INGENIERÍA GENÉTICA, MANIPULACIÓN GENÉTICA Y

INGENIERÍA GENÉTICA. MANIPULACIÓN GENÉTICA
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE
Bajo la denominación de Genética molecular se engloban procesos y fenómenos
relacionado con el material genético como son la replicación, transcripción, traducción, el
código genético y las mutaciones. La Genética molecular empieza en 1953 cuando Watson y
Crick descubren la estructura del ADN, que es la base de disciplinas absolutamente
revolucionarios en la Biología y podríamos decir que en toda la Ciencia.
Más adelante, en 1970 Smith y Wilcox descubren las enzimas de restricción, Temin
y Baltimore descubren la retrotranscripción, en 1983 K.B Mullis desarrolla la PCR, se
desarrollan técnicas de secuenciación de ADN, y otras muchas más. Todas estas técnicas
constituyen la Ingeniería Genética (= Manipulación genética) que permitir manipular el
genoma de un ser vivo. Esta manipulación consiste en:





Introducir genes (normalmente de otro ser vivo) en un genoma.
Eliminar genes.
Modificar su secuencia de bases
Secuenciar genes
Clonar genes
Realmente habría que denominar a dichas técnicas Tecnología
Recombinante, ya que con ellas se obtienen nuevos ADN que no existían.
del
ADN
Si aplicamos estos métodos y técnicas a los seres vivos para obtener un producto o
servicio, hablamos de BIOTECNOLOGÍA, que ha experimentado una auténtica revolución
gracias a ellos. Por ejemplo, la insulina o la hormona del crecimiento que se inyectan los
diabéticos hoy día es la humana, pero la fabrican bacterias ( E. coli), también se puede citar
muchas vacunas. Por tanto la Ingeniería Genética se sitúa entre la Genética Molecular y la
Biotecnología. Es decir, para poder fabricar insulina con bacterias antes hay que manipular
el gen humano (localizarlo, cortarlo, clonarlo e insertarlo en la bacteria, es decir, hacer
ingeniería genética).
Genética
sirve
Molecular de base para la
Manipulación
genética
se aplica
en la
Biotecnología
Algunos hechos destacables de la I.G. y la biotecnología son:





1977 Herbert Boyer inserta el gen de la somatostatina en el ADN de E. Coli,
1978 en EE.UU. se logra producir insulina humana en bacterias y en 1983 se
comercializa. 1980 Weismann, en Suiza, sintetiza interferón con bacterias.
1982 Se obtienen ratones transgénicos gigantes a partir de óvulos a los que se
inyectó el gen de la hormona del crecimiento.
1984 Obtención por biotecnología de la vacuna contra la hepatitis B
1985 Alec Jeffreys, en Gran Bretaña desarrolla la técnica de la “huella genética” ,
que permite identificar personas a partir de muestras como pelo, sangre, esperma,
INGENIERÍA GENÉTICA 1





etc. En 1995 sirve para exculpar a un jugador de futbol americano del asesinato de
su mujer.
1990 El médico French Anderson inicia la primera terapia génica en un niña con una
inmunodeficiencia. Comienza el P.G.H. de manera oficial.
1995 Secuenciación del genoma de la levadura Sacharomyces cerevisiae
1997 Secuenciación del genoma de la bacteria Escherichia coli
1998 Secuenciación del genoma del gusano Caenorhabditis elegans, y de las
bacterias que producen el tifus y la tuberculosis.
2000 La empresa Celera Genomics anuncia que ha terminado la secuenciación
completa dl genoma humano.
MANIPULACIÓN DEL ADN
El hombre ha manipulado desde siempre el ADN de las especies y así han aparecido
variedades de animales domésticos, frutales, cereales, etc., a veces por intercambio entre
especies que de forma natural nunca se hubieran cruzado. Ha seleccionado individuos con
determinados caracteres y aquellos que les interesaba los ha cruzado de manera selectiva
(cruzamientos selectivos.) Es la selección artificial. Es un proceso lento y no siempre se
obtenían los resultados esperados.
Desde el descubrimiento de Watson y Crick hasta 1970 la manipulación del ADN
fue muy difícil. A partir de 1970 irrumpen con extraordinario éxito unas técnicas que
permiten manipular y modificar el ADN de los organismos con facilidad.
Son las TÉCNICAS DE INGENIERIA GENÉTICA o TECNOLOGÍA DEL ADN
RECOMBINANTE. Sus ventajas, frente a los procedimientos clásicos son muchas:
 Mucho más rápido y preciso.
 Se transmiten sólo los genes deseados.
 Obtención de productos en mucho mayor cantidad.

