PROBLEMAS MÁS FRECUENTES DURANTE LA SECUENCIACIÓN
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7. PROBLEMAS MÁS FRECUENTES DURANTE LA SECUENCIACIÓN A) No se produce reacción o esta decae poco después de comenzar Posible causa No hay ADN o hay menos del necesario No hay cebador o la concentración es inferior a la necesaria El cebador no encuentra el sitio de hibridación El ADN presenta contaminación El cebador está mal diseñado o la temperatura de melting no es la adecuada El sitio de unión del cebador en el vector se ha perdido o dañado En los productos de PCR puede que los amplificados no sean el producto de la amplificación con los dos cebadores Posible solución Aumentar la cantidad de ADN Aumentar la concentración o cantidad de cebador Cambiar el cebador Volver a preparar el ADN Rediseñar el cebador Volver a clonar en el vector Cambiar de cebador B) Señal de baja intensidad. Unión débil del cebador. Posible causa Mala calidad del ADN ADN presenta estructura secundaria en el sitio de hibridación del cebador La concentración del ADN inferior a la necesaria El cebador utilizado en la secuenciación no es el adecuado: - Estructura secundaria - Tm del cebador demasiado baja Posible solución Volver a purificar el ADN Cambiar de cebador Aumentar la concentración Cambiar el cebador C) El cromatograma es correcto pero presenta mucho ruido de fondo Posible causa Existe un sitio secundario de unión del cebador que da lugar a picos extra La cantidad de ADN es insuficiente y la señal es demasiado baja El ADN presenta contaminación1 La PCR no fue especifica y existen amplicones contaminantes en la muestra Cebador mal purificado2 Fragmento de PCR mal purificado Posible solución Intentar eliminar añadiendo DMSO en la secuenciación o cambiar de cebador Aumentar la cantidad de ADN Purificar el ADN Cambiar de cebador Cambiar de cebador o purificar Eliminar los cebadores de la amplificación 1. En la secuenciación en capilares este problema (contaminación del ADN) es aún mayor al ser más sensible. 2. Puede verse una “secuencia sombra” (N-1). El cebador está compuesto por cadenas completas (N), pero una proporción de ellas contiene una base menos (N-1), esto da lugar a un cromatograma ilegible al tener picos superpuestos y desfasados. D) El cromatograma presenta dos secuencias superpuestas Posible causa El cebador tiene varias dianas El cebador de la PCR no se ha eliminado Cebador degenerado ADN subclonado existiendo dos sitios diana para el cebador universal utilizado1 Hay más de un ADN molde en la muestra2 PCR inespecífica: diana del cebador en ambos extremos, es decir, amplicón inespecífico generado por un solo cebador Posible solución Cambiar de cebador Purificar mejor el ADN Cambiar de cebador Secuenciar con otro cebador Repreparar el ADN Cambiar de cebador 1. Comprobar, si se ha arrastrado polinker durante la subclonación, que cebadores universales tienen sitio de hibridación duplicado y no utilizarlos en la secuenciación de esa muestra. 2. Asegurarnos de que partimos de una única colonia o que no es PCR múltiple con amplificaciones secundarias. E) La reacción comienza de forma normal pero existe doble lectura a partir de un determinado punto Posible causa Primer drimer del cebador utilizado en la secuenciación con los cebadores de amplificación Posible solución Volver a purificar el producto de PCR Clon múltiple, PCR múltiple Diana múltiple del cebador en el ADN Mutaciones frame shift Volver a preparar la muestra para obtener un único molde Cambiar de cebador F) La secuencia pierde bruscamente la señal y cae Posible causa Efecto de una estructura secundaria La cantidad entre el ADN y el cebador no es la equilibrada Formación de estructuras en la clonación que impiden una correcta secuenciación Presencia de compuestos contaminantes en la muestra ADN cortado, digerido a ese nivel o finalización de producto de pcr Posible solución Añadir DMSO Respetar