El fríjol es un alimento con un gran potencial

IDENTIFICACIÒN DE MATERIALES CON MEJORES
CARACTERÌSTICAS NUTRIMENTALES
EN FRIJOL
(11-2005-3356)
Fundación Guanajuato Produce A.C.
Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del IPN, Unidad Irapuato
Responsable:
Dr. Andrés Cruz Hernández
Participantes
Dr. Octavio Paredes López
MC. Maribel Valdez Morales
Dra. Laura Gabriela Espinosa Alonso
IBQ. Veremundo Hernández Zequinely
Presupuesto autorizado:
Presupuesto ejercido:
Periodo:
Julio 2006 a Junio, 2007
Avance del proyecto:
100%
CRACTERÍSTICAS DEL FRIJOL COMÚN
El fríjol es un alimento con un gran potencial nutricional y nutracéutico; es una
fuente importante de proteína, calorías, vitaminas del complejo B, minerales, fibra
dietaria y antioxidantes. Su carácter nutricional se favorece al ser consumido en
combinación con el maíz en forma de tortillas, complementándose el valor de la
proteína consumida. El fríjol ha sido uno de los alimentos básicos desde tiempos
prehispánicos y en la actualidad continúa siendo un alimento consumido ampliamente
en América Latina; sin embargo, los países desarrollados enfocan su interés hacia esta
leguminosa debido a que aporta importantes beneficios a la salud (Guzmán-Maldonado,
y Paredes-López, 1998). Por otro lado, el fríjol contiene ciertos componentes tales como
taninos, oligosacáridos, ácido fítico e inhibidores de proteasas que reducen su valor
nutritivo así como su aceptación en la dieta debido a la flatulencia que provoca; estos
componentes pueden inactivar o remover en buena proporción durante el remojo y la
cocción. Sin embargo, se ha propuesto que tales componentes aportan un efecto positivo
a la salud ya que pueden actuar en el organismo como antioxidantes y prebióticos. El
fríjol común ha sido reconocido por sus numerosos efectos benéficos sobre la salud,
incluyendo la reducción del contenido de colesterol en sangre, el aporte de tolerancia a
la glucosa, disminución de enfermedades cardiovasculares y prevención de ciertos tipos
de cáncer (Messina, 1999).
El fríjol es un alimento de gran importancia en la dieta en nuestro país, es parte
de la dieta básica de los mexicanos y posee un sin numero de características que lo
hacen un alimento completo en la dieta, ya que brinda un importante contenido de
proteína, carbohidratos, minerales tales como hierro, calcio y zinc, vitaminas del
complejo B, fibra, y antioxidantes. Sin embargo, considerando la problemática de salud
debido a una mala nutrición así como la obesidad resultado de los malos hábitos
alimenticios y la falta de actividad física, se considera necesario incrementar el aporte
nutricional y nutracéutico de este cultivo, que ayudaría en gran medida a la prevención
de los problemas antes mencionados. Para lograr tal objetivo es fundamental conocer el
aporte brindado por los frijoles silvestres, que se consideran un gran acervo genético
con el cual mejorar las propiedades nutricionales y nutracéuticas del fríjol cultivado
que se consume en la actualidad.
En cuanto a su valor nutricional las leguminosas no contienen colesterol y son
buenas fuentes de carbohidratos y fibra contienen además cantidades razonables de
proteínas, vitaminas y ciertos minerales, además de ácidos grasos libres poliinsaturados.
Por su alto contenido de lisina, las proteínas del fríjol muestran un efecto
complementario cuando se consumen con proteínas de cereales, los cuales aportan parte
de los aminoácidos azufrados (metionina y cistina) deficientes en las leguminosas. Así,
la combinación de maíz y fríjol consumida en México y de fríjol con arroz en Brasil
constituyen excelentes mezclas en términos de requerimientos de aminoácidos
esenciales.
Los hidratos de carbono representan el principal constituyente del fríjol (6070%). Como se señalo antes, el fríjol es una excelente fuente de proteínas, contiene
poca grasa (1-3%) y cantidades apreciables de minerales. El almidón y la fibra dietética
constituyen la masa principal de los carbohidratos del fríjol.
Las proteínas del fríjol son deficientes en aminoácidos azufrados, pero son ricos
en lisina. La metionina en siempre el primer aminoácido limitante; existe un rango muy
amplio en los niveles de este aminoácido, de 0.4 a 3.2 g /16 g N. La proporción relativa
en fríjol de albúminas es de 11-31% y globulinas de 46-81%. Las prolaminas y
gluteninas aparecen en menor proporción, se encuentran en un 4 y 2% respectivamente.
La clase predominante de lípidos en fríjol son los lípidos neutros, principalmente
constituidos por triacilgliceridos y pequeñas porciones de ácidos grasos libres, esteroles
y sus esteres. Los fosfolipidos y glucolipidos, que son los componentes esenciales de las
membranas están siempre presentes en cantidades apreciables. Los lípidos neutros y
fosfolipidos varían entre un 32 a 50% y de 24 a 35% del total de los lípidos,
respectivamente. Los glucolipidos constituyen la menor parte, un 10%. Los principales
ácidos en los lípidos de algunas leguminosas estudiadas son el ácido palmitito, oleico y
linoleico.
La composición mineral del fríjol sugiere que es una buena fuente de algunos
elementos como Ca, Cu, Fe, K, Mg, Mn, P y Zn. En el fríjol se encuentran
principalmente vitaminas solubles en agua, en especial complejo B. se estima que una
taza de fríjol cocido (170 G aproximadamente) con 65 de humedad puede proporcionar
los requerimientos diarios de minerales y vitaminas en las siguientes cifras: 10% Ca y
Zn, 20% de Cu y K, 22% de Mg y Mn, 30% Fe, 10% niacina y riboflavina, 10-12% de
piridoxina, 25% tiamina y 30% de ácido fólico.
BIODIVERSIDAD
La diversidad biológica se refiere a la variabilidad existente entre los organismos
vivos en función de los genes dentro de una misma especie, a la variación entre especies
diferentes que integran los diversos ecosistemas, constituyendo los tres niveles
fundamentales de organización biológica (Moreno, 2001). La variación biológica es
sumamente importante ya que determina la forma en que una población interactúa con
su ambiente y con otras especies, cómo evoluciona y persiste a través del tiempo
(Tilman, 2006). La diversidad genética surge a nivel molecular y consiste en los
cambios que ocurren en los ácidos nucleicos que pueden repercutir en el fenotipo y
puede darse a nivel de organismos independientes y de poblaciones. La estructura
genética de una población Mendeliana puede describirse por medio de las frecuencias
alélicas de cada locus, así como de las frecuencias de los diferentes genotipos en una
población. Las diferencias en las frecuencias alélicas miden la cantidad de variación en
una población y las frecuencias genotípicas muestran como la variación genética de una
población está distribuida entre sus miembros. Sin embargo, existen fuerzas evolutivas
que pueden cambiar la estructura genética de una población. El flujo génico implica la
introducción de alelos nuevos en la población y generalmente aumenta la diversidad
genética. Los cambios en las frecuencias génicas se producirán ya sea por la presencia
de mayor número de copias de un alelo ya presente en la población o por introducción
de nuevos alelos. La deriva génica se refiere a las fluctuaciones en las frecuencias
alélicas que ocurren por casualidad (en particular en las poblaciones pequeñas) como
resultado del muestreo al azar entre los gametos. La deriva disminuye la diversidad
dentro de una población porque tiende a causar la pérdida de alelos poco usuales,
reduciendo el número total de alelos dando lugar a la formación de los llamados cuellos
de botella. El apareamiento dirigido puede alterar también la frecuencia alélica,
pudiendo sobre expresar los homocigotos dejando a los heterocigotos poco
representados en la población y por tanto una disminución de la variabilidad genética.
Finalmente, la selección natural es el mecanismo por el cual los individuos o las
poblaciones con los alelos más exitosos logran adaptarse a las nuevas condiciones
ambientales, trayendo como resultado un cambio en la frecuencia alélica. La selección
natural puede ser estabilizante, si se conserva el promedio de las características de una
población; direccional cuando unos individuos contribuyen más en la descendencia y las
características de la nueva generación se mantienen a un extremo; o disruptiva cuando
dos grupos de individuos a ambos extremos de la población contribuyen más con la
descendencia y se producen dos picos en la distribución de los alelos en la población
(Purves et al., 2004). Además de los mecanismos evolutivos antes mencionados que
varían la frecuencia alélica y que en algunos casos provocan la pérdida de la diversidad,
también existen otros mecanismos que contribuyen con el aumento de la diversidad. Las
mutaciones son las principales responsables de la variación genética ya que de manera
aleatoria pueden originar un cambio en el ADN. Son ventajosas cuando restauran alelos
que fueron removidos en las poblaciones por algún agente evolutivo y neutrales cuando
no afectan la región de un locus y por tanto la capacidad del individuo o su
adaptabilidad. Por otro lado, la recombinación sexual genera una interminable
combinación de alelos y por tanto una gran variedad de nuevos genotipos que
incrementan el potencial evolutivo en las poblaciones. La obtención de nuevos
genotipos incrementa la posibilidad de que éstos puedan ser más exitosos, aún en los
ambientes más impredecibles (Purves et al., 2004).
