaxis es la respuesta al gradiente de luz. Tienen fotorreceptores a nivel de la membrana plasmática, que detectan la luz. Puede ser fototaxis positivo o negativo. 24 Movilidad bacteriana Lunes, 8 de noviembre de 2004 Movimiento de espiroquetas Las espiroquetas son bacterias Gram negativas en forma de gusano con flagelos especiales. Tienen una vaina o cubierta de membrana que envuelve el cilindro protoplasmático. Alrededor del protoplasma, por debajo de la membrana externa, se encuentra el filamento axial, que es el conjunto de flagelos periplasmáticos – fibras axiales o endoflagelos. Se encuentran en el espacio periplasmático. Cada uno está unido a uno de los polos de la célula por un extremo, el poco de inserción. Las espiroquetas pueden tener tres tipos de movimientos en medios acuosos: Translaciones. Los movimientos más lentos. Rotaciones. Giros alrededor de su eje longitudinal. Flexiones. Movimiento parecido a los del gusano, producido gracias a la vaina (en medios viscosos). Movimiento de deslizamiento en las bacterias Gram negativas No se sabe como lo hacen. Pueden moverse sobre medios casi sólidos. No tienen flagelos. Algunos segregan una sustancia que se piensa que está relacionada al movimiento. Endosporas Las esporas bacterianas son realmente endosporas ya que se forman en el interior de la célula. Normalmente las forman las bacterias Gram positivas. Las endosporas se pueden definir como células en reposo – en criptobiosis. Son estructuras de resistencia inertes metabolicamente, que pueden sobrevivir condiciones que la célula vegetativa no puede soportar. Las endosporas tienen elevada refringencia. Son resistentes a la tinción con colorantes básicos; de la misma manera son resistentes al calor, radiación UV y productos químicos. Normalmente el eje longitudinal de la endospora es paralelo al eje longitudinal del bacilo. La forma, amplitud y localización de la endospora son características taxonómicas. La localización puede ser central, terminal o subterminal. La endospora puede deformar o no la célula vegetativa. Las endosporas se observan a microscopia óptica con tinciones diferenciales: Ziehel-Nielsen modificada o verde de malaquita. 25 Movilidad bacteriana Lunes, 8 de noviembre de 2004 Las endosporas se forman cuando la célula deja de dividirse o que se encuentra en condiciones adversas – normalmente al inicio de la fase estacionaria. Formación de endosporas La formación de endosporas consta de 7 etapas morfológicamente y químicamente diferentes, que vienen seguidas. Formación del filamento axial. Es la reorganización del DNA que se coloca en posición transversal en la célula. Formación del septo transversal. Se forma desplazado a uno de los polos, dividiendo la célula a una porción pequeña y una porción grande. Luego la membrana envuelve la porción pequeña, formando la preendospora. Hasta la formación de la preendospora el proceso de esporulación es reversible. Inclusión de la preendospora. La preendospora se forma cuando la membrana plasmática termina envolverse alrededor de la membrana de la porción pequeña. La preendospora es independiente – tiene su DNA y poco citoplasma. Formación del córtex. Se sintetiza entre las dos capas de membrana. Tiene estructura de peptidoglicano. En esta fase también se produce deshidratación parcial de la preendospora, lo que aumenta la resistencia al calor. Síntesis de la cubierta. Se sintetiza alrededor del córtex. Es proteína – queratina – que da mucha fuerza a la espora. Algunas bacterias aun forman otra cubierta – el exosporio. Finalización. Deshidratación total, aumenta la concentración de calcio y ácido dipicolinico que no se encuentra en la célula vegetativa. Los dos forman una sal – dipicolinato cálcico, que representa 15% del peso seco de la endospora. Le da resistencia al calor y refringencia al observarla en el microscopio óptico. Lisis y liberación de la espora. Autólisis por enzimas que sintetiza la propia bacteria. El proceso de esporulación está regulado genéticamente. En la regulación genética de la esporulación intervienen al menos 50 y hasta 200 genes. Es un proceso secuencial – un paso detrás del otro. Se pude inducir experimentalmente inhibiendo la represión enzimática, como cambio de nutriente. El proceso es reversible hasta la aparición de la preendospora. 26 Endosporas Jueves, 11 de noviembre de 2004 De endospora a célula vegetativa Para pasar de endospora a célula vegetativa la endospora ha de sufrir unos pasos: Activación. Una señal que hace que la célula se prepare para la germinación. Es el único paso que es reversible. Puede ser espontáneo o provocado por tratamientos de activación (como choque térmico) e incubación en ambiente favorable. Germinación. Pérdida irreversible de las propiedades de la espora. Depende de las condiciones. La endospora sufre cambios: o Pierde la resistencia al calor o Pierde la resistencia a la acción de sustancias tóxicas o Liberación al medio del ácido dipicolinico o Aumenta la capacidad de tinción o Aumenta la captación de agua y minerales o Baja la refringencia La germinación puede ser inhibida por varios factores: o Nutrientes o Factores ambientales Crecimiento. Transformación de endospora en célula vegetativa. Síntesis de macromoléculas. Diferentes etapas: o Inflamiento dentro de la cubierta. o Síntesis de pared celular. o Sale de la cubierta. o Se alarga e inicia la primera división vegetativa. Características de bacterias formadoras de endosporas Sintetizan sustancias tóxicas o Para insectos o Para hombre y animales – toxinas o Para otros microorganismos Ecología de las bacterias formadoras de endosporas No tienen relación genética entre sí. Son todos de hábitat común – el suelo 27 Endosporas Jueves, 11 de noviembre de 2004 La presencia de endosporas inhibe la existencia de otros microorganismos en el hábitat. Casi todas son Gram positivas y casi todas de tipo bacilo. Metabolismo bacteriano Hay dos mecanismos para fabricar ATP: fosforilación a nivel de sustrato y fosforilación oxidativa. Estos dos mecanismos llevan a cabo en membranas. En eucariotas ocurren en las membranas mitocondriales, y en los procariotas – en la membrana plasmática (mesosomas). La fuente de energía química es de reacción de oxidación y reducción. Los piridin-nucleótidos tienen capacidad de reducirse y oxidarse de forma reversible. Los microorganismos tienen tres mecanismos para generar ATP: Fermentación. Respiración Fotosíntesis Fermentación La fermentación es el proceso más sencillo para obtener ATP. El sustrato ha de ser orgánico. Los compuestos orgánicos sirven tanto como donadores de electrones (se oxidan) o como aceptores de electrones (se reducen). La obtención de ATP es por fosforilación a nivel de sustrato (no hay aceptor final de electrones). La oxidación del carbono es parcial – la cantidad de energía que se obtiene es baja. Diferentes tipos de fermentación Alcohólica. El producto es el alcohol etílico. Sirve para la elaboración de vino, cerveza y licores. Láctica. El producto final es el ácido láctico. Esta fermentación lleva a cabo por la actividad de bacterias del ácido láctico. Sirve en la elaboración de productos lecheros. Dos tipos de fermentación láctica: o Homofermentadores. Solo se produce ácido láctico. o Heterogermentadores. Se produce ácido láctico, ácido acético y etanol. Fermentación propiónica. Produce ácido propiónico. Utiliza como sustrato cualquier carbohidrato. Fermentación ácido mixto. Sirve para identificar géneros de la familia enterobacter. Dos tipos de fermentación o Tipo E. coli. Forman predominantemente ácidos (fórmico, acético, succínico, láctico). 