las concentraciones y cantidades indicadas en las tablas de entrega de muestras Realizar PCR sobre el clon (cebadores universales o propios) y mandar a secuenciar el amplicón resultante y no el clon No resuspender nunca el ADN en solución que contenga EDTA - G) Parte inicial del cromatograma oscurecida por granes picos Posible causa Los cebadores forman dímeros (aunque el resto de la lectura es correcta) Posible solución Diseñar cebadores que no formen dímeros H) Presencia de picos saturados y fuera de escala en el cromatograma Posible causa Demasiada cantidad de ADN Posible solución Reducir la cantidad de ADN ( según figura en las tablas de entrega de muestras) I) La secuencia es normal pero aparece un pico de forma repentina Posible causa Terminadores no incorporados Posible solución Repetir la reacción de secuenciación J) Aparición de un pico anómalo con los colores correspondientes a todas las bases Posible causa Burbuja producida por el capilar Posible solución Volver a analizar la muestra o repetir la reacción de secuenciación K) Aparición de picos muy abiertos con la consecuente pérdida de resolución Posible causa Exceso de ADN (capilar) Presencia de sales o contaminantes en la muestra Problema del capilar Posible solución Respetar la cantidad y concentración de ADN Volver a purificar la muestra Repetir la secuencia L) Secuenciación de regiones ricas en GCs Posible causa Estructura secundaria, efecto de la alta Tm del tratamiento del ADN Posible solución Añadir DMSO en la secuenciación, aumentar la tª de desnaturalización a 98º , aumentar el numero de ciclos de PCR, linearizar el vector y secuenciar productos tras subclonarlos Cuando se secuencien organismos con un alto contenido GC indicarlo en las tablas que se adjuntan con la muestras a secuenciar M) Pérdida de la señal debido a una zona rica en G Posible causa Presencia de una estructura secundaria Homopolímero G Posible solución Repetir secuenciación añadiendo DMSO Secuenciar cadena complementaria N) Presencia de microsatélites Posible causa Presencia Microsatélites Repeticiones dinucleótidos GC Posible solución Secuenciar a partir del plásmido no del producto de PCR y añadir DMSO en la reacción de secuenciación Crear delecciones en esas zonas Cambios ya recomendados O) Presencia de zonas rica de GT o GA Posible causa Repeticiones dinucleótidos GT o GA Formación de dúplex que alteran estabilidad del cebador Posible solución Secuenciar la cadena complementaria Usar temperaturas de secuenciación más bajas que la estándar P) Presencia de una zona con poliA o poliT Posible causa Presencia de poliA/poliT1 Posible solución Secuenciar cadena complementaria Empleando cebador degenerado del tipo T25(A, G ó C) si no se conoce la base siguiente a la región poliA/poliT o los cebadores individuales específicos T25A, T25G ó T25C. La base 3´ del cebador permite anclar este a la secuencia al final del homopolímero, mejorando los resultados obtenidos 1. La polimersa “patina” dando lugar a una lectura ilegible después de la región homopolimérica, aunque los datos de antes de esa región sean de buena calidad. Este problema se puede producir en la reacción de secuenciación o en la de amplificación, aunque en este último caso no son aparentes cuando el fragmento se visualiza en un gel de agarosa. Q) Presencia de largos homopolímeros Posible causa Homopolímero causa deslizamiento de la polimerasa generándose una secuencia ilegible En los productos de PCRs pueden existir saltos, problemas que no existen en el material clonado Posible solución Secuenciar cadena complementaria Usar un cebador más interno Empleando cebador degenerado del tipo T25(A, G ó C) o los cebadores individuales específicos T25A, T25G ó T25C. Secuenciar el material clonado, además del amplificado. Si es posible, es mejor verificar la especificidad de la secuencia a partir de otros clones Imágenes tomadas de http://bmr.cribi.unipd.it/