Para tratar de estimar la diversidad biológica se deben de considerar tres diferentes
tipos de diversidad: α, β, y γ. La diversidad α se refiere a la riqueza de las especies, es
decir, al número total y homogeneidad de especies distintas localizadas en un área
geográfica determinada. El cambio gradual que presentan las especies entre las
diferentes comunidades a través de un gradiente de hábitats se denomina diversidad β y
los factores biogeográficos, topográficos y climáticos que influyen en la variación de los
hábitats y que repercuten en la diversidad alfa y beta consituyen la diversidad γ
(Moreno, 2000; Neyra González y Durand Smith, 1998).
Se ha estimado que el número de especies en el mundo oscila entre dos y cien
millones y sólo 1.4 millones han sido descritas. Por otro lado, entendiendo como
población una especie contenida en una entidad geográfica, que puede ser distinguida
ecológica y genéticamente de otras. Hughes et al., (1997) estimaron que el número de
poblaciones del planeta puede ser de 1.1 hasta 6.6x109. Debemos tomar en cuenta que
las estimaciones de la diversidad son aparentemente muy grandes; sin embargo, está
expuesta a muchos factores que pueden ponerla en peligro. La mayor riqueza genética se
localiza en los trópicos, donde coexisten las mejores condiciones climáticas para
suministro de energía, alimento, establecimiento, estabilidad y heterogeneidad del
hábitat, interacciones interespecíficas, equilibrio entre el tamaño de población y su
espacio geográfico, etc., dando como resultando altas tasas de especiación y bajas
probabilidades de extinción (Purvis y Hector, 2000).
Importancia y usos de la biodiversidad
Los recursos fitogenéticos para la alimentación y la agricultura constituyen la base
biológica de la seguridad alimentaria mundial y sustentan directa o indirectamente la
vida de toda la población mundial ya que proporcionan alimentos, medicamentos,
forrajes para los animales domésticos, fibras, vestido, vivienda, energía y un gran
número de otros productos y servicios que son el sustento de la vida. Son la materia
prima utilizada para la producción de nuevos cultivares y especies. Constituyen la
reserva de adaptabilidad genética que sirve de protección contra cambios ambientales y
económicos que pueden ser nocivos. La diversidad genética de los cultivos comprende
las variedades tradicionales, los cultivares modernos y las especies silvestres
emparentadas con los cultivos modernos (www.ipgri.org).
Pérdida y mantenimiento de la biodiversidad
Uno de los principales problemas que atrajo la atención de la sociedad a finales
del siglo XX fue la pérdida de los limitados recursos biológicos y genéticos como
consecuencia de las actividades humanas que contribuyen directamente con la “erosión
genética”, proceso continuo de pérdida de la biodiversidad. Dentro de las principales
causas de reducción de la biodiversidad debido a la actividad humana tenemos:
crecimiento desmedido de la población que trae como consecuencia destrucción de
reservas naturales para su utilización como vivienda, extensión de áreas de cultivo a fin
de abastecer los requerimientos de alimento; así mismo, cambios climáticos resultado de
urbanización, industrialización y contaminación. Todo esto ha provocando la
destrucción de hábitats y la reducción de los centros de origen y diversificación de los
cultivos. Así mismo, la sustitución de cultivos tradicionales por cultivares mejorados, y
por tanto, la distribución de pocos genotipos da lugar a los llamados “cuellos de botella”,
donde la sub-utilización de materiales estrechamente relacionados con una base genética
reducida provoca la disminución de la diversidad genética (Tanksley y McCouch, 1997).
Por otro lado, no se ha dado la debida importancia al resguardo y utilización de las
fuentes genéticas, y se sabe que la riqueza genética de los primeros ancestros ha sido
descuidada y se ha perdido. Por muchos años, no se contemplaron en el mejoramiento;
sin embargo, en la actualidad se sabe que cuando se transfieren genes de organismos
primitivos hacia cultivados resurge un cultivo con mejores características, como ha sido
demostrado en trigo, soya, avena, papa, tomate y cebada (Harlan, 1987). A lo largo de la
historia, el ser humano ha utilizado miles de especies vegetales para su alimentación; sin
embargo, en la actualidad sólo 150 especies de plantas se cultivan y sólo 12
proporcionan alrededor del 75% de los alimentos consumidos. Arroz, maíz, trigo y papa
producen más de la mitad de nuestros alimentos, por lo que muchos cultivos locales
tradicionalmente importantes para alimentar a los sectores más pobres de la sociedad han
sido descuidados o abandonados, incrementado así la vulnerabilidad de la agricultura y
empobreciendo la alimentación humana (www.ipgri.org).
Aunque la mayor parte de la diversidad biológica se encuentra en las zonas
tropicales y subtropicales cuyos países son los más ricos en genes, paradójicamente son
muchas veces los más pobres en términos económicos. A pesar de la importancia vital
que tienen para la supervivencia humana, los recursos genéticos se están perdiendo a una
velocidad alarmante debido a la falta de incentivos para desarrollarlos y conservarlos. El
Instituto internacional de fuentes genéticas de plantas (IPGRI) ha planteado diferentes
estrategias para conservar la biodiversidad, una de ellas se basa en el compromiso
internacional de reconocer la enorme contribución de los agricultores, las comunidades
locales e indígenas, y exhorta a los gobiernos a salvaguardar y promover los derechos de
los agricultores. Estos incluyen la protección de sus conocimientos tradicionales, el
derecho a la participación equitativa en la distribución de beneficios por el uso de los
recursos, así como el derecho a participar en la toma de decisiones relativas a recursos
filogenéticos y a la conservación in situ y ex situ. De forma particular, los recursos
genéticos o semillas de los cultivos de interés en la alimentación del hombre, representan
una fuente importante de variabilidad que garantiza la seguridad alimentaria. Estos
materiales desde hace un siglo han sido colectados y preservados en bancos de
germoplasma. El principal objetivo de los bancos de germoplasma ha sido recolectar,
mantener, evaluar y utilizar la diversidad genética de las semillas como fuente genética
para el mejoramiento de los cultivos, sin embargo, ha sido una tarea difícil (Tanksley y
McCouch, 1997). Uno de los organismos internacionales que supervisan los esfuerzos
que en el mundo se están realizando para recolectar y conservar la diversidad genética es
el Instituto Internacional de Recursos Genéticos Vegetales, y hasta 1997 se reportaron
más de 700 bancos de germoplasma que contienen más de 2.5 millones de accesiones de
importancia económica, entre ellas frijol, arroz, maíz, algodón, soya, papa, trigo y
jitomate (Tanksley y McCouch, 1997). Para que un banco de germoplasma se mantenga
funcional se requiere de ciertas estrategias de conservación in situ y ex situ. Las
estrategias in situ mantienen la biodiversidad en su entorno natural y en estado silvestre.
En el caso de los cultivos de interés nutricional, se considera una estrategia de
conservación in situ el hecho de que muchos campesinos cultivan desde hace muchas
generaciones materiales criollos, manteniendo una parte de la diversidad genética
contenida en éste tipo de materiales. Para el caso de los materiales silvestres resulta
complicado el mantenimiento in situ, debido a su amplia distribución y a que
generalmente se localizan en zonas poco frecuentadas por el hombre, de tal manera que
la conservación de éstos materiales se hace de manera ex situ. Las estrategias ex situ se
emplean sobre todo en la recuperación y rehabilitación de especies amenazadas con el
fin de introducirlas nuevamente a sus hábitats naturales. La conservación se realiza fuera
de su hábitat natural mediante el uso de invernaderos, jardines botánicos y bancos de
germoplasma (CONABIO, 2002). El Centro Internacional de Agricultura Tropical
(CIAT) cuenta con un banco de germoplasma de frijol con más de 38,000 accesiones
domesticadas y más de 1,500 accesiones silvestres. En México se ha estimado que el
Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrícolas y Pecuarias (INIFAP) cuenta
con cerca de 12,000 colectas del género Phaseolus, la mayoría frijol común cultivado,
aunque también posee un poco más de 500 accesiones de frijol silvestre y enmalezado;
sin embargo, tales materiales no han sido caracterizadas y no se puede asegurar que se
haya recopilado toda la diversidad existente en nuestro país. De ahí resurge el interés
para analizar sistemáticamente las colectas existentes y definir si existen materiales
duplicados y encontrar materiales con buenas características para un posteriormente
usarlas en programas de mejoramiento.