28 Metabolismo bacteriano Lunes, 15 de noviembre de 2004 o Tipo aerobacter. Forman predominantemente butanodiol y ácidos en poca proporción. o Bioluminiscencia. Fermentación ácido mixto en presencia de oxigeno, sin oxigeno, produce luz. Fermentación butírica y butanólica. Típica del genero clostridium. Anaerobios estrictos. Fermentación metánica. CO2 como aceptor final de electrones. Bacterias anaerobias estrictas. Fermentación homoacética. CO2 como aceptor de H2, reduce el CO2 a ácido acético. Utilizado a nivel industrial para producir ácido acético. Compuestos fermentables Compuestos con C, H, O y N que pueden ser parcialmente oxidados por hidrólisis: polisacáridos, pentosas, polialcoholes, ácidos orgánicos, aminoácidos. Los compuestos no fermentables son los carbohidratos aromáticos y alifáticos, esteroides, terrenos. Son muy estables en anaerobiosis, aunque son oxidables. Respiración En la respiración pueden actuar como donador de electrones tanto los compuestos orgánicos como los compuestos inorgánicos (más orgánicos que inorgánicos) igual como los aceptores finales (más inorgánicos que orgánicos). El sustrato se oxida totalmente, produciendo elevada cantidad de energía. La respiración requiere la presencia de compuesto con capacidad redox reversibles y una cadena de transporte de electrones. La generación de ATP es por fosforilación oxidativa. Hay dos tipos de respiración, según el aceptor final de los electrones. Si el aceptor final es el oxigeno --> respiración aeróbica. Si el aceptor final de es oxigeno --> respiración anaeróbica. 29 Metabolismo bacteriano Lunes, 15 de noviembre de 2004 Respiración aeróbica Respiración anaeróbica Los microorganismos pueden utilizar los nitratos como fuente de nitrógeno, pero las enzimas que actúan en la reducción no son las mismas, aunque los productos finales son iguales. Igual que los nitratos, las enzimas que captan sulfatos, no son las enzimas que lo utilizan como aceptor de electrones. Cada tipo de microorganismo utilizar un tipo de aceptor de electrones. Metabolismo quimiolitotrofo Quimiolitotrofos – grupo de microorganismos que viven en medios estrictamente minerales. Tienen fuente de carbono diferente de la fuente de energía. 30 Metabolismo bacteriano Lunes, 15 de noviembre de 2004 Resumen Mecanismo de transporte de electrones Es utilizado para producir ATP. Se encuentra en la respiración aeróbica y anaeróbica y también en la fotosíntesis. Consta de una gama de moléculas transportadoras con capacidad redox reversible. Se localiza en los cloroplastos y mitocondrias en eucariotas y en las membranas de los procariotas CTE Función: aceptar los electrones del donador y transferirlo al aceptor. Conservan la energía liberada por este proceso de transporte para fabricar ATP. Principales componentes Flavoproteínas. Proteína que transporta electrones. También recibe iones de H+. NADH deshidrogenasa. Transportadoras proteica de protones. Citocromos. Transportadora proteica de electrones. 31 Metabolismo bacteriano Lunes, 15 de noviembre de 2004 Rutas metabólicas comunes en fermentación y respiración Glicólisis Pentosas P EnterDoudoroff (exclusivo de procariotas) Fotosíntesis El mecanismo más complejo. Presente en organismos fototrófos. La mayoría son autofototrófos – utilizan CO2 como fuente de C. la síntesis de ATP es parecida a la de la respiración (fosforilación oxidativa). Los microorganismos fotosintéticos son capaces de convertir la energía de la luz en energía química. El mecanismo de fotosíntesis puede ser cíclico o no cíclico. Componentes del aparato fotosintético: Cadena de fotocaptación. Centro de reacción Cadena de transporte de electrones. El pigmento más importante es la clorofila. Otros pigmentos son los carotenos y las ficobiliproteínas. En el centro de reacción los fotones activan las moléculas de clorofila. La activación provoca liberación de electrones. Los electrones siguen un circuito, que puede ser cíclico (fotosíntesis cíclica) o lineal (fotosíntesis no cíclica). La proteína más importante es la ferredoxina. Los electrones pasan a la CTE que es igual que la CTE de la respiración. Los electrones que salen de la CTE vuelven al centro de activación, y desactivan las moléculas de clorofila --> fotosíntesis cíclica. En la fotosíntesis no cíclica, los electrones pasan de la clorofila a la ferredoxina, que los transporta a NADP+, que se reduce a NADPH. La clorofila se regenera por el paso de electrones de la CTE (que produce ATP). Los electrones provienen de otro donador de electrones, y no de la clorofila. Los donadores de electrones pueden ser agua (fotosíntesis oxigénica, produce oxigeno) o otros (fotosíntesis no oxigénica). Primera etapa – formación de ATP y NADPH – fotofosforilación. Segunda etapa – consumo de ATP y NADPH – ciclo de Calvin. 32 Biosíntesis Jueves, 18 de noviembre de 2004 Biosíntesis Macromolécula Precursor Ácidos nucleicos Nucleótidos Polisacáridos Carbohidratos simples Lípidos Ácidos grasos, aminoácidos Hay 12 metabolitos precursores. Asimilación de C, H, O, N, P y S. Asimilación de C. o Quimiolitotrofos. Ciclo de Krebs o Fotosintéticos. Ciclo de Calvin Asimilación de N. o Asimilación de NH3. tres productos de fijación: ácido glutámico, glutamina y asparginina. o Asimilación de NO3. reducción asimilatoria de Nitratos. o Asimilación de N2. reducción por el proceso de fijación. Sobre todo en bacterias relacionadas con la agricultura. Fijación de S. o SO3-2. reducción asimilatoria de los sulfatos. Dos complejos enzimáticos que consumen mucho ATP. Fijación de P. o Se incorpora en forma de fosfato inorgánico (PO4-3). Aminoácidos. o Histidina – origen biosintético diferente o 19 aminoácidos – 5 precursores (oxalacético, piruvato) Poliaminas (putrescina – da resistencia osmótica. Espermina y espermidina – neutralizan la carga negativa del DNA). o Precursores – intermediarios de biosíntesis de aminoácidos Lípidos. Dos rutas diferentes o AG esterificados. Nº par de carbonos. No más de un doble enlace. o Isopreno. 33 Biosíntesis Jueves, 18 de noviembre de 2004 Mecanismos de regulación del metabolismo Regulación de síntesis enzimática (nivel genético) o Inducción – una enzima determinada solo se sintetiza cuando una sustancia está presente en el medio. o represión. Por producto Por metabolito de la ruta catabólica Regulación de actividad enzimática o Control alostérico Crecimiento microbiano El crecimiento se define como aumento ordenado de todos los componentes químicos de organismo. El crecimiento de una célula implica aumento del peso y tamaño, que lleva a la división celular. El crecimiento de una población celular implica múltiples divisiones celulares, que conllevan un aumento del número de células. La multiplicación celular implica aumento de número de individuos en organismos unicelulares, mientras que implica aumento del tamaño del individuo en organismos pluricelulares. División celular en bacterias La división o fisión binaria es generalmente transversal. Da dos células hijas iguales. Consta de tres fases: Replicación del DNA (alargamiento de la célula) División del DNA Formación del septo transversal y separación de las dos células hijas. El septo transversal se forma como crecimiento interior de membrana y pared celular. Una de las dos cadenas se rompe en un cierto punto, y la doble hélice se desenrolla. La síntesis se produce en dirección 5’-->3’. El extremo 5’ queda sumergido en la membrana formando un nuevo mesosoma. La cadena se desplaza en el sentido contra reloj lo que abre la horquilla. Una vez formadas las dos copias de la doble hélice, se forma el septo transversal. El septo transversal se forma en el interior de la célula, y divide la célula madre en las dos células hijas. 