Gracias estos métodos podemos obtener fragmentos de ADN idénticos en
cantidades ilimitadas (clonación), determinar la secuencia de los genes, alterarlos, insertar
genes de una especie en otra distinta, bien en sus células somáticas o germinales.
Algunas de estas técnicas son:
1.
Tomar o aislar fragmentos específicos de ADN de un organismo, para ello se
cortan en puntos concretos. Es decir, fragmentar o cortar el ADN.
2. Unión de fragmentos de ADN.
3. Clonación del ADN, para tener suficientes copias y estudiarlo mejor, o para que
se exprese su proteína en grandes cantidades. Se utilizan VECTORES DE
CLONACIÓN. También se puede hacer con la técnica llamada PCR (Reaction
Chain Polymerase = Reacción en cadena de la Polimerasa.)
4. Insertar un gen en el ADN de otro ser vivo para que se exprese en él, o incluso
en sus células germinales para que se transmita a la descendencia. Es la
transformación, y el ADN es recombinante. Así se obtienen ORGANISMOS
MODIFICADOS GENÉTICAMENTE ( = O.M.G.) o TRANSGÉNICOS. Para
INGENIERÍA GENÉTICA 2
insertarlo en la célula huésped primero se inserta en unos VECTORES DE
TRANSMISIÓN = DE EXPRESIÓN.
5. Identificación y secuenciación, y modificación para mejorar el producto, si su
producto tiene interés industrial, farmaceútico, agrícola, etc.
Para manipular el ADN se utilizan herramientas fundamentales: las enzimas de
restricción o restrictasas (cortan), las ligasas (unen) y los vectores de transmisión
(transportan genes y los insertan en ADN distintos, es decir, de otras especies)
1.- OBTENCIÓN DE FRAGMENTOS DE ADN. CORTE DEL ADN
Se puede hacer utilizando dos tipos de enzimas: las enzimas de restricción y las
retrotranscriptasa.
Enzimas de retricción
En 1970 se descubrió que las bacterias tienen un sistema de defensa para eliminar
el ADN extraño que les infectaba. Eran unas enzimas que cortaban el ADN en unos puntos
concretos de la secuencia (dianas de restricción, formadas por cuatro u ocho bases).
Se denominan enzimas de restricción, restrictasas o endonucleasas de
restricción. Reconocen puntos concretos del ADN (secuencias palindrómicas o capicúas) y lo
cortan ahí. Actúan como tijeras moleculares. Se conocen más de 100 distintas y cada una
corta en una secuencia específica a cada hebra de ADN.
El corte puede ser de dos tipos y así se originan:
Extremos romos o lisos,
Extremos cohesivos o pegajosos o escalonado, así puede unirse a otros trozos
que sean complementarios.