BIODIVERSIDAD EN MÉXICO
La región mesoamericana se extiende desde el Norte de la República Mexicana
hasta parte de Centro América (Guatemala, Belice, El Salvador y Honduras) y se ha
caracterizado por ser una de las zonas con mayor riqueza genética, además constituye el
centro de origen y domesticación de varias especies cultivadas. Por sus características
topográficas, climáticas, historia geológica, geográfica y biológica, nuestro país alberga
una gran variedad de ecosistemas y por tanto una gran variedad de especies (NeyraGonzález y Durand Smith, 1998). México constituye uno de los 12 países megadiversos
(en los que el 70% de la biodiversidad total del planeta se ha concentrado). Además,
posee el cuarto lugar en diversidad de plantas y se ha estimado que contiene alrededor
del 10% de la flora del planeta y que de ellas el 20 a 30% son endémicas (CONABIO,
2006). Con base a las caracteísticas topográficas y geológicas, que influyen en las
características climáticas, del suelo y de la vida silvestre, se han reconocido 15
provincias fisiográficas: Península de Baja California, Llanura Sonorense, Sierra Madre
Occidental, Sierras y Llanuras del Norte, Sierra Madre Oriental, Grandes Llanuras de
Norteamérica, Llanura Costera del Pacífico, Llanura Costera del Golfo Norte, Mesa del
Centro, Sierra Volcánica Transversal o Eje Neovolcánico, Península de Yucatán, Sierra
Madre del Sur, Llanura Costera del Golfo Sur, Sierra de Chiapas y Oaxaca y Cordillera
Centroamericana (Figura 1) (INEGI, 2006).
Figura 1.
Provincias fisiográficas de México (INEGI, 2006).
Además, México es considerado el centro de origen, domesticación y
diversificación de algunos cultivos de interés económico y alimentario, estimaciones
sugieren que más de 118 especies de plantas, pertenecientes a 70 géneros y 39 familias
han sido domesticadas en nuestro país, dentro de las más importantes se considera al
maíz, amaranto, calabaza, camote, chile, cacao, jitomate, vainilla y frijol común
(Hernández-Xolocotzi, 1993; Neyra González y Durand Smith, 1998). Sin embargo, la
variabilidad genética de las especies cultivadas y sobre todo de las especies silvestres
mexicanas ha sido poco estudiada.
En México y en el mundo, organizaciones educativas e institutos de investigación
están colaborando en la conservación de los recursos genéticos. En nuestro país,
principalmente el Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias
(INIFAP) y otras Universidades se encargan de esa importante labor.
MARCADORES MOLECULARES EMPLEADOS PARA MEDIR LA
DIVERSIDAD GENÉTICA
La diversidad genética puede medirse en dos niveles: fenotipo y genotipo. A nivel
del fenotipo se describen los caracteres individuales o rasgos morfológicos que resultan
de un genotipo y de su interacción con el ambiente, mientras que a nivel de genotipo se
mide la constitución genética particular de un organismo. Una diferencia fenotípica o
genotípica puede actuar como marcador genético si identifica en un individuo y puede
hacerse un seguimiento a su herencia a través de varias generaciones (www.ipgri.org).
Marcadores morfológicos y agronómicos
Los marcadores morfológicos evalúan la variación fenotípica y miden
características que definen forma y apariencia de un conjunto de individuos y las debe
determinar un experto en la especie. Sin embargo este tipo de marcadores está sujeto a
cambios debido a factores ambientales y pueden variar en las diferentes etapas de
desarrollo del organismo; además su número es muy limitado (Gepts, 1993).
Marcadores bioquímicos
El avance y la disponibilidad de nuevas técnicas de laboratorio permitieron superar
las limitaciones de los marcadores morfológicos, desarrollando marcadores bioquímicos
basados en la detección de polimorfismos, es decir, diferencias detectables en un grupo
de individuos. Los marcadores bioquímicos más empleados han sido las proteínas de
reserva, se comparan los patrones enzimáticos obtenidos mediante electroforesis, se
pueden detectar diferencias genotípicas con base a sencillas bases moleculares. Cubren
el genoma entre 10 a 50 loci, dependiendo de la especie; sin embargo, el polimorfismo
es bajo; aunque sencillo de realizar y de bajo costo. Al igual que los marcadores
morfológicos, éstos también son limitados por la influencia del ambiente y los cambios
que ocurren a diferentes etapas del desarrollo. Las principales ventajas de esos
marcadores es la presumible neutralidad selectiva que permite distinguir similaridades
debidas a la ancestría común o a la convergencia evolutiva (Gepts, 1993).
Isoenzimas
Las isoenzimas (diferentes formas moleculares de enzimas que presentan
especificidad por el mismo sustrato o la misma actividad catalítica) y aloenzimas
(isoenzimas cuya síntesis es controlada por los alelos codominantes de un gen) son
proteínas con actividad catalítica que permiten conocer la variabilidad genética
dependiendo del polimorfismo de sus formas moleculares y genéticas. Los genes que
codifican las isoenzimas poseen dos propiedades que los hacen interesantes: 1) una
porción importante de esos genes es polimórfica (dos o más alelos) y 2) los alelos de los
genes codificadores de las enzimas son generalmente codominantes (Parker et al., 1998).
Faseolina
Las proteínas de semillas empleadas como marcadores exhiben un alto nivel de
polimorfismo y generalmente un alto nivel de estabilidad ambiental, pero las complejas
bases moleculares de sus patrones electroforéticos y de bandeo hacen difícil relacionar
cambios fenotípicos con cambios a nivel molecular, además de su bajo número de loci
involucrados (menos de 10) (Gepts, 1993). La faseolina, principal proteína de reserva
del frijol es un marcador co-dominante que se hereda como una simple unidad
Mendeliana, y se ha usado en análisis evolutivos para determinar centros de
domesticación y patrones de distribución del frijol común.
MARCADORES GENÉTICOS BASADOS EN EL ADN
Un marcador genético es un carácter cuantificable que puede detectar variación en
la secuencia de ADN. Se basan en la evaluación genotípica y presentan altas ventajas en
comparación con los marcadores morfológicos y bioquímicos, son ilimitados y más
informativos ya que abarcan todo el genoma, polimórficos y no son influenciados por el
ambiente o el estadío de desarrollo, confiables y reproducibles; sin embargo, son más
costosos y requieren un equipo complejo. Existen diferentes tipos y sus características
son resumidas en el Cuadro 2. Los marcadores genéticos son altamente versátiles en sus
aplicaciones, así por ejemplo, marcadores que abarquen un gran número de loci, como
son AFLP, RFLP o RAPD. Se pueden usar para medir diversidad genética y
diferenciación de la estructura genética de una población, estimar las tazas de flujo
génico o migración o para mapeo genético e identificación. Para la caracterización de
sistemas de apareamiento, análisis de paternidad y parentesco, caracterización de
patrones de flujo génico o migración dentro de una población, control de calidad de
variedades, huella de DNA y verificación de cruzas, se requiere un alto poder
discriminativo y los microsatélites son los más convenientes. Finalmente, para aquellas
aplicaciones que requieren información de secuencias para análisis de filogenia y
taxonomía son indispensables las técnicas de PCR y secuenciación.
Microsatélites (SSR)
Los micro y minisatélites consisten en secuencias cortas (1-10 pb y 2-3 pb,
respectivamente) que se repiten en serie. Son altamente variables y representan muchos
loci dispersados en todo el genoma, que pueden tener varios alelos por locus, de manera
que las hibridaciones con DNA genómico producen una individual y específica huella de
DNA. Para identificar los polimorfismos se construyen cebadores de PCR para la región
del ADN que flanquea el micro o mini satélite debido a que tienden a aconservarse
dentro de las especies (Kochert, 1994).
Cuadro 1. Características de los marcadores moleculares.
Marcadores moleculares más utilizados
Isoenzimas
No. Loci teóricos
No. Loci prácticos
Polimorfismo
Dominancia
Alelos nulos
Locus específico
Transferibilidad
de loci
Muestra requerida
Confiabilidad/
Reproducibilidad
Facilidad
de ensayo
Automatización
Multiplexización
(loci/ensayo)
Equipo
Desarrollo
Ensayo
a
RFLP
SSR
RAPD
AFLP
30-50
30-50
bajo +/-
sin límite
100s
+/- alto
10,000
10s
muy alto
sin límite
1000s
+/- alto
codominante
raros
codominante
extra raros
codominante
ocasional
dominante
dominante
presencia/ausencia presencia/ausencia
si
si
si
no
no
entre familias
entre géneros
relacionados
dentro de
subgénero
dentro de especie
dentro de especie
mg tejido
2-10 mg
25-50 ng
5-10 ng
25 ng
muy alta
muy alta
alta
baja a media
media a alta
fácil
difícil
fácil a +/-
fácil
+/-
difícil
difícil
difícil
+
+
rebanadas de gel
1-3
1-9
5-20
20-100
barato
barato
barato
caro
caro
caro
muy caro
muy caro
+/- caro
+/+/+/-
caro
+/+/-
sin límite
1000s
+/- alto
Adaptado de Tecnologías de marcadores moleculares para estudios de diversidad
genética de plantas. IPGRI y Universidad de Cornell (2003)
Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP)
Esta fue una de las primeras técnicas empleadas para detectar variaciones en la
secuencia del ADN y se basa en la comparación de patrones de bandeo generados a
partir del ADN de diferentes individuos que han sido sometidas a digestión con enzimas
de restricción. Los patrones de variación observados se deben a las diversas mutaciones
que afectan la secuencia del ADN produciendo fragmentos de longitud variable que son
separados mediante electroforesis que hibridan mediante Southern blot con una sonda
específica diferenciando sólo algunos fragmentos de restricción. Dependiendo de la
especie analizada es el nivel de polimorfismo obtenido y estos marcadores cubren
ampliamente el genoma a estudiar.