34 Crecimiento microbiano Martes, 22 de noviembre de 2004 Crecimiento de la población El tiempo de generación (duplicación) se define como el tiempo que triga entre 2 divisiones, o en otras palabras, el tiempo que triga una población en duplicarse. El tiempo de generación varía según la especie y condiciones ambientales, de 10 minutos en procariotas hasta años en eucariotas. En las condiciones naturales, el tiempo de generación suele ser mayor que en el cultivo en laboratorio. Expresión matemática del crecimiento N0 – numero inicial de la población bacteriana Primera generación N1 2N0 Segunda generación N2 2 2N0 22 N0 Tercera generación N3 2 2 2N0 23 N0 n generación N3 2 2n1 N0 2n N0 log N log N0 n log n n log N log N0 log 2 constante K es el constante de velocidad de crecimiento exponencial – es el numero de divisiones celulares (o numero de generaciones) producidas por una unidad de tiempo. K n Kt n n t K t log N log N 0 log N LogN 0 K log 2 t log 2 El tiempo de generación se puede calcular a partir de t y n: t t gen t 1 t gen n kt k n Kt Es mucho más fácil representar el crecimiento exponencial en una grafica semi-logarítmica: eje y (crecimiento) logarítmico, y eje x (tiempo) normal. El pendiente representa la velocidad de crecimiento. Cuanto más grande es el pendiente, más grande es el K. 35 Crecimiento microbiano Martes, 22 de noviembre de 2004 Diferentes fases del crecimiento microbiano El crecimiento de tipo exponencial no dura mucho tiempo por unas razones: Se agota algún nutriente esencial Acumulación de residuos tóxicos del metabolismo Hay 4 fases diferenciadas por la velocidad de crecimiento y cambios morfológicos y fisiológicos en el microorganismo: Fase de latencia. El tiempo que el microorganismo necesita para acostumbrarse a las condiciones (V=o). Fase de crecimiento exponencial. Fase estacionaria (V=0) Fase de muerte. También es exponencial pero de signo inverso Fase de latencia La duración de la fase de latencia varía en función de la especie y no siempre se produce. Puede ser más o menos largo. Inoculo (MC 1) Medio fresco Periodo de latencia Fase exponencial MC1 T igual No hay fase de latencia Fase estacionaria MC1 T igual Hay fase de latencia Fase muerte MC1 T igual Hay fase de latencia muy largo – pocas células viables Fase estacionaria /muerte MC2 Hay fase de latencia Fase exponencial (E. coli) MC2 (contiene xilosa) Hay fase latencia, el microorganismo se acostumbra al nuevo sacárido Fase exponencial (E. coli) MC2 (contiene glucosa) No hay fase estacionaria. La glucosa es fácilmente degradadle y casi todos los microorganismos tienen enzimas glicolíticos Fase exponencial La fase exponencial se caracteriza por: División y duplicación de la población en intervalos regulares de tiempo (tiempo de generación). Células viables y mucha homogeneidad química y fisiológica. 36 Crecimiento microbiano Martes, 22 de noviembre de 2004 Aumento del número de células y de la masa celular. La velocidad de crecimiento depende de las condiciones del cultivo. La velocidad tiene un límite máximo, que se determina genéticamente. La fase exponencial no dura sino que llega un momento que para. Fase estacionaria La velocidad de crecimiento es cero. La duración de esta fase es variable. Fase de muerte La fase de muerte también es exponencial pero de signo negativo. La muerte puede estar acompañada de lisis. Si no se tiene en cuenta cuales de las células son viables y cuales no, se puede cometer errores. Cambios morfológicos y fisiológicos Tamaño celular o Elevado en la fase exponencial o Reducido en la fase estacionaria Formación de endosporas. Fase estacionaria Metabolitos secundarios. Sintetizados en la fase estacionaria. o Antibióticos o Toxinas o Pigmentos La síntesis de metabolitos secundarios se hace a partir de metabolitos primarios, que se han acumulado en la fase exponencial o logarítmica. Medición de crecimiento y tamaño de población Medición del crecimiento 1. Determinación de peso seco. De un volumen conocido se separan las células, se secan hasta la deshidratación total y se pesan. Hay unas tablas que hacen equivalencias con numero de células para saber que momento de la curva de crecimiento se encuentra la población. 2. Indirectos de algún componente celular. Se determina el contenido de N celular o proteico, o el contenido de DNA. 37 Crecimiento microbiano Jueves, 25 de noviembre de 2004 3. Método óptico (turbimetría). Se mide la cantidad de luz difractada por una solución. Cuanto mayor sea la concentración de celular, más luz se absorbe. A log Inical A crecimiento log final Medidas del número de células 1. Método microscópico. Cámaras de recuento de células (como en hematológica). No distingue células viables de células no viables. Es un método poco preciso. 2. Contador eléctrico. El aparato tampoco sabe si las células están viables o no. Cada vez que pasa una célula, hay una señal eléctrica. También cuenta partículas no microbianas. 3. Recuento en placa. Contamos células vivas, que forman colonias (UFC). Cada colonia se origina por una sola célula (UFC, unidad formadora de colonias). Hay dos técnicas: a. De superficie. Bajo volumen (0.1 ml). b. Inclusión. Volumen elevado incluido en el medio (agar). Este método nos permite aislar los diferentes microorganismos. 4. Técnica del NMP (numero más probable). Se mide el crecimiento en medio líquido. No se puede contar las células. Se realizan diluciones y se cuentan tubos positivos (con crecimiento) y se consulta una tabla de NMP. 5. Filtración a través de membrana. Medio liquido con muy pocos microorganismos. Concentramos la muestra. Se parte de un volumen bastante grande de la muestra – se usan filtros para concentrar la muestra. Crecimiento sincrónico Los microorganismos son sincronizados cuando todas las células están en la misma fase. Normalmente las poblaciones son asincrónicas. Nos interesa que la población sea sincronizada para estudiarla mejor. Hay dos maneras de sincronizar una población: Inducción Selección o Filtración. Las células quedan adheridas al filtro y luego se ponen en medio liquido fresco. Se empiezan a formar células hijas recién formadas en la misma fase – fase de crecimiento exponencial. o Centrifugación 38 Crecimiento microbiano Jueves, 25 de noviembre de 2004 Cultivo continuo Un cultivo que siempre se encuentra en fase exponencial se puede conseguir si se mantiene el volumen del cultivo constante. Dos