Enzima








Eco RI
Eco RII
Bam HI
Hae III
Hind III
Kpn I
Sma I
Bsu RI
Bacteria
Tipo de extremo
Escherichia coli
Escherichia coli
Bacillus amyloquefaciens
Haemophilus aegyptius
Haemophilus influenzae Rd
Klebsiella pneumoniae
Serratia marcenscens
Bacillus subtitlis
cohesivos
cohesivos
romos
cohesivos
cohesivos
romos
Al cortar una molécula de ADN con distintas enzimas de restricción se obtienen una
mezcla de fragmentos de distinto tamaño. Los fragmentos obtenidos se pueden separar por
un método llamado electroforesis, basándose en la capacidad de desplazamiento en un
campo eléctrico según su tamaño y de carga eléctrica. Las pequeñas recorren una distancia
mayor y las largas menor. Los fragmentos se mueven sobre una lámina de gel de agarosa.
INGENIERÍA GENÉTICA 3
Después se tiñen con un colorante y se obtienen una bandas. Cada banda corresponde a un
tamaño medido en pares de bases.
El tamaño de los fragmentos se suele expresar en KILOBASES (1000 nucleótidos) si
son cadenas monocatenarias, o 1000 pares de bases si se habla de bicatenarias. Si el
tamaño es inferior a 1000 bases se habla de bases o pares de bases.
Transcriptasa inversa
También se puede obtener el fragmento de ADN, en este caso ADN estructural, es
decir, que codifica una proteína o enzima, si se conoce su secuencia de aminoácidos o la de
su ARNm (éste se sintetiza “in vitro” o se aísla de la célula por hibridación). Una vez
aislado, la transcriptasa inversa lee este ARNm y sintetiza se obtiene el ADN que lo
codifica, llamado ADNc o complementario, que es un ADN sin intrones. Este método es muy
importante si el gen que se introduce es de eucariontes y se introduce en una bacteria. El
gen introducido no tiene intrones.
HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Por medio de la hibridación de ácidos nucleicos podemos localizar genes en el ADN.
Hibridamos el ARNm sin intrones con el ADN y con fluorescencia o autorradiografía
(isótopos) localizamos el gen en el cromosoma.
CLONACIÓN DEL ADN
Para manipular el ADN es necesario disponer de una gran cantidad de moléculas.
Esto se consigue con la clonación. Se puede hacer de dos formas:


Clonación molecular o génica, utilizando células.
Amplificación por PCR, sin utilizar células.
Clonación molecular o génica
La clonación molecular se hace utilizando células hospedadoras, bacterias
normalmente. Es decir, se inserta el ADN deseado en su ADN y cuando la bacteria se
reproduzca hará múltiples copias de ese ADN.
Para ello, una vez aislado el ADN hay que insertarlo en el ADN bacteriano. Para ello
se utilizan los vectores de clonación o de clonado. Estos vectores son pequeños moléculas
de ADN que tienen capacidad de autorreplicación independientemente del ADN de la célula
huésped, como plásmidos, bacteriófagos y cósmidos. El gen deseado hay que insertarlo
primero en estos vectores.
Estos vectores llevan además unos genes llamados marcadores que sirven para
detectar o identificar las células que han incorporado los vectores. Estos marcadores son
genes de resistencia a antibióticos (si se inserta en una bacteria) o genes de
bioluminiscencia (si se inserta en una eucarionte). Los plásmidos naturales no tienen estos
marcadores, sino que se añaden artificialmente.
INGENIERÍA GENÉTICA 4
¿Cómo se inserta el vector en el ADN de la célula huésped? Se corta el ADN del
vector y el que contiene el gen deseado con la misma restrictasa y luego se unen con la
ligasa. Así tenemos un ADN recombinante, ya que procede de dos moléculas distintas.
La introducción de un ADN extraño en bacterias, ya sea de forma natural o por
vectores, se llama transformación. Si el vector es un virus, la transformación se llama
transducción. Si se hace en eucarionte se llama transfección, y si se inserta en las células
germinales de estos se llama transgénesis y los descendientes de estos organismos,
transgénicos o modificados genéticamente (OMG). Por ejemplo, uno de los vectores más
utilizados en plantas es la bacteria Agrobacterium tumafaciens, y en células animales, el
virus SV40.
Una vez que las bacterias se han transformado, se las pasa a un medio de cultivo
para que se multipliquen. Al mismo tiempo se replican los vectores de clonado y así se
obtienen múltiples copias del gen deseado. Cada grupo de bacterias que procedan de una
sola, llevarán ese vector y ese gen, constituye un clon. Así se obtienen tantos clones como
fragmentos de ADN se hayan insertado en las bacterias. El conjunto de clones obtenido se
llama biblioteca genómica o genotecas.
SELECCIÓN DE CLONES o TRANSFORMANTES
De todos los clones obtenidos sólo uno portará el gen deseado. ¿Cómo se localiza o
se extrae de la biblioteca genómica?. Es decir, hay que localizar un fragmento de ADN,
que está dentro de una célula. El método depende del vector utilizado:


Transfiriendo los clones a cultivos con antibióticos. El que sobreviva es el que
porta el marcador de resistencia.
Otro método muy usado es la hibridación de ácidos nucleicos, utilizando una
sonda.
La sonda es un fragmento de ADN o ARN de cadena sencilla complementaria a la secuencia
del fragmento que queremos localizar. Esta sonda puede ser:


El ARNm correspondiente a la proteína que codifica el en buscado, y que se
ha sintetizado in vitro.
Un ADN llamado complementario (ADNc), obtenido a partir del ARNm por la
transcriptasa inversa.
La sonda lleva una molécula (reporter) que puede un isótopo radioactivo o una sustancia
fluorescente. Sirve para “verla” por medio de autorradiografía (si lleva isótopos) o con
microcosopio de florescencia si lleva sustancia fluorescente. VER PÁGINA 215 BRUÑO. La
sonda se añade al conjunto de clones y se espera que hibride.
Si se quiere clonar el gen de la insulina humana y luego secuenciarlo, la sonda se prepara a
partir de células del páncreas. Se aísla de ellas el ARNm de la insulina, luego con la
transcriptasa inversa (y con nucleótidos marcados con isótopos radiactivos) se obtiene el
ADNc, que contiene únicamente secuencias codificantes, sin intrones porque procede del
ARNm maduro.
INGENIERÍA GENÉTICA 5
BIBLIOTECAS DE ADNc Y VECTORES DE EXPRESIÓN
VER BRUÑO PAGINA 216
Podemos obtener genes sin intrones.
MÉTODO ACTUAL DE CLONACIÓN DE ADN.
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA. PCR.
AMPLIFICACIÓN
DEL
ADN.
Para manipular el DNA se necesita grandes cantidades. En la actualidad se clona
ADN sin necesidad de utilizar células, por tanto in vitro, con un método desarrollado en
1983 por K.B. Mullis, denominado Reacción en Cadena de la Polimerasa, (Polymerase Chain
Reaction o PCR). Es una técnica mucho más rápida y productiva: a partir de una sola cadena
de DNA en una tarde se pueden obtener hasta 100.000 millones de moléculas idénticas.
El mecanismo es el mismo que utilizan las células cuando replican el DNA. Es decir,
reproduce in vitro lo que ocurre dentro de la célula. Se utiliza la DNA polimerasa, que a
partir de una cadena molde fabricará dos cadenas hijas idénticas. Para esto hay que
suministrarlas:
La cadena molde, que es una de las cadenas de la doble hélice
Desoxirribonucleótidos
Cebador



El mecanismo es simple: consiste en repetir ciclos de síntesis. Cada ciclo consta de:
1.
Desnaturalización de la doble cadena a copiar, con temperaturas altas. Cada
hebra sencilla servirá de molde.
2. Lectura de la hebra molde
3. Incorporación de nucleótidos
4. Mantener temperatura muy elevada durante todo el proceso
De esta manera, en el primer ciclo se obtienen dos cadenas, en el segundo, cuatro,
en el tercero 8, etc. El número de moléculas obtenidas se obtiene por esta fórmula N = 2 n
donde n es el número de ciclos realizados. Cada ciclo equivale a una replicación. Así al cabo
de 20 ciclos se obtienen 1048576 moléculas de ADN.
Cada ciclo dura unos 5 minutos, ya para que se obtenga una amplificación útil se necesita 20
ciclos. Hoy día se hace de manera automatizada.
La DNA polimerasa utilizada al principio era la de Escherichia coli. Pero al elevar la
temperatura para la desnaturalización del DNA la enzima se desnaturalizaba y había que
reponerla en cada ciclo. Esto encarecía y ralentizaba el proceso. Esto se solucionó al
descubrirse las bacterias termófilas (extremófilas) que vivían en aguas termales, cuyas
proteínas soportan temperaturas elevadas. Se utilizó la polimerasa de Thermus aquaticus,
que soportaba hasta 95 ºC. Esta polimerasa se denominó Taq polimerasa.
INGENIERÍA GENÉTICA 6
La PCR tiene varias aplicaciones: en criminología sirve para obtener copias de la
muestra de ADN de los sospechosos (huella genética), pruebas de paternidad, y
recuperación de ADNs de especies extinguidas o a punto de extinguirse (lince, oso,
bucardo, etc).
INGENIERÍA GENÉTICA 7