Polimorfismo de ADN amplificación al azar (RAPD)
Esta técnica está basada en el PCR con iniciadores de secuencia arbitraria
(generalmente de 10 pb) que amplifica fragmentos de ADN al azar, es decir, sin que se
busque un fragmento específico. Los fragmentos se separan y detectan mediante
electroforesis. La presencia de cada producto de amplificación identifica la secuencia
homóloga de nucleótidos completa o parcial entre el ADN genómico y los
oligonucleótidos del iniciador, de tal manera que cada primer amplificará directamente
varios loci en el genoma, haciendo una eficiente selección del polimorfismo de
secuencias de nucleótidos entre individuos (Williams et al., 1990). Este polimorfismo,
representado como presencia o ausencia de productos amplificables, es resultado de la
variación alélica entre dos individuos (Parker et al., 1998).
Polimorfismo de la longitud de fragmentos amplificados (AFLP)
Esta técnica es una combinación de RFLP y PCR, está basada en la amplificación
selectiva de fragmentos obtenidos a partir de la restricción del DNA genómico. Se
emplea para caracterizar ADN de cualquier origen y complejidad. Consta de cuatro
etapas: 1) El DNA genómico se corta con dos enzimas de restricción (EcoRl y Msel),
formando una gran cantidad de fragmentos de diferente peso molecular. 2) A los
fragmentos generados se les ligan en los extremos adaptadores (oligonucleótidos de
DNA de doble cadena) con una secuencia base y el extremo cohesivo a la secuencia de
corte de la enzima de restricción, generando un templado que servirá como sitio de
unión a los iniciadores en la amplificación posterior. 3) La preamplificación se realiza
adicionando una base selectiva en el extremo 3´ que permita amplificar una gran
cantidad de fragmentos selectivos, los cuales son diluidos y utilizados como fuente
ilimitada de templados. 4) En la segunda etapa de amplificación, los iniciadores tienen
tres bases selectivas por lo que se reduce el patrón de bandas, lo que facilita la
interpretación de la información en el gel. 5) Finalmente se separan los fragmentos
amplificados mediante electroforesis en un gel de poliacrilamida (Vos et al., 1995). Los
AFLP se pueden ser usar para DNA de cualquier origen y complejidad, sin requerir un
conocimiento previo de la secuencia de su genoma.
Esta técnica provee un gran número de polimorfismos. En general hay una
correlación lineal entre el número de fragmentos amplificados y el tamaño del genoma;
sin embargo, en genomas complejos como el de plantas superiores se pierde esta
correlación. Además, permite diferenciar individuos en una población, hacer análisis de
paternidad, de flujo genético, e identificación de cultivares, y construir mapas genéticos
de alta densidad, ya que el polimorfismo detectado es hasta cuatro veces mayor que en
RAPDs, RFLPs y SSRs.
JUSTIFICACION
El papel que el frijol común tiene en la alimentación de nuestro país es obvio,
una dieta típica incluye un 15% de frijol y un 65% de maíz, por lo que esta leguminosa
es la segunda fuente de proteína, energía y minerales de la población mexicana. En este
sentido, el frijol cultivado es una buena fuente de algunos de nutrimentos pero presenta
deficiencias en otros. Tampoco puede pasarse por alto el papel nutracéutico de los
compuestos que recientemente se han encontrando en el frijol común.
Debido a que el fríjol es un alimento de gran importancia en la dieta en nuestro
país y porque cuenta con una gran variedad de materiales de fríjol por ser centro de
origen y domesticación de este cultivo, es necesario establecer actividades que tengan
como objetivo evitar la pérdida del frijol criollo y silvestre, y caracterizar estos
materiales desde un punto de vista nutricional, agronómico, molecular y bioquímico
para conocer su potencial para mejorar al frijol comercial. El estudio de las
características del fríjol silvestre,
permitirá encontrar materiales con aspectos
sobresalientes, que puedan ser utilizados en programas de mejoramiento de fríjol
cultivado otorgándole mejores cualidades nutricionales y funcionales así como mayor
variabilidad genética como solución a la escasa variabilidad presentada por el frijol
cultivado (Gepts, 1998; Beebe, 1999; Frossard y col., 2000).
Este estudio específicamente, nos permitirá encontrar materiales con
características sobresalientes a nivel de contenido de proteína y minerales, que son las
principales características nutricionales del fríjol, así como los contenidos de fibra
dietaria y oligasacaridos, ambos componentes funcionales o nutracéuticos, que está
involucrado en la prevención de cáncer de colon, a una mayor absorción de los
nutrimentos en el tracto digestivo; y prevención de cáncer y actividad antioxidante
respectivamente. Los materiales con características notables podrán ser utilizados en
programas de mejoramiento nutricional de fríjol cultivado. Esta información será
proporcionada a fitomejoradores de este cultivo cuya finalidad será obtener frijoles que
aporten mayores beneficios nutricionales, funcionales y sobre todo preventivos de
enfermedades crónicas al ser consumidos por la población mexicana.
OBJETIVO GENERAL

Caracterizar los componentes nutricionales y nutracéuticos de materiales
silvestres, criollos y mejorados de fríjol para la obtención de información útil
para la mejora genética de estos aspectos en las variedades de fríjol cultivado y
consumido en México.
OBJETIVOS ESPECIFICOS.

Determinar compuestos nutricionales: proteínas y minerales, así como
componentes nutraceuticos: oligosacáridos y fibra en frijol silvestre y
domesticado y correlacionarlos con sus características genéticas (marcadores
moleculares).
HIPÓTESIS
Existen materiales silvestres y domesticados que contienen mejores concentraciones de
proteínas y minerales, así como mejores componentes nutracéuticos (fibra), que los
materiales cultivados. Se pueden relacionar estas características ventajosas con los
marcadores genéticos de cada material.
MATERIALES Y MÉTODOS
MATERIAL BIOLÓGICO
Se analizaron 34 materiales criollos, 22 materiales mejorados y 64 materiales silvestres,
para efectos comparativos se incluyeron los materiales cultivados: “Jamapa” y “Pinto”.
La mayoría de los materiales fueron obtenidos de la colección del instituto Nacional de
Investigación Agrícola y Forestal, Unidad Bajío, localizado en Celaya, Gto. Los
materiales criollos y silvestres fueron provenientes de los estados de Aguascalientes,
Durango, Chihuahua, Guanajuato, Guerrero, Jalisco, Michoacán, Nayarit y Oaxaca. Los
materiales se crecieron en el invernadero para recuperar material vegetativo suficientes
para los diferentes experimentos.
EXTRACCIÓN DE DNA
La extracción de DNA se realizó con el método de Doyle y Doyle (1989), con algunas
modificaciones. Se pulverizaron hojas jóvenes congeladas con nitrógeno líquido con un
homogenizador Cafrano CSA (Tipo RZR. Notario, Canada) y se homogenizaron con
600 ul de buffer de lisis (100 mM Tris-HCL pH 8.5; 20 mM NaCL; 20 mM EDTA pH
8.0; 20% N-Laurilsarcosina (SIGMA-Aldrich). Se adicionaron 5 ul de RNAsa 10
mg/ml, y se incubó a temperatura ambiente por 15 minutos. Se extrajeron las proteínas
con fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25:24:1 v/v/v), la mezcla se centifugó a
12000 rpm durante 10 minutos, se recuperó el sobrenadante y se mezcló con 750 ul de
isopropanol y se precipitó a -20 oC durante una hora. Se centrifugó la mezcla a 12,000
rpm y se recuperó la pastilla, se lavó con etanol 70% y se resuspendió en 100 ul de TE
(10mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA). Se determinó la concentración por espectofotometría
(D.O. 260). Las muestras se diluyeron a 100 ng /ul y se almacenaron a -20oC hasta su
uso.
OBTENCIÓN DE AFLP´S NO-RADIACTIVOS
Se utilizaron primers IRDye marcados con fluoresceína. La separación de los
fragmentos por electroforesis se realizó utilizando el equipo IR2Global Edition DNA
Analyzer (Li-COR Inc.) y la visualización de los mismos se hizo usando el software
SAGA automated AFLP análisis (versión 2.0) (Li-COR Inc), bajo el protocolo de
obtención de AFLP propuesto por Vois et al. (1995); Lin y Kuo (1995).
RESTRICCIÓN DEL DNA
Se llevaron a cabo las reacciones utilizando 100 ng de DNA, se mezclaron 2.5 ul de
buffer RL (restricción-ligación), 0.3 ul de enzima Eco RI (10 U/ul), 0.3 ul de enzima
Mse I (10 U/ul) y 8.4 ul de agua destilada hasta ajustar un volumen de 12.5 ul. La
mezcla se incubó a 37oC por dos horas a 37oC, transcurrido este tiempo se inactivaron
las enzimas a 70oc por 15 minutos y se continuo con la ligación.