métodos para mantener el cultivo continuo: Quimiostato Turbidostato Genética de los microorganismos El gene: avances históricos: Descubrimiento de los genes – Mendel (1866) Descubrimiento de ácidos nucleicos (1871) Descubrimiento de la doble hélice (1953) Elucidación del código genético Secuenciación rápida de DNA (1977) Secuenciación automatizada del DNA (1986) Primer genoma secuenciado (1995) Primer cromosoma humano secuenciado (1999) Genoma humano secuenciado (2001) Estudios genéticos – modelo bacteriano Ventajas: Corto tiempo de generación De una célula se consigue una población casi idéntica (concepto de clon-cepa). Material genético sencillo Inconvenientes: Pequeño tamaño individual – estudio de poblaciones y no de individuos. Reproducción sexual no convencional. Conceptos genéticos Concepto antiguo: un gen codifica una proteína. Concepto amplio: un gen codifica un péptido, rRNA, tRNA, promotor, regulación. En eucariotas, hay exones (no codifican) e intrones (codifican). En procariotas casi no existe este fenómeno. Por el otro lado, en procariotas es 39 Genética de los microorganismos Jueves, 9 de diciembre de 2004 muy habitual que un grupo de genes que codifican proteínas relacionadas (por ejemplo, una ruta metabólica) son transcritas, traducidas y reguladas en bloque. Los alelos son formas mutacionales. Cambios de un gen determinado. No siempre influyen la funcionalidad. El genóforo bacteriano es el equivalente al ‘cromosoma’ bacteriano. Contiene la mayor parte de la información genética, pero no toda – hay otras estructuras que contienen información genética – los plásmidos. El genoma bacteriano es la suma del genóforo y los plásmidos. En eucariotas, el genoma es la suma de todos los cromosomas, DNA mitocondrial y DNA del cloroplasto. El genotipo es el conjunto de genes de un determinado organismo. El fenotipo es el conjunto de características observables de un organismo en cierto ambiente. Los cambios debidos al ambiente pueden ser morfológicos o fisiológicos. Mutaciones Las mutaciones son variaciones genotípicas. Cualquier cambio permanente de la secuencia de DNA se considera una mutación, de cambios de muchas bases (fácilmente detectables) hasta cambios de una única base (difícilmente detectables). Hay diferentes clases de mutaciones: Selectivas. El mutado beneficia de la mutación. No selectivas. La mutación no afecta el mutado. Las mutaciones son muy raras – su frecuencia es de 1/100 millones de bases. Pueden ser espontáneas o causadas por unas causas: Error de replicación de DNA Daño al DNA o Radiación o Mutágenos endógenos (metabolitos altamente reactivos) o Transposones – elementos genéticos que saltan dentro del DNA. Macrolesiones del DNA Se cambia más de una base. Deleciones – pérdida de materia genética (cierta secuencia). Duplicaciones – se multiplica un determinado fragmento del DNA. Inversiones – se invierte la secuencia (ABCDE --> ABEDC). Inserciones – se incorporan bases al DNA. dos fragmentos de DNA que intercambian información entre sí. Parecido a recombinación meiotica. 40 Genética de los microorganismos Jueves, 9 de diciembre de 2004 Microlesiones del DNA Cambio puntual de una base. Sustituciones de bases o Transición – cambio de una base por otra base del mismo tipo (purina por purina, pirimidina por pirimidina). o Transversión – cambio de una base por una base del otro tipo – purina por pirimidina y viceversa. Consecuencias de la mutación (en la proteína) Silenciosa – diferente código, mismo aminoácido. Ejemplo: cambio de AGG por CGG, los dos codifican una arginina. Neutra – cambio de código, de un aminoácido a otro con función similar. AAA (lisina) a AGA (arginina). Sentido erróneo – cambio de código de un aminoácido a otro con función no similar (ejemplo: aminoácido ácido por aminoácido aromático). Sin sentido – el cambio codifica STOP. Desplazamiento del marco de lectura El desplazamiento del marco de lectura corresponde a eliminación de una base. Se puede corregir por una reversión – añadir una base. Reversión verdadera: (GC) --> (AT) --> (CG). Nueva par de bases: o Mutación silenciosa o Mutación neutra Mutación supresora o Intragénica (desplazamiento). o Extragénica – tRNA. La segunda mutación (que corrige el gen) se produce en el tRNA. Mutágenos Los mutágenos son agentes que causan mutaciones. Hay varios tipos de mutágenos, de diferentes mecanismos de acción: incorporación al DNA, unión al DNA, daño físico etc. 41 Genética de los microorganismos Lunes, 13 de diciembre de 2004 Mutágenos químicos Análogos de bases Hay unos compuestos que se parecen a bases del DNA. Estas moléculas pueden tener dos conformaciones (enólicas y cetónicas). El cambio de conformación implica un cambio del numero de puentes de hidrogeno que la molécula es capaz de formar – y un cambio de la base a la cual se puede unir. 1ª generación 2ª generación 3ª generación 4ª generación A—T G—5BrU G—C A—5BrU Agentes intercalantes Los agentes intercalantes se unen al DNA, pero no se incorporan a él. Se colocan entre las bases, y cuando el DNA se replica, en su lugar se añaden bases de forma aleatoria produciendo mutación de inserción con desplazamiento de marco de lectura. Ejemplos: acridinas, bromuro de etidio. Agentes que reaccionan con el DNA El ácido nitroso convierte la adenina en hipoxantina (causa desaminación de la base). 1ª generación 2ª generación 3ª generación 4ª generación A—T H—T H—C G—C Agentes alquilantes Los agentes alquilantes son donadores de grupo alquilo (metilo, etilo etc.). Hay dos tipos de agentes alquilantes: Monofuncionales. Añaden grupo alquilo solo sobre una cadena. Ejemplo: etilmetasulfonato. 1ª generación 2ª generación C—G G’’—T 3ª generación A—T Bifuncionales. Añaden grupo alquilo sobre las dos cadena uniéndolas. También activan enzimas que rompen el DNA, en una intención de recuperar parte de la información retenida en el DNA. ejemplo: mostaza nitrogenada, mitomicina, nitrosoguanidina. 42 Genética de los microorganismos Lunes, 13 de diciembre de 2004 Mutágenos físicos Radiaciones ionizantes (X, Γ y UV) Las radiaciones ionizantes producen radicales libres que atacan la célula, incluso el DNA. La radiación a 260 nm (UV) es muy mutagénica porque es absorbida por el DNA. Produce una alteración de bases pirimidínicas contiguas, dando lugar a los dímeros de pirimidinas. Este tipo de mutación modifica la estructura del DNA, y la polimerasa no reconocer la información codificada. El daño producido por la radiación UV puede ser reparado por la fotorreactivación con luz visible. La presencia de fotones activa una enzima, la fotoliasa, que es capaz de romper los dímeros de pirimidinas. Hay otro mecanismo de reparación, que es la reparación oscura (no necesita luz visible). Es un proceso complejo, en que intervienen muchas enzimas que coactan para recuperar el DNA. Por ejemplo, se utiliza reparación por excisión: endonucleasa UVR-ABC elimina el dímero de timina; la polimerasa I sintetiza la secuencia eliminada (a partir de la cadena complementaria); la ligasa une los trozos de DNA. Intercambio genético Exogenote – proviene de fuera. Endogenote – material genético propio del organismo. Hay varios mecanismos de adquisición de DNA por bacterias: Transformación. El DNA proviene del