LIGACIÓN DE LOS ADAPTADORES
Los adaptadores para la ligación se prepararon por separado, mezclando 5 pmol del sitio
Eco RI (CTGACGCATGGTTAA y CTCGTAGACTGCGTACC) y 50 pmol de
adaptadores Mse I (TACTCAGGACTCAT y GACGATGATGAGTCCTGAG). Se
hibridaron por separado utilizando el 10% del volumen final del buffer de hibridación
10X, se incubó la mezcla a 65oC durante 10 minutos y a 56 oC por una hora. Se
mantuvieron a temperatura ambiente por una hora y se almacenaron a -20oC hasta su
uso. Una ve hibridados, se utilizaron para para preparar la mezcla de ligación que
consistió en 1 ul de adapatador Eco RI, 1 ul de adaptador Mse I, 1 ul de buffer RL 10X,
1.2 ul de ATP 10 mM, 1 ul de DNA ligasa y agua hasta 12.5 ul volumen final. La
reacción se incubó a 20 oC durante la noche. Al finalizar la incubación se realizó una
dilución con 90 ul de buffer TE 0.1X y 10 ul de la digestión-ligación y se almacenaron a
-20oC hasta su uso.
PREAMPLIFICACIÓN DE LOS FRAGMENTOS DE RESTRICCIÓN
Se mezclo el DNA digerido y ligado de la siguiente manera: se mezclaron 2.5 ul de la
reacción diluída, 2.5 ul de buffer de PCR 10X, 0.9 ul de MgCl2 50 mM, 1 ul de dNTP´s
2.5 mM, 1 ul del oligo Eco RI, 1 ul del oligo Mse I, 0.5 ul de Taq DNA polimerasa (5
U/ ul) y 16.1 ul de agua desionizada hasta completar un volumen de 25.5 ul. Se
amplificó el DNA con el siguiente programa 94oC por 30 segundos, 56oC por 1 minuto,
y 72oC por 1 minuto. La amplificación se diluyó utilizando 5 ul de DNA preamplificado
y 195 ul de buffer TE 0.1 X.
AMPLIFICACIÓN SELECTIVA
Para la amplificación se mezclaron 2 ul de DNA pre-amplificado y diluído(1:40); 1.2. ul
de buffer de reacción, 0.4 ul de MgCl2 50mM, 1 ul de la mezcla de dNTP´s 2.5 mM,
0.5 ul de oligo Eco RI+ AGA IRDye; 0.5 ul del oligo MseI+CAT; 0.3 ul de Taq DNA
polimerasa y 3.1 ul de agua. La reacción se llevó a cabo siguiendo el programa 94oC
por 30 segundos, 65oC por 30 segundos, y 72 oC 1 minuto, se llevaron a cabo 19 ciclos,
cada uno con un decremento gradual de la temperatura de alineamiento por ciclo (0.7
o
C; de 65oC a 57.3 oC); 94oC por 30 segundos y 72 oC por 1 minuto. A partir de aquí se
amplificaron durante 23 ciclos, siguiendo el programa 94oC por 30 segundos, 56oC por
30 segundos, y 72oC por 1 minuto.
VISUALIZACIÓN DE LOS PRODUCTOS DE AFLP´S
Los fragmentos amplificados fueron separados por electroforesis en geles de
poliacrilamida al 6.5 % de 25 cm, mediante un secuenciador automatizado. Primero se
efectuó una precorrida por 20 minutos y enseguida se cargaron 3 ul de los productos de
PCR previamente desnaturalizados con 2 ul de Blue Stop (LI-COR) a 94oC por 3 min, y
la corrida se mantuvo a 45oC temperatura constante por dos horas.
DETERMINACIÓN
DEL
NÚMERO
MÍNIMO
DE
INDIVIDUOS
QUE
REPRESENTAN LA DIVERSIDAD DE LA COLECTA
Se realizó un análisis preliminar de diversidad con el fin de establecer el número
mínimo de individuos que representaran la diversidad genética de una colecta. Para ello
se analizaron los datos de 10 individuos de 14 diferentes colectas. La diversidad
genética de 14 diferentes colectas analizados. La diversidad genética de las diferentes
colectas analizadas fue evaluada por el polimorfismo de los marcadores AFLP. A partir
de la lectura de los geles se generó una matriz binaria de datos, codificando la presencia
del fragmento como 1 y la ausencia como 0. Además se asumió que las colectas o
poblaciones estuvieron en el equilibrio Ardí-Weinberg. Se utilizó el programa
POPGENE 1.31 para datos diploides dominantes (Yeh y Boyle, 1999) y se estimaron
los índices de diversidad genética (H) de diez individuos y se compararon con los
valores obtenidos a partir de 3,4,5,6,7,8 y 9 individuos, seleccionando el menor número
donde se mantenían valores genética similares.
ANALISIS DE LA DIVERSIDAD GENETICA
Una
vez seleccionado el número de individuos a considerar en el análisis preliminar
de diversidad, se realizaron los AFLP correspondientes y se obtuvo una matriz de datos
binarios. Los índices de diversidad genética fueron estimados mediante el programa
POPGEN 1.31 para datos diploides dominantes, considerando cuatro niveles de análisis:
país (total de los materiales), provincias fisiográficas, grupo biológico y poblaciones.
Los estimados analizados fueron: el porcentaje de loci polimórficos, (H) índice de
diversidad genética de Nei e indice de Shanon.
Indice de diversidad de Nei
H= 1-Xj2 [¨n/(n-1)]
Xj=frecuencia alélica por locus
n= número de alelos totales
Indice de Shanon
H= -pi lnpi
Pi= frecuencia del marcador en la población
Se aplicaron análisis de varianza de una vía y pruebas de comparación de múltiple de
medias de Duncan (=0.05) para comparar los valores de riqueza obtenidos a nivel de
provincias y grupos biológicos, utilizando el programa STATGRAPHICS plus 5.1.
La estructura genética fue analizada por medio de tres estimadores: 1) el estadístico Gst,
estimado por POPGEN 1.31., considerando tres niveles: país, provincias fisiográficas, y
grupos biológicos. 2) Análisis de varianza molecular (AMOVA), considerando dos
niveles : a) provincias fisiográficas y b)grupos biológicos.
ACTIVIDADES DESARROLLADAS
1. Identificación de materiales superiores y que puedan incorporarse a los materiales
domesticados.
2. Aislamiento de DNA de los materiales seleccionados
3. Establecimiento del número mínimo de muestras para el análisis molecular tipo
AFLP
4. Análisis de diversidad genética de los materiales de frijol analizados
RESULTADOS
Aislamiento de DNA
Para llevar a cabo los ensayos con los marcadores se aisló el DNA de todos los
materiales de trabajo. Se germinaron las semillas y se extrajo el DNA de plántulas
(Figura 1), como se observa en la figura se obtuvo DNA de alto peso molecular y con
rendimientos de hasta 100 mg/ml.
Determinación del número mínimo de individuos
En la Figura 2 se muestran los datos correspondientes a la diversidad genética de 3, 4, 5,
6, 7, 8, 9, y 10 individuos de 14 colectas de diferente origen geográfico. Se observa que
el valor de la diversidad genética fue muy similar a partir de cinco individuos. Con base
en estos resultados y debido al gran número de accesiones de frijol, se decidió que cinco
individuos representaban la diversidad del frijol silvestre y enmalezado. Considerando
esto el análisis final de la diversidad y estructura genética del material estudiado fue
realizado usando una muestra de cinco individuos. En la figura 3 se muestra un patrón
de AFLPs no radiactivos.
Patrón de AFLP´s de los materiales de frijol analizados
La combinación de los primers E-AGA_700:-CAT y E-ACG_800:MCAT arrojaron un
total de 113 loci. Mientras que las combinaciones E-AGA_700:M-ctc y ECG_800:MCTC arrojaron 107 loci. Todos los loci (100 %) fueron polimórficos para los materiales
silvestres y solo el 65% para los materiales cultivados, con esto se puede decir que el
patrón debandeo fue adecuado, de acuerdo a otros trabajos previos descritos (Papa y
Gepts, 2003).
Biodiversidad genética en frijol
La diversidad genética observada en los materiales silvestres a nivel del país fue alta
(H= 0.419, I=0.606), mayor que lo reportado previamente (Papa y Gepts, 2003;
Zizumbo–Villareal et al., 2005). Las diferencias posiblemente se deben al número de
colectas de las diferentes regiones del país, que en este trabajo fue mayor.
En términos de provincias fisiográficas, se observo hasta un 100% de polimorfismo en
el material silvestre, a excepción del grupo de la llanura costera del pacífico, donde el
nivel alcanzó hasta el 80%. Los materiales cultivados presentaron un menor porcentaje
de polimorfismo (65%). Los índices de diversidad genética fueron mayores para los
materiales del eje Neovolcánico (H=0.418; I= 0.604) y de la Sierra madre del Sur
(H=0.403, I= 0.584), seguidos de los valores de la Sierra Madre Occidental, Sierra de
Chiapas y Guatemala y la Llanura costera del Pacífico (Figura 4). Los valores de
diversidad más bajos fueron para los materiales cultivados (H=0.184, I=0.286). Los
resultados indican que la mayor diversidad se localiza en en la región del Eje
Neovolcánico y la Sierra Madre del Sur, que incluye materiales de Guanajuato, Jalisco,
Michoacán, Morelos y Estado de México. En trabajos previos se había señalado ya una
gran diversidad genética en esa zona (Papa y Gepts, 2003). En estas regiones pudieran
compartirse condiciones climáticas intermediarias entre Mesoamérica y Aridoamérica,
lo que puede favorecer la propagación y mantenimiento de las especies silvestres.
Además los estados de Jalisco, Guanajuato y Michoacán se consideran los estados
donde se llevó a acabo la domesticación de frijol en Mesoamérica. Actualmente se
encuentran poblaciones silvestres contemporáneas; lo que puede estar manteniendo la
amplia diversidad genética (Gepts y Debouck, 1991).
A nivel de grupos biológicos, el frijol silvestre presentó la mayor diversidad genética,
seguido por el frijol enmalezado y al final el frijol cultivado (Figura 4). Esta diferencia
podría ser consecuencia del efecto fundador asociado con la domensticación y los
cuellos de botella ocurridos durante la selección artificial hecha por el hombre (Sonante
et al., 1994; Papa y Gepts, 2003).
Los índices de diversidad genética a nivel de colectas individuales se resumen en la
Figura 5, el porcentaje de loci polimórficos de las colectas silvestres y enmalezadas
osciló entre 0 (Michoacán 1950) y 57.52% (Morelos G-12877 y Puebla G-23429C) y en
los frijoles cultivados entre 14.16 y 45.13% (negro 8025 y Negro Otomí,
respectivamente). Los materiales silvestres mostraron una variación alta en el índice de
Shanon (I), en un rango de 0 (Mich 1950) a 0.336 (Gto G-12893). En el frijol
enmalezado de 0.015 (Dgo G-11025B) hasta 0.271 (gto G-12904), similares al rango de
los cultivados (0.104 para Apaseo 95 y 0.272 en Negro Otomí). Los rangos de
diversidad mostrados sugieren que los materiales silvestres son más diversos que los
enmalezados y los cultivados. Esto podría explicarse por que los materiales
enmalezados se originan a partir de la cruza entre los frijoles silvestres y cultivados.
Esto podría generar erosión genética en las poblaciones silvestres, por el flujo génico
asimétrico de los materiales domesticados hacia los silvestres, como ha sido reportado
previamente (Papa y Gepts, 2003; Martínez-Castillo et al., 2006).
En los materiales organizados por estados, se obtuvo el promedio del porcentaje de loci
polimórfico, diversidad genética e índice de Shanon (I). Se observó que los materiales
colectados en Puebla fueron los más diversos (48.23% de loci polimórfico, H= 0.18,
I=0.27), seguidos por Guanajuato (35.72%, H=0.14, I=0.21) y Morelos (30.90%,
H=0.11, I=0.17) (Figura 4). Finalmente, los materiales de Chiapas, Durango, Jalisco,
Michoacán y Oaxaca fueron los de menor polimorfismo y diversidad.
Los resultados de diversidad genética por estado fueron similares a lo reportado por
Papa y Gepts (2003).
Relaciones genéticas
La Figura 6 presenta las relaciones genéticas entre las accesiones silvestres,
enmalezadas y cultivadas analizadas (Figuras 6 y 7). El patrón de agrupamiento
observado está correlacionado con el origen geográfico. El análisis fenético muestra
diferentes subgrupos constituidos por colectas de Chiapas, Durango, Morelos,
Michoacán, Jalisco, Guerrero, Guanajuato, Oaxaca y los cultivados. Las colectas de
Durango, Guerrero y Guanajuato fueron las menos homogéneas, ya que además de
formar un grupo definido se encontraron distribuidas en otros subgrupos.
Las accesiones de Chiapas se distribuyeron en dos subgrupos unidos a una distancia
genética de 0.396, los cuales también compartieron relación genética con colectas de
Michoacán. Las accesiones de Morelos también formaron dos subgrupos, el primero de
ellos genéticamente más cercano a las colectas de Guerrero y Guanajuato y el segundo
como subgrupo independiente hasta con 0.384 de distancia genética. Las accesiones de
Oaxaca se distribuyeron en dos subgrupos, uno de ellos bien definido e independiente y
el segundo se relaciona con colectas de Jalisco, Guerrero y Guanajuato. Además
presentaron hasta 0.467 de distancia genética.
Las diferentes accesiones enmalezadas se agruparon con las colectas silvestres de las
mismas regiones geográficas, lo cual parece ser consecuencia de su cercana relación
genética, además del flujo genético asimétrico con introgresión de genes de materiales
cultivados hacia los silvestres, pero que sin embargo siguen manteniendo la mayor parte
del acervo silvestre (Papa y Gepts, 2003).
Los materiales cultivados formaron un subgrupo relacionado con dos accesiones de
Guanajuato, con una distancia genética de 0.249. Los materiales cultivados analizados
provienen de materiales criollos de la región del Bajío a excepción de Negro 8025,
pudiendo conservar una relación genética debido a su ancestría. La distancia genética
entre las variedades cultivadas en general fue menor que en las accesiones silvestres y
enmalezadas, esto sugiere que la domesticación y la selección redujo la diversidad.
Finalmente, no fue posible encontrar grupos que representaran a las diferentes
provincias fisiográficas.
CONCLUSIONES
1. Se determinó el tamaño de muestra para los análisis de marcadores AFLP (n=5)
2. Se determinó la diversidad genética en frijol y se encontró lo siguiente:
a. De acuerdo a las provincias geográficas el Eje Neovolcánico y la Sierra
Madre del Sur presentaron la mayor diversidad
b. Los materiales silvestres mostraron mayor diversidad
c. En referencia a la diversidad por estados, Puebla, Guanajuato y Morelos
resultaron los estados con mayor diversidad.
d. Las colectas de Durango, Guerrero y Guanajuato fueron las menos
homogéneas.
e. La distancia genética entre las variedades cultivadas en general fue
menor que en las accesiones silvestres y enmalezadas, esto sugiere que la
domesticación y la selección redujo la diversidad.
f. Se encontró una relación genético-geográfica entre las diferentes colectas
PRODUCTOS GENERADOS
Se graduó como Doctora en Ciencias, con especialidad en Biotecnología de Plantas, la
C. Laura Gabriela Espinosa Alonso, con el trabajo Diversidad genética y
caracetrización nutricional y nutraceútica del frijol (Phaseolus vulgaris L.).
BIBLIOGRAFIA
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1
2
3
4
5
6
7
8
A
1
2
3
4
4B
Figura 1. Aislamiento de DNA de plántulas de frijol. Fotografía de elctroforesis de
geles de agarosa al 1%. Se analizaron 5 ul de la suspensión de DNA aislado y se
visualizó con bromuro de etidio. A) Muestras de DNA de frijoles silvestres y B)
Muestras de DNA de frijoles criollos.