exterior. Transducción. El DNA proviene de un virus (bacteriófago). Conjugación. El DNA proviene de otra bacteria. El producto del intercambio genético es el merocigoto (cigoto parcial). Del merocigoto hay varias posibilidades: DNA integrado en el genóforo propio de la bacteria. DNA no se puede incorporar. Un diploide parcial. Se duplica dando lugar a clon con genóforo y segmento de DNA separado. DNA no se puede incorporar ni duplicar. No se forma clon. Célula única parcialmente diploide. Restricción del hospedante. Activación de enzimas DNAsas que degradan el DNA. 43 Intercambio genético Martes, 14 de diciembre de 2004 Transformación natural Griffiths 1928. El Streptococcus pneumoniae puede tener dos formas de colonias: lisas – S (con cápsula, elevada patogenidad) y rugosas – R (sin cápsula, baja patogenidad). Desactivación de cepa S con calor. Se añade a la cepa R viva. Al juntar las células rugosas con el degradado de las células S se ha producido la transformación natura – la cepa R ha adquirido fragmentos de DNA que codifican la capacidad de producir cápsula. Al inyectar las cepas R al animal, se muere. Al extrae el microorganismo del animal muerto, se ven dos cepas: lisas (S, capsulados) y rugosas (R, no encapsulados). Transformación natural – competencia. Proteínas de membrana que reconocen el DNA y lo entra a la célula. Una nucleasa rompe el DNA al entrarse a la célula en fragmentos. Una proteína de competencia lo separa en una cadena, que se integra al DNA (por la DNA nucleasa). Transducción El DNA proviene de un bacteriófago. El bacteriófago infecta la célula donadora, de la cual coge un fragmento de DNA. Este fragmento es introducido por el bacteriófago a la célula receptora. Transducción generalizada El bacteriófago inyecta su material genético, con el fin de multiplicarse dentro de la célula infectada. El DNA vírico es suficiente para multiplicar el fragmento de DNA y las proteínas que lo envuelve. Las proteínas se montan formando la cápside. El bacteriófago anula la capacidad de funcionamiento del genóforo. El DNA de la bacteria se fragmenta por nucleasas. La bacteria contiene muchas copias del DNA vírico y fragmentos de su propio DNA (que provienen del genóforo roto). El DNA vírico ha de ser incorporado en la cápside. Como hay fragmentos de DNA bacteriano degradado en la célula, cuando se incorpora el DNA vírico en la cápside, puede entrar en la cápside algún fragmento de DNA bacteriano. Cuando el bacteriófago infecta otra bacteria, también inyecta el material genético bacteriano. Este tipo de transducción se denomina transducción generalizada, ya que cualquier gen de la bacteria donadora puede transducir de esta manera. 44 Intercambio genético Martes, 14 de diciembre de 2004 Transducción especializada Transducción de ciertos genes. Ejemplo: al estudiar la transducción en E. coli K12 y el bacteriófago Tλ, se observaba que siempre se producía transducción de uno de dos genes determinados: el gen que codifica la síntesis de biotina y el gen que codifica la enzima β-galactosidasa. El DNA del bacteriófago se integra al genóforo, siempre en el mismo lugar en el genóforo – en los extremos hay dos secuencias que se parecen a la secuencia del DNA vírico (secuencias Att (Attachment)). Los genes que siempre se incorporan se encuentran a los dos lados de las secuencias de adhesión. El bacteriófago en este caso entra en un ciclo lisogénico – el DNA se cicla para separar la secuencia del bacteriófago. Si no llega a hacerlo perfectamente, coge un fragmento de uno de los dos genes adyacentes – la β-gala o la biotina. Conjugación El intercambio de genes entre células mediante un pili sexual – hay una célula donadora y una célula receptora. La secuencia F (factor F) está presente en unas bacterias. Puede ser incorporada en el genóforo o estar libre (plásmido). Si la célula F positiva se junta con la célula receptora (F negativa), se intercambia el factor F. El factor F se multiplica y pasa a la célula por el pili sexual. La célula receptora se hace F positiva. HFR – High Frequency Recombination. Células que ganan más información por la conjugación, en función del tiempo que estén unidas las células por el pili. El factor F está integrado en el genóforo. El DNA bacteriano se duplica y atraviesa el pili. En estos casos, normalmente no intercambia el factor F. Otros elementos genéticos de la bacteria Plásmidos Los plásmidos son cadenas cortas de DNA de peso molecular bajo y pocos genes con capacidad de autoduplicación. Muchas veces tienen la capacidad de autotransferencia, mediante conjugación. El factor F es un plásmido, que puede transferir información: resistencia a antibióticos (plásmido R), patogenia, capacidad de sintetizar pigmentos o antibióticos. 45 Plásmidos Martes, 14 de diciembre de 2004 Plásmido R Contiene unas zonas diferenciadas: RTF – codifica la replicación del plásmido y su transferencia a otra célula. R1, R2,… genes que codifican resistencia a antibióticos y terapéuticos. Ejemplo: resistencia a penicilina. Enzima que rompe el anillo βlactámico. La presencia de los plásmidos R fue descubierta en una epidemia de disentería (Shigella dysenteriae) en Japón. Las cepas que causaron la enfermedad eran resistentes a diferentes tipos de antibióticos y adquirían resistencia a nuevos tipos de antibióticos, hecho que no se puede explicar con la mutación y selección natural (que es más lenta). Transposones Los transposones son fragmentos de DNA con capacidad de desplazamiento. Presentes en eucariotas y procariotas. Los transposones presentan secuencias de inserción en sus dos extremos. Estas secuencias contienen pocas bases, que codifican la capacidad de movimiento: la transposasa y secuencias inversamente repetidas. Los transposones compuestos contienen 10-15 miles de bases, que codifican genes de resistencia, toxinas, enzimas etc. Estructura El transposón es muy pequeño – es un fragmento en comparación con el plásmido. Puede contener un único gen que codifica una característica (aparte de las secuencias de inserción). Es un mecanismo para facilitar la acumulación de nueva información. Formas de producir transposición Conservativa El número total de copias es uno. El transposón puede moverse, pero no puede multiplicarse. Replicativa El número total de copias es dos (como mínimo). El transposón se duplica antes de insertarse de nuevo al genoma. Estos transposones tienen un gen que codifica una enzima de duplicación. 46 Plásmidos Jueves, 16 de diciembre de 2004 Efectos Formación de plásmidos R Diseminación de información Mutación Recombinación genética General (homologa). Secuencias muy parecidas. Si la molécula es muy parecida al lugar donde ha de integrarse, es muy fácil que se integre – complementariedad. No hace falta que sea completamente idéntica. Especifica de lugar. La secuencia se introduce en lugares específicos – los lugares Att (attachment). Se produce la lisogenia. Replicativa. La integración de transposones. El transposón tiene sus enzimas para moverse y replicarse. Genética de eucariotas El intercambio genético en microorganismos eucariotas es similar al intercambio genético en plantas y animales. La información genética se agrupa en cromosomas pero también hay información genética extracromosómica – en mitocondrias y cloroplastos. El modelo de estudios de eucariotas es la levadura (Saccharomyces cerevisiae). Sus característicos son: Cromosomas: n=16 Ciclo – diploide o haploide. Reproducción o Sexual (a y α, los signos sexuales) o Asexual Ascomicote – ascosporas. Primero eucariota decodificado – tienen 12 millones de bases. El ciclo reproductivo sexual y asexual complica el estudio en laboratorio. 