Chiapas
n
H
Chihuahua
H
Durango
H
Guerrero
H
Guanajuato H
Jalisco 1
H
Jalisco 2
H
Michoacán
H
Morelos
H
Nayarit
H
Oaxaca
H
Puebla
H
Sinaloa
H
Puebla 2
H
10
9
8
7
6
5
4
3
0.1089 ± 0.1801 0.1100 ± 0.1826 0.1069 ± 0.1845 0.1110 ± 0.1900 0.1160 ± 0.1958 0.0982 ± 0.1855 0.0928 ± 0.1863 0.0927 ± 0.1869
a
a
a
a
a
a
a
a
0.1124 ± 0.1843 0.1107 ± 0.1826 0.1117 ± 0.1814 0.1128 ± 0.1808 0.1085 ± 0.1770 0.1072 ± 0.1724 0.1045 ± 0.1701 0.1092 ± 0.1779
a
a
a
a
a
a
a
a
0.1028 ± 0.1849 0.1056 ± 0.1892 0.1034 ± 0.1890 0.1006 ± 0.1932 0.1001 ± 0.1932 0.1016 ± 0.1957 0.0896 ± 0.1863 0.0727 ± 0.1702
a
a
a
a
a
a
a
a
0.2956 ± 0.1994 0.2980 ± 0.2022 0.3039 ± 0.2026 0.2846 ± 0.2099 0.2869 ± 0.2103 0.2877 ± 0.2096 0.2777 ± 0.2136 0.1696 ± 0.2108
a
a
a
a
a
a
a
b
0.1422 ± 0.2097 0.1194 ± 0.1938 0.1232 ± 0.1985 0.1227 ± 0.2007 0.1257 ± 0.2063 0.1252 ± 0.2084 0.1259 ± 0.2078 0.1172 ± 0.1970
a
b
b
b
b
b
b
b
0.1288
a
0.1416
a
± 0.1909 0.1230 ± 0.1911 0.1206 ± 0.1920 0.1205 ± 0.1960 0.1174 ± 0.1960 0.1119 ± 0.1970 0.1022 ± 0.1908 0.1033 ± 0.1899
0.1748
a
0.1633
a
± 0.2064 0.1725 ± 0.2084 0.1646 ± 0.2069 0.1371 ± 0.1944 0.1348 ± 0.1990 0.1405 ± 0.2021 0.1421 ± 0.2025 0.1437 ± 0.1996
0.1413
a
0.1189
a
± 0.2091 0.1345 ± 0.1981 0.1349 ± 0.1979 0.1312 ± 0.1950 0.1332 ± 0.1970 0.1352 ± 0.1988 0.1358 ± 0.1993 0.1175 ± 0.1907
0.1154
a
0.3321
a
± 0.1876 0.1132 ± 0.1843 0.1086 ± 0.1792 0.0907 ± 0.1628 0.0801 ± 0.1522 0.0593 ± 0.1257 0.0579 ± 0.1277 0.0624 ± 0.1350
0.1536
a
± 0.2037 0.1528 ± 0.2041 0.1497 ± 0.2060 0.1523 ± 0.2072 0.1488 ± 0.2046 0.1431 ± 0.2052 0.0854 ± 0.1719 0.0843 ± 0.1727
a
a
a
a
a
a
a
± 0.1914 0.1428 ± 0.1922 0.1462 ± 0.1953 0.1494 ± 0.1973 0.1570 ± 0.2024 0.1664 ± 0.2083 0.1708 ± 0.2106 0.1766 ± 0.2119
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
± 0.2025 0.1623 ± 0.1979 0.1571 ± 0.1960 0.1567 ± 0.1984 0.1525 ± 0.1953 0.1343 ± 0.1987 0.1284 ± 0.1965 0.1159 ± 0.1883
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
± 0.1883 0.1213 ± 0.1920 0.1250 ± 0.1957 0.1233 ± 0.1977 0.1215 ± 0.1966 0.1190 ± 0.1935 0.1166 ± 0.1913 0.1159 ± 0.1883
a
a
a
a
a
ab
a
ab
a
c
a
c
c
± 0.1860 0.3283 ± 0.1890 0.3358 ± 0.1916 0.3408 ± 0.1956 0.3403 ± 0.1941 0.3386 ± 0.1980 0.2345 ± 0.2154 0.1849 ± 0.2048
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
b
b
b
b
Figura 2. Determinación del tamaño de la muestra para análisis AFLP
bp
750
650
600
565
530
500
460
400
364
300
255
204
145
100
50
Figura 3. Patrón de AFLPs no radiactivos obtenido con la combinación EcoACG_800:M_CTC (imagen a λ=800 nm) en accesiones de frijol silvestre y
enmalezado.
% Loci
polimórfico
Nivel jerárquico
País
México
Provincia fisiográficas
Sierra Madre Occidental
Sierra de Chiapas y
Guatemala
Sierra Madre del Sur
Eje Neovolcánico
Llanura Costera del
Pacífico
Grupo biológico
Silvestre
Enmalezado
Cultivado
a
100
H
I
Gst
Nm
0.781
21.14
0.419 ± 0.091
0.606 ± 0.105
97.35
0.343 ± 0.140 b
0.513 ± 0.176 b
0.783 a
0.139
97.35
0.337 ± 0.141 b
0.0506 ± 0.176 bc
0.798 a
0.127
99.12
100
0.403 ± 0.117 a
0.418 ± 0.094 a
0.584 ± 0.140 a
0.604 ± 0.109 a
0.782 a
0.755 a
0.140
0.163
79.65
0.317 ± 0.185 b
0.463 ± 0.258 c
0.498 b
0.503
100
100
64.60
0.422 ± 0.089 a
0.385 ± 0.114 b
0.184 ± 0.183 c
0.608 ± 0.103 a
0.566 ± 0.236 a
0.286 ± 0.260 b
0.781 a
0.776 a
0.494 b
0.140
0.145
0.513
(H) Indice de diversidad genética de Nei (1973), (I) índice de Shannon, (Gst)
diferenciación genética, (Nm) flujo genético. Letras diferentes representan las
diferencias estadísticamente significativas (p=0.05).
Figura 4. Estimadores de la diversidad (% loci polimórfico, H, I) de la estructura
genética
del
frijol
por
provincia
fisiográfica
y
grupo
biológico.
Colecta
% Loci polimórfico
CHIAPAS
16.67±6.77
Chiapas 11675
10.62
Chiapas 11676
13.27
G - 19026C
14.16
Chiapas 28
26.55
Chiapas 30
21.24
Chiapas 32
21.24
Chiapas 41
4.42
Chiapas 42
24.78
Chiapas 44
15.93
Chiapas 45
13.27
Chiapas 47
1.77
Chiapas 48
13.27
Chiapas 49
21.24
Chiapas 50
15.04
Chiapas 51
24.78
Chiapas 52
21.24
Chiapas 6
20.35
Chinkuetec
16.81
CHIHUAHUA
G -22837
26.55
DURANGO
19.57±11.74
G – 10999
7.96
G – 11024
45.13
G – 11025A
7.96
G - 11025B
2.65
G – 11027
23.01
G – 11027A
30.97
G – 11028
7.08
G – 11030A
11.5
G – 11032
19.47
H
I
0.07±0.03
0.045
0.057
0.049
0.101
0.093
0.088
0.018
0.100
0.063
0.058
0.006
0.054
0.087
0.061
0.106
0.089
0.078
0.071
0.10±0.04
0.064
0.082
0.074
0.149
0.133
0.127
0.027
0.145
0.092
0.083
0.009
0.078
0.126
0.089
0.153
0.128
0.115
0.102
0.098
0.07±0.05
0.036
0.181
0.031
0.010
0.074
0.110
0.028
0.042
0.077
0.1454
0.11±0.07
0.051
0.264
0.045
0.015
0.113
0.164
0.041
0.063
0.112
Colecta
% Loci polimórfico
H
DURANGO
G – 11034
25.66
0.100
G - CCamp
16.81
0.065
G – ChInd
13.27
0.046
G - Salt2
41.59
0.169
G – Sbay1
17.7
0.058
G - SBay2
22.12
0.084
G – AgBla
18.58
0.079
G – LuMoy
10.62
0.039
G – 11029
30.09
0.110
GUERRERO
18.1±14.56
0.07±0.06
G – 1000
19.47
0.055
G – 10002A
45.13
0.184
Gro 11647
9.73
0.034
Gro 11661
0.88
0.002
Gro 11666
2.65
0.008
Gro 11671
24.78
0.100
Gro 11718
5.31
0.020
G – 11727
19.47
0.071
G - 12878
10.62
0.034
G-12879A
40.71
0.175
G - 12881A
20.35
0.084
GUANAJUATO 35.72±13.76 0.14±0.06
Gto 11667
2.65
0.010
G - 12892
25.66
0.101
G - 12893
55.75
0.233
G - 12904
45.13
0.186
G - 12905
37.17
0.112
G - 12906
38.05
0.151
G - 12908
32.74
0.140
G – 12909
42.48
0.177
Figura 5. Indices de diversidad genética por estado y colecta individual.