47 Genética de eucariotas Jueves, 16 de diciembre de 2004 Ingeniería genética Conceptos Ingeniería genética – modificación directa del genoma premeditada. Tecnología del DNA recombinante. Una técnica muy utilizada en la ingeniería genética. Biotecnología. Manipulación de organismos para obtener productos útiles. Enzimas de restricción Las enzimas de restricción son nucleasas que se activan cuando se introduce DNA ajeno a la célula. Cada enzima corta de una manera especifica. Las enzimas de restricción cortan el DNA de forma que quedan extremos cohesivos. Lo que interesa es que se una un fragmento del DNA con plásmido cortado por la misma nucleasa (tiene los mismos extremos cohesivos). Para introducir el gen deseado, hace falta de un vector – un plásmido o un bacteriófago. Para asegurarse que la bacteria (E. coli) en el cultivo ha adquirido el plásmido, se utiliza un plásmido que contiene un gen de resistencia a cierto antibiótico (ejemplo: tetraciclina). La colonia que crece en el medio con tetraciclina ha adquirido el plásmido (pero no necesariamente el gen). Este método funciona con genes de procariotas, pero no en eucariotas (que tienen intrones y exones). 48 Genética de eucariotas Lunes, 20 de diciembre de 2004 Plásmido PBR 332 contiene dos genes que codifican resistencia a dos diferentes antibióticos: ampicilina y tetraciclina. En cada gen hay dos lugares en que se puede cortar el plásmido por diferentes enzimas de restricción. Si se utiliza cierta enzima, entonces se anula el gen que se ha cortado por la enzima, y hay que utilizar un medio que contiene el otro antibiótico (que no se ha cortado el gen que codifica la resistencia a él). Vectores de clonación Fags. Los bacteriófagos se utilizan como vectores de clonación. Cósmidos. Fags sin su material genético. Sólo se mantienen los extremos cohesivos (Att). Se utilizan para incorporar más material genético que mediante los fags. Cromosomas artificiales. YAC (yeast artificial chromosome) y BAC (bacterial artificial chromosome). Se ha trabajado con este mecanismo para seccionar el genoma humano. Se elimina gran parte del genoma bacteriano o de la levadura, y se introducen genes de otros organismos. La finalidad es aumentar la cantidad de DNA disponible para el estudio. Replicación de DNA por PCR. Se utiliza un termociclador, que varía la temperatura rápidamente (calentar y enfriar). Se utiliza para separa las cadenas de DNA (calentándolas) y que junten (enfriar). Aparte, hace falta de: o Cebadores. Fragmentos de DNA que inician la replicación. o Bases o Taq polimerasa. Es una DNA polimerasa que utiliza una cadena de DNA como molde. La polimerasa puede catalizar la reacción a temperaturas elevadas necesarias para mantener las cadenas separadas. La taq polimerasa se extrae de una bacteria, Thermus aquaticus, que vive en manantiales calientes (~100º). Aspectos genéticos de la regulación celular Concepto de regulación: modelo bacteriano J. Monod (1940). E. coli (lactosa positiva) utiliza la lactosa. Tiene una permeasa que transporta la lactosa al interior de la célula y la enzima βgalactosidasa, que rompe la lactosa en glucosa y galactosa. En E. coli crecido en medio de cultivo sin lactosa, la cantidad de las dos proteínas es muy baja. En presencia de lactosa, las dos están presentes en elevada cantidad. La alolactosa (isómero de la lactosa) es quien activa la síntesis de las proteínas. El operón lactosa está formado por una serie de genes que se traducen en forma sistrónica en presencia de lactosa (Z – β-galactosidasa; 49 Regulación génica Lunes, 20 de diciembre de 2004 Y – permeasa). El operador LacO es el operador de la lactosa. Contiene el promotor y otros elementos. En situación de medio sin lactosa, los niveles de enzimas son muy bajos. El gen LacI es un gen regulador que se traduce constantemente en una proteína represora. Este tipo de gen se denomina gen regulador. Cuando no hay lactosa en el medio, la proteína represora inhibe la síntesis de las enzimas del metabolismo de la lactosa – se une al operador y no deja que la RNA polimerasa se una al DNA. Así se bloquea la síntesis de RNA mensajero. Cuando se añade lactosa al medio, ésta actúa como inductor que bloquea la proteína represora. Cuando la proteína represora se une a la lactosa, no puede fijarse al operador del gen y el gen se traduce a RNA mensajero. Enzimas que se pueden activar de esta manera se denominan enzimas inducibles. Inducción génica – enzimas inducibles Represión génica implica enzimas reprimibles – enzimas que se inhibe su síntesis por productos o sustancias. La proteína reguladora (represora) actúa como represora sólo cuando se encuentra el co-represor. Si está sola, es inactiva. Ejemplo: triptófano. Cuando la concentración de triptófano es elevada, se inhibe el bloque de enzimas que sintetizan triptófano a partir de otros aminoácidos. Síntesis constitutiva Enzimas que se sintetizan constantemente (como las enzimas de la glicólisis). Cuando en el medio hay glucosa y lactosa, la curva de crecimiento es diaúxica (tiene dos áreas de crecimiento exponencial). Control positivo – represión por catabolito 50 Regulación génica Lunes, 20 de diciembre de 2004 La regulación de la utilización de diferentes nutrientes favorece la utilización del nutriente más fácil de degradación (glucosa es más fácil de degradar que lactosa, por ejemplo). Cuando hay una fuente de energía de utilización fácil (glucosa) la concentración de CAMP es muy baja. CAMP en baja concentración induce la síntesis de CAP, que inhibe la transcripción de los genes que codifican las enzimas del metabolismo de lactosa, aunque su concentración en el medio es alta. Cuando la concentración de glucosa es baja, aumenta la concentración de CAMP, que fija el CAP. El promotor de los genes de metabolismo de lactosa queda expuesto, y la RNA polimerasa puede empezar la transcripción de estos genes. Relaciones microorganismo-hospedante El primer contacto entre el microorganismo y el hospedante es en el momento que el último nace. Tipos de relaciones entre microorganismo y hospedantes: Mutualismo. Los dos se benefician de la relación entre ambos, pero pueden vivir solos. Comensalismo. El microorganismo se beneficia de la relación; el hospedante es indiferente (no beneficia ni sufre). Parasitismo. El microorganismo se aprovecha del hospedante causándole problemas de salud. Colonización e infección La colonización se produce en el momento del nacimiento del animal. El microorganismo penetra el hospedante y empieza multiplicarse, normalmente sobre una superficie (por ejemplo, piel y mucosas). Eso no implica una invasión a tejidos ni daño tisular; no se produce ningún cambio en el hospedante, la colonización puede ser transitoria, si se pierde después de cierto tiempo. Hay otros tipos de colonización, que son permanentes y duran toda la vida del individuo. La infección es la invasión al hospedante por un microorganismo que se multiplica, pero eso no implica una enfermedad. Sin embargo, una enfermedad infecciosa normalmente empieza por infección. Hay infecciones positivas, que dan lugar a la microbiota norma del organismo. La infección puede ser subclínica, es decir, los microorganismos (que no pertenecen a la microbiota normal) se multiplican pero no se manifiesta ningún síntoma de enfermedad. El paso de infección a enfermedad depende del estado del animal y de las características del microorganismo – su virulencia. El microorganismo que produce la enfermedades conoce como agente etiológico o agente causal. 