I
0.146
0.095
0.069
0.247
0.088
0.124
0.113
0.058
0.164
0.10±0.09
0.087
0.266
0.051
0.003
0.012
0.145
0.030
0.106
0.051
0.251
0.121
0.21±0.08
0.015
0.148
0.336
0.271
0.172
0.221
0.202
0.255
Colecta
% Loci polimórfico
H
I
GUANAJUATO
G - 12911
G - 12913
Gto Churi
JALISCO
G - 9995
G – 9998A
G - 12865
G -12934
Jal 12935
Jal 12939
Jal 12945
Jal 12952
Jal 12955
Jal 12957
Jal 12966
Jal 12977
G – 13029
G - 13030
MEXICO
11663
MICHOACAN
G - 10018A
G - 10019
G - 10019A
G - 11050
Mich 11652
Mich 11730
Mich 11733
G - 12888
G - 12889
Colecta
MORELOS
G - 12877
G - 12877B
G - 13019A
G - 13505
G - 443
Mor Oaxtepec
Mor UNAM
NAYARIT
G – 10538
OAXACA
Oax 11656
Oax 11660
Oax 11695
Oax 11698
Oax 11703
Oax 11729
Oax 11731
G - 12871
G - 12875
G - 12876
Oax Tilapa
OaxMaOax
OaxMontAlb
OaxPort
OaxSanAnt
OaxSanMiguel
OaxTeita
Colecta
% Loci polimórfico
H
I
MICHOACAN
41.59
0.172
43.36
0.146
28.32
0.129
23.70±12.07 0.09 ± 0.05
15.04
0.048
30.09
0.116
46.02
0.189
8.85
0.031
14.16
0.061
10.62
0.032
40.71
0.144
17.7
0.072
16.81
0.060
23.89
0.079
37.17
0.155
16.81
0.065
36.28
0.144
17.7
0.072
14.16
20.96±11.33
28.32
36.28
15.93
33.63
12.39
21.24
17.7
28.32
41.59
% Loci polimórfico
57.52
33.63
38.05
22.12
15.04
15.93
40.71
0.036
0.08±0.04
0.101
0.136
0.064
0.140
0.040
0.089
0.067
0.111
0.171
H
0.209
0.142
0.116
0.086
0.043
0.057
0.145
31.86
0.120
24.41±14.21 0.09±0.06
44.25
0.164
8.85
0.040
21.24
0.092
43.36
0.177
23.89
0.078
30.97
0.088
3.54
0.012
29.2
0.117
21.24
0.068
40.71
0.162
9.73
0.041
13.27
0.043
10.62
0.034
17.7
0.062
51.33
0.192
14.16
0.051
30.97
0.125
0.248
0.221
0.183
0.13 ± 0.07
0.075
0.170
0.273
0.046
0.088
0.049
0.214
0.104
0.089
0.121
0.223
0.096
0.211
0.105
0.059
0.12±0.06
0.150
0.201
0.093
0.202
0.062
0.128
0.099
0.162
0.248
I
0.311
0.203
0.180
0.126
0.068
0.085
0.217
0.177
0.13±0.08
0.242
0.056
0.132
0.257
0.119
0.139
0.018
0.171
0.104
0.236
0.059
0.066
0.052
0.093
0.283
0.076
0.181
G - 12895
25.66
0.079
G - 12896
16.81
0.069
G - 12899
11.5
0.038
G - 12902
23.01
0.091
G - 12903
23.01
0.079
G - 12960
6.19
0.024
G - 12961
12.39
0.036
G - 1950
0
0.000
JSG y LOS 151
17.7
0.072
JSG y LOS 327
44.25
0.148
JSG y LOS 80
13.27
0.059
Pátzcuaro
7.960
0.019
Tzintzuntzan
23.89
0.089
MORELOS
30.90±11.40 0.11±0.04
G - 10010
48.67
0.189
G - 10012
29.2
0.099
G - 10016
35.4
0.145
Mor 11691
30.97
0.121
Mor 11701
30.97
0.114
Mor 11704
32.74
0.120
Mor 11706
15.93
0.059
Mor 11707
31.86
0.123
Mor 11708
19.47
0.066
Mor 11709
34.51
0.126
Mor 11710
24.78
0.093
Mor 11711
25.66
0.091
Mor 11712
42.48
0.157
Mor 11716
26.55
0.107
G - 12872A
13.27
0.050
G - 12874B
45.13
0.173
Colecta
% Loci polimórfico
PUEBLA
G- 23429C
Xochitlán
SINALOA
G-12870A
ZACATECAS
G-12987
48.23±13.14
57.52
38.94
H
0.18±0.04
0.208
0.158
0.122
0.100
0.057
0.133
0.119
0.035
0.056
0.000
0.104
0.225
0.084
0.032
0.131
0.17±0.06
0.277
0.150
0.211
0.177
0.169
0.179
0.087
0.180
0.099
0.187
0.138
0.136
0.232
0.155
0.075
0.255
I
0.27±0.06
0.309
0.228
48.67
0.198
0.287
14.16
0.053
0.078
CULTIVADOS 24.83±12.08
Apaseo 95
18.58
M 38
22.12
Negro 8025
14.16
Negro Otomí
45.13
Negro Querétaro
21.24
0.10±0.05
0.070
0.088
0.058
0.189
0.077
a
0.14±0.08
0.104
0.128
0.085
0.272
0.114
Se representa el promedio de los índices de diversidad de las colectas
provenientes de los diferentes estados de la República Mexicana.
Figura 4. Indices de diversidad genética por estado y colecta individual
(continuación).
Distancia genética, Nei (1972)
Figura 6. Dendrograma (UPGMA) basado en la distancia genética de Nei (1972) de
124 accesiones de frijol silvestre, 17 enmalezado y de 5 cultivares de frijol común
de México.
Número de
colecta
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
Nombre
Chihuahua 22837
Chiapas 11675
Chiapas 11676
Chiapas 19026C
Chiapas 28
Chiapas 30
Chiapas 32
Chiapas 41
Chiapas 42
Chiapas 44
Chiapas 45
Chiapas 47
Chiapas 48
Chiapas 49
Chiapas 50
Chiapas 51
Chiapas 52
Chiapas 6
Chiapas Chinkuetec
Dgo 10999
Dgo 11024
Dgo 11025A
Dgo 11025B
Dgo 11027
Dgo 11027A
Dgo 11028
Dgo 11029
Dgo 11030
Dgo 11032
Dgo 11034
DgoCCamp
DgoChInd
Dgo Salt2
Dgo Salt1
DgoSBay
DgoSBay2
DgoAgBla
DgoLuMoy
Gro 1000
Gro 10002A
Gro 11661
Gro 11666
Gro 11671
Gro 11727
Gro 12878
Gro 12879A
Gro 12881A
Gto 11647
Gto 11663
Gto 11667
Gto 11718
Gto 12892
Gto 12893
Gto 12904
Gto 12905
Gto 12906
Gto 12908
Gto 12909
Gto 12911
Gto 12913
Gto 12987
Gto Churi
Jal 9998A
Mich 11730
Jal 12865
Jal 12895
Jal 12934
Jal 12935
Jal 12939
Jal 12945
Jal 12952
Jal 12955
Jal 12957
Jal 12966
Provincia Número de
Tipo
fisiográfica
colecta
silvestre
SMO
75
silvestre
SChG
76
silvestre
SChG
77
enmalezada
SChG
78
silvestre
SChG
79
silvestre
SChG
80
silvestre
SChG
81
silvestre
SChG
82
silvestre
SChG
83
silvestre
SChG
84
silvestre
SChG
85
silvestre
SChG
86
silvestre
SChG
87
silvestre
SChG
88
silvestre
SChG
89
silvestre
SChG
90
silvestre
SChG
91
silvestre
SChG
92
silvestre
SChG
93
enmalezada
SMO
94
silvestre
SMO
95
enmalezada
SMO
96
enmalezada
SMO
97
silvestre
SMO
98
enmalezada
SMO
99
silvestre
SMO
100
silvestre
SMO
101
silvestre
SMO
102
silvestre
SMO
103
silvestre
SMO
104
silvestre
SMO
105
silvestre
SMO
106
silvestre
SMO
107
silvestre
SMO
108
silvestre
SMO
109
silvestre
SMO
110
silvestre
SMO
111
silvestre
SMO
112
silvestre
SMS
113
silvestre
SMS
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enmalezada
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enmalezada
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enmalezada
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enmalezada
EN
144
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silvestre
EN
147
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EN
Nombre
Jal 12977
Jal 13029
Jal 13030
Jal 13505
Jal 9995
Mich 10018A
Mich 10019
Mich 10019A
Mich 11050
Mich 11652
Mich 11733
Mich 12888
Mich 12889
Mich 12896
Mich 12899
Mich 12902
Mich 12903
Mich 12960
Mich 12961
Mich 1950
Mich JSG y LOS 151
Mich JSG y LOS 327
Mich JSG y LOS 80
Mich Patzcuaro
Mich Tzintzuntzan
Mor 10010
Mor 10012
Mor 10016
Mor 11691
Mor 11701
Mor 11704
Mor 11709
Mor 11707
Mor 11708
Mor 11709
Mor 11710
Mor 11711
Mor 11712
Mor 11716
Mor 12872
Mor 12874B
Mor 12877
Mor 12877B
Mor 13019A
Mor 443
Mor Oaxtepec
Mor UNAM
Nay 10538
Oax 11656
Oax 11660
Oax 11695
Oax 11698
Oax 11703
Oax 11729
Oax 11731
Oax 12871
Oax 12875
Oax 12876
Oax Tilapa
OaxMaOax
OaxMontAlb
OaxPort
OaxSanAnt
OaxSanMiguel
OaxTeita
Puebla 23429
Xochitlán
Sin 12870A
Apaseo 95
M 38
N. 8025
N. Otomí
N. Querètaro
Tipo
silvestre
silvestre
silvestre
silvestre
silvestre
silvestre
silvestre
silvestre
silvestre
silvestre
silvestre
silvestre
silvestre
enmalezada
silvestre
silvestre
silvestre
enmalezada
silvestre
silvestre
silvestre
silvestre
silvestre
silvestre
silvestre
silvestre
silvestre
silvestre
silvestre
silvestre
silvestre
silvestre
silvestre
silvestre
silvestre
silvestre
silvestre
silvestre
silvestre
silvestre
enmalezada
silvestre
enmalezada
silvestre
silvestre
silvestre
silvestre
silvestre
silvestre
silvestre
silvestre
silvestre
silvestre
silvestre
silvestre
silvestre
silvestre
enmalezada
silvestre
silvestre
silvestre
silvestre
silvestre
silvestre
silvestre
silvestre
silvestre
silvestre
cultivada
cultivada
cultivada
cultivada
cultivada
Provincia
fisiográfica
EN
EN
EN
EN
EN
EN
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EN
EN
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EN
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EN
EN
EN
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LlCP
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LlCP
Figura 7. Accesiones silvestres, enmalezadas y cultivadas del dendrograma.