51 Relación microorganismos – hospedante Martes, 11 de enero de 2005 La enfermedad puede ser infecciosa y/o contagiosa, que no es lo mismo. Una enfermedad infecciosa está vinculada a la naturaleza del microorganismo que la causa; una enfermedad contagiosa es una enfermedad que puede transmitirse a otros organismos. Por ejemplo, la bacteria Clostridium tetani, que causa el tétanos, es una enfermedad infecciosa – hay que infectarse de la bacteria para padecer la enfermedad; el tétanos no es una enfermad contagiosa, ya que un animal infectado no transmite la enfermedad a otros animales. Patogenidad y virulencia La patogenidad es la capacidad de un microorganismo de producir enfermedad. Se distinguen dos tipos: Típicos, clásicos. Invariablemente cuando el animal se pone en contacto con el microorganismo se infecta de la enfermedad. Ejemplos: Bacillus anthracis (produce ántrax) Brucilla abortos. Oportunistas. En algunos casos pueden producir enfermedades, dependiendo de la situación del hospedante (su defensa y microbiota). Ejemplos: Pseudomonas aeruginosa (produce otitis) E. coli y Candida albicans (causan enfermedades intestinales en determinadas situaciones; en condiciones normales, pertenecen a la microbiota normal del organismo). La virulencia es el grado de patogenidad de un determinado microorganismo. La virulencia depende del género, especie y variedad. Por ejemplo, hay cepas de Salmonlla avirulentas, virulentas y altamente virulentas. Dos aspectos de la virulencia: Infectividad. Facilidad de establecer infección. Gravedad de las lesiones que produce el microorganismo. Un microorganismo con elevada infectividad que produce lesiones poco graves no es virulento. Las dos propiedades son independientes. Virus de resfriado común. Elevada infectividad, lesiones leves. Micobacterias. Baja infectividad, lesiones muy graves. Virus de la peste porcina africana. Elevada infectividad, lesiones producidas muy graves (puede provocar la muerte del animal). La infectividad se evalúa mediante la relación entre el número de microorganismos necesarios para producir la enfermedad (dosis efectiva); cuanto menor sea el número de microorganismos necesarios para producir la enfermedad, más infectiva es la enfermedad. Dosis efectiva o infectiva. El numero de microorganismos necesarios para producir la infección. DE50 – la dosis efectiva que produce la infección en 50% de una población testada. 52 Relación microorganismos – hospedante Martes, 11 de enero de 2005 Dosis letal. El numero de microorganismos necesarios para producir la muerte. DL50 – la dosis de microorganismos necesaria para producir la muerte de 50% de la población testada. Microbiota normal La microbiota normal forma la típica infección del animal, en la piel, mucosa etc. la microbiota normal de la piel contiene 102-105 microorganismos por cm. cuadrado, fundamentalmente Gram positivos: Estafilococos, COAG negativos. Estreptococos. Corinbacterias Levaduras Ciertos órganos, en animal sano, no contienen microorganismos – han de ser estériles (por ejemplo, riñón e hígado). Las mucosas presentan microbiota propia también, especialmente en el tracto intestinal: Bocal. Hay más anaerobios que aerobios (10:1) Estómago (pH 1.7-3.5) – 103-105 microorganismos por mililitro. El intestino grueso (109-1011/ml) tiene más microorganismos que el intestino delgado (103-108/ml). o Intestino delgado Enterobacterias (Gram negativos) Lactobacilos Enterococos o Intestino grueso – 99% anaerobios estrictos Fusobacterium Bacteroides Clostridium Tracto respiratorio, urinario, genital. Ectosimbiosis en rumiantes (rumen) Los microorganismos se encargan de la digestión del a celulosa ingerida por el rumiante. Su microbiota (anaerobiosis) consta de: 53 Relación microorganismos – hospedante Martes, 11 de enero de 2005 Bacterias, arqueas (1010/ml) o Ruminococcus o Fibrobacter Protozoos (106/ml) hongos o Celulolíticos: D-glucosa + celobiosa o Ácidos grasos (acético, propiónico) o Vitaminas o Digestión de microorganismos: aminoácidos, azucares. o Hidrogeno, metano, dióxido de carbono (200 litros/día) Modificaciones de los postulados de Koch Los postulados de Koch se ven modificados por algunas características de los microorganismos que conocemos hoy en día. 1. El microorganismo se ha de observar asociado a la enfermedad. Ejemplo: infección intestinal. o Bacterias diferentes producen enfermedades similares. o Graves de virulencia de la cepa. E. coli: cepas virulentas y avirulentas. o Presencia o ausencia de enfermedad, portadores, subclínica. o Animales inmunodeprimidos: oportunistas. 2. El microorganismo ha de ser aislado y crecer en cultivo puro. o Patógenos no cultivables. Respuesta inmunológica especifica – presencia de anticuerpos. Evidencia de material genético. 3. La enfermedad ha de poder ser reproducida en un animal susceptible, por inoculación del microorganismo del cultivo puro. o Dificultades de encontrar modelo adecuado. o Pérdida de virulencia después del cultivo 4. El microorganismo ha de encontrarse en la infección experimental producida en el animal susceptible y se ha de demostrar que es el mismo ser inoculado. 54 Mecanismos y estructuras de patogenidad Martes, 11 de enero de 2005 Mecanismos y estructuras de patogenidad Los microorganismos patógenos pueden adherirse a los tejidos; en función de su patogenidad pueden penetrar a los tejidos más profundos; pueden generar enfermedad por lesión tisular, por toxinas y por capacidad de invasión a tejidos más profundos. Factores de adhesión – adhesinas Los factores de adhesión son elementos estructurales localizados externamente en la bacteria. Cápsula y glicocálix (exopolisacáridos). Los sacáridos facilitan la adhesión a ciertos tejidos. Fimbrias. Facilitan la unión con receptores específicos en diferentes tipos de tejidos, a veces específicamente según la especie animal. Las fimbrias son estructuras proteicas, presentes sobre todo en bacterias Gram negativas. Las fimbrias reconocen los glicolípidos, que se encuentran en la superficie tisular. Estos azucares son los receptores de las fimbrias. Por ejemplo, bacterias con fimbrias manosa sensibles cultivadas en medio manosa positivo, pierden su virulencia, ya que todas sus fimbrias están bloqueadas por la manosa del medio. En algunas bacterias las fimbrias reconocen solo especies específicas. Por ejemplo, la bacteria E. coli K88 provoca la colibacilosis (diarrea) en cerdos. El microorganismo se adhiere al intestino delgado, liberando toxinas que aumentan la motilidad intestinal. Otro ejemplo es la Moraxella bovis, que forma parte de la microbiota transitoria de las vías respiratorias altas; allí no provoca ninguna enfermedad. Si llega a la córnea, que presenta receptores específicos, se adhiere a la superficie y puede llegara provocar queratoconjuntivitis. Fibrillas. Estructuras presentes en bacterias Gram positivas, parecidas a las fimbrias pero menos definidas. Están formadas por proteínas y ácidos grasos. Proteínas de membrana en los micoplasmas. Factores de invasión La invasión es facilitada por heridas, quemaduras, cirugía, vectores y factores de invasión. Los factores de invasión son enzimas que tienen los microorganismos. Hialuronidasa. Rompe el ácido hialurónico, que es abundante en el tejido conjuntivo. Presente en estafilococos, estreptococos y clostridios. Quinasa. Disuelve coágulos de fibrina, para intentar penetrar por heridas o salir del coágulo. Presente en estreptococos (S. pyogenes) y estafilococos (S. aureus). 55 Mecanismos y estructuras de patogenidad Martes, 11 de enero de 2005 Coagulasa. Coagula la sangre, encerrándose en un coágulo que lo protege del sistema inmunitario. Presente en estafilococos COAG positivos (más virulentos que COAG negativos). Colagenasa y elasatasa. Degradan el colágeno y elastina del tejido conjuntivo. Presentes en microorganismos que generan gangrena (clostridios) pero también se encuentra en microorganismos oportunistas. Toxinas Se distinguen dos clases de toxinas: Exotoxinas. Toxinas liberadas por la bacteria. Son proteínas sintetizadas y liberadas por la bacteria. Endotoxinas. Toxinas localizadas en la pared celular de la bacteria. Se denominan endotoxinas aunque no se encuentran en el interior de la bacteria. Exotoxinas Proteínas excretadas al medio. Al ser proteínas, hay formas fáciles de inactivarlas: Calor. las proteínas son termolábiles (se eliminan por calor; temperatura de 60-80º es suficiente para destruir la toxina). Enzimas protelíticas. Rompen la proteína y la inactivan. o Excepción: intoxicación alimentaria. Se ingiere la pretoxina que se rompe por hidrólisis en el digestivo. La hidrólisis activa la toxina. Formol. Inactiva la proteína dando el toxoide – proteína no tóxica pero inmunogénica – sigue siendo antigénica. Sirve en la producción de vacunas. Anticuerpos Las toxinas están codificadas en el material genético: el genóforo, el plásmido o en bacteriófagos que infectan la bacteria. Las exotoxinas son muy tóxicas – la dosis letal (DL50) en ratas es de 4·10-6 μg. Efectos biológicos Neurotoxinas. Tétanos (C. tetani) toxina tetánica. Enterotoxina. Cólera (V. cholerae) toxina colérica. Citotoxina. Carbúnculo (B. anthracis) provoca muerte celular. Endotoxinas 56 Mecanismos y estructuras de patogenidad Martes, 11 de enero de 2005 Las endotoxinas se encuentran en la membrana externa de las bacterias Gram negativos – los lipopolisacáridos. Se denominan endotoxinas porque la bacteria ha de romperse para liberar la toxina, por tanto se pensaba que se encuentra en el interior de la bacteria. Los macrófagos rompen la bacteria cuando la fagocitan, y así se liberan las endotoxinas, que provocan síntomas de intoxicación. Las endotoxinas son termoestables (aguantan temperaturas >100º). Su dosis letal es superior: DL50 = 0.1 mg. Efectos biológicos Activación de citoquinas, coagulación de sangre, fibrinolisis, fiebre, inflamación, diarrea, hemorragia, shock séptico. La activación de estos mecanismos es en función de la cantidad de toxina presente en el organismo. Quimioterapia antibacteriana y antimicótica Conceptos Agentes quimioterapéuticos. Compuestos que se utilizan para curar enfermedades. Agentes quimioterapéuticos microbianos. Compuestos que se utilizan para curar enfermedades producidas por microorganismos. o Antibióticos o Antifúngicos o Antivíricos Antibióticos. Compuestos producidos (originalmente) por microorganismos. Pueden ser: o Naturales. Penicilina G o Semi-sintéticos. Modificados químicamente - amoxicilina. o Sintéticos. Son antibióticos sencillos que se pueden sintetizar industrialmente sin la necesidad de cultivo microbiológico. Ejemplo: cloramfenicol. Quimioterapéuticos sintéticos. Productos que se producen por síntesis química. Ejemplo: sulfamidas. Agentes antimicrobianos. Productos con actividad antimicrobiana. Incluye antibióticos, quimioterapéuticos, desinfectantes (utilizados pos superficies) y antisépticos (utilizados en tejidos). Productos de amplio espectro. Afectan gran variedad de bacterias. Ejemplo: tetraciclinas, afectan bacterias Gram positivas y negativas, micoplasmas, rickettsias y clamidia. Productos de espectro reducido. Afectan pocos microorganismos. Por ejemplo, la penicilina G afecta sólo bacterias Gram negativas. 57 Quimioterapia antibacteriana y antimicótica Martes, 30 de noviembre de 2004 Bactericida. Provoca la muerte de la bacteria. Ejemplo: penicilina. Bacteriostático. Inhibe el crecimiento del microorganismo pero no lo mata. Ejemplo: tetraciclinas. Origen de la quimioterapia antimicrobiana Quimioterapéuticos P. Ehrlich, 1904. descubrió que el tripano rojo cura la tripanosomiasis, y que el salvarsan se puede aplicar para tratar sífilis. G. Domagk, 1935. descubrió el prontosil (que es el origen de las sulfamidas). Antibióticos A. Fleming, 1928. descubrió la penicilina G (que fue comercializada a 1940 por Floreyl & Chain). S. Waksman, 1944. descubrió la estreptomicina. 1953. descubrimiento del cloramfenicol, neomicina, tetraciclina. Productos sintéticos y semi-sintéticos. Mecanismos de acción de antibacterianos Inhibición de la síntesis de pared celular La inhibición de la síntesis de la pared celular es provocada por un rango de antibacterianos, como la penicilina y cefalosporinas (βlactámicos). Estos antibacterianos inhiben las enzimas transpeptidasas (PBS) que crean las cadenas peptídicas que dan rigidez a la pared. Estos antibacterianos también provocan la síntesis y activación de autolisinas, que producen la autólisis de la bacteria. Alteración de membrana celular La alteración de membrana celular es provocada por polimixina. El antibacteriano penetra la membrana plasmática de la bacteria cambiando su permeabilidad, lo que provoca la muerte de la bacteria. 58 Quimioterapia antibacteriana y antimicótica Martes, 30 de noviembre de 2004 Inhibición de síntesis de DNA Se basa en la diferencia de síntesis de DNA en eucariotas y procariotas. Quinolonas. Inhiben la DNA girasa que abre la doble hélice de DNA antes de la duplicación. Rifamicina. Bloquea la síntesis de RNA parando la síntesis de mRNA y proteínas. Inhibición de síntesis de proteínas Unión a la subunidad 50S o Eritromicina. Inhibe la elongación de la cadena peptídica. o Cloramfenicol. Bloquea la formación del enlace peptídico. Unión a la subunidad 30S o Tetraciclina. Inhibe la unión aminoácido-tRNA-ribosoma. o Aminoglucosidos. Estreptomicina, gentamicina. Provocan errores en la síntesis de proteínas, lo que produce proteínas no útiles. Antagonismo metabólico – sulfamidas Inhibición de la síntesis del ácido fólico. El ácido fólico es necesario para la síntesis de las bases nitrogenadas (del DNA y RNA). La inhibición de la síntesis de ácido fólico no causa daño a los animales ya que éstos consumen el ácido fólico con su dieta, porque no son capaces de sintetizarlo. 59