solución salina tamponada - BVS - INS

MINISTERIO DE SALUD
INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
CENTRO DE INFORMACIÓN Y DOCUMENTACIÓN CIENTÍFICA
CARACTERIZACION Y OPTIMIZACION
DEL ANTIGENO DEL LIQUIDO
HIDATIDICO DE OVINO Y SU
APLICACIÓN EN LA PRUEBA DE LATEX
SERIE INFORMES TÉCNICOS Nº23
FUENTES PAREDES FLOR DE MARIA DOLORES
INCIO DE YOSTI NELLY
LEVANO SARAVIA JUAN
GIOVANNA TORRES
SERAYLAN ORMACHEA, SILVIA
2006
2
MINISTERIO DE SALUD
INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
ORGANISMO PUBLICO DESCENTRALIZADO DEL SECTOR SALUD
CODIGO: 962081
TITULO DE LA INVESTIGACION
CARACTERIZACION Y OPTIMIZACION DEL ANTIGENO DEL LIQUIDO HIDATIDICO DE OVINO
Y SU APLICACIÓN EN LA PRUEBA DE LATEX
NOMBRES Y APELLIDOS DE LOS INVESTIGADORES
FUENTES PAREDES FLOR DE MARIA DOLORES: (Responsable) Químico Farmacéutico
Centro Nacional de Productos Biológicos ( CNPB) Instituto Nacional de Salud ,Av. Defensores del Morro 2268
Chorrillos, teléfono 467 [email protected]
INCIO DE YOSTI NELLY: Químico Farmacéutico
Centro Nacional de Productos Biológicos ( CNPB) Instituto Nacional de Salud. Av. Defensores del Morro 2268
Chorrillos, teléfono 467 4499.
LEVANO SARAVIA JUAN: Medico Veterinario
Centro Nacional de Productos Biológicos ( CNPB) Instituto Nacional de Salud, Av. Defensores del Morro 2268
Chorrillos, teléfono 4674499 [email protected]
GIOVANNA TORRES : Medico residente
Pachacayo - ESSALUD (SAIS TUPAC AMARU) TELEFONO:064-830051
SERAYLAN ORMACHEA, SILVIA Bióloga
Centro Nacional de Productos Biológicos ( CNPB) Instituto Nacional de Salud ,Av. Defensores del Morro 2268
Chorrillos, teléfono 467 4499.sseraylan@ins. gob. pe
3
RESUMEN
Objetivo: Caracterizar y optimizar el antígeno del liquido Hidatídico de Ovino y su aplicación en la
prueba de Látex como prueba tamiz ( de “screening” ) en sueros de pacientes con quistes de
Echinococcus granulosus . Materiales y Métodos: El antígeno del liquido Hidatídico se obtuvo de
Ovinos recién faenados de camales o mataderos con quistes fértiles y viables. El liquido Hidatídico
es centrifugado, dializado y liofilizado, se realiza la prueba de inmunoelectroforesis para verificar la
presencia de arco 5 y la prueba de wester blots para visualizar el perfil de bandas antigénicas del
liquido Hidatídico. A fin de determinar la concentración optima del antígeno del liquido Hidatídico
se prepara concentraciones de 12mg/mL ; 8 mg/mL; 4 mg/mL 2 mg/mL
y concentración de
suspensiones madres de las partículas de Látex 9,7% , 9% y 5% de 0,19 um de diámetro para
obtener diferentes tiempos de reacción de aglutinación. Se utilizó tampón de glicina (TG)al 8,2 y
buffer fosfato salina (PBS) pH 7,4 para sensibilizar las partículas de látex de poliestireno con el
antigeno del liquido hidatídico. Resultados: Se comprobó la reactividad del látex frente a sueros
controles positivos y negativos un volumen de 20 ul del reactivo de látex se unió ala misma
cantidad de cada suero control. Se consideró como criterio de positividad la presentación de una
aglutinación franca en sobrenadante claro, lo que hizo a este mas visible en el borde de la gota. La
reacción se hizo sobre una lamina de fondo oscuro. La concentración de 12 mg/ml del antígeno del
líquido Hidatídico y la preparación de partículas de Látex al 9,7 % con tampón de glicina (TG)al
8,2 y buffer fosfato salina (PBS) pH 7,4 dió como resultado una optima reacción de aglutinación
de 30 segundos con visible presencia de grumos y estable en el tiempo. Se evaluaron 40
sueros;15 sueros de Hidatidosis positivos, 5 sueros de pacientes con cisticercosis, 5 sueros de
pacientes con toxoplasmosis, y 15 sueros control negativo . De los 15 sueros de hidatidosis
positivos se obtuvo un 100% de sensibilidad para detectar anticuerpos en los sueros de enfermos
hidatídicos, y 83,3% de especificidad, no se obtuvieron reacciones cruzadas con los sueros de
cisticercosis y toxoplasmosis. La sensibilidad de la prueba látex para descubrir casos comprobados
de hidatidosis, fue de 100 %. A diferencia de las prueba de doble difusión arco 5 que solo alcanzan
una sensibilidad de 57 %. Conclusión: La prueba de aglutinación de látex sensibilizado con
antígeno de liquido Hidatídico de ovino es una prueba sencilla y aplicable como prueba tamiz para
el diagnostico de la hidatidosis en laboratorio y en el campo en áreas endémicas de poblaciones
humanas así también puede ser utilizada en estudios epizootiológicos en gran escala.
Key words:
Antígeno de líquido hidatídico, sensibilización de partículas de látex, prueba de
aglutinación de látex
4
INTRODUCCION
El presente trabajo de investigación se desarrolló en el Laboratorio de Control de Calidad Interno
del Centro Nacional de Productos Biológicos con financiamiento del Instituto Nacional de Salud del
año 2002 al 2006, el trabajo de investigación se planteo con el propósito de obtener el antígeno del
líquido hidatídico de ovino del camal de yerbateros del cercado de Lima y otros, el cual fue
colectado siguiendo la metodología del Centro Panamericana de Zoonosis (5,7) para luego
caracterizarlo y demostrar la presencia de la glicoproteína del arco 5, mediante la prueba de
inmunoelectroforesis, así como determinar su composición química respectiva, de otro lado, para
la obtención de resultados fue necesario seguir un proceso metodológico establecido en el
protocolo del proyecto que consistió en la optimización del antígeno del liquido hidatídico de ovino,
sensibilización de las partículas de látex con el antígeno hidatídico preparado, determinación de la
concentración optima para la marcación de partículas de látex, preparación del control de
partículas látex sin sensibilizar.
En cuanto a la caracterización y optimización del antígeno del liquido Hidatídico se consiguió
mediante el estudio microscópico y macroscópico verificándose la presencia del arco 5 por la
prueba de inmuelectroforesis y para visualizar el perfil de bandas se realizó mediante la prueba
de wester blots, de concentraciones de 12 mg/mL; 8 mg/mL; 4 mg/mL; 2 mg/mL; del antígeno del
Liquido Hidatídico determinándose la concentración óptima en 12 mg/mL para la sensibilización de
partículas de látex. Mientras que la concentración adecuado de las partículas de látex fue de 9.7%,
Utilizando un tampón de Glicina pH 8.2 y tampón salino de pH 7.4 con la cual se consiguió la
estabilización del sistema látex-antígeno-anticuerpo. Para evaluar la sensibilidad y especificidad
de la prueba se emplearon un panel de 40 sueros, distribuidos de la siguiente forma 15 de
hidatidosis, 5 de cisticercosis, 5 de toxoplasmosis y 15 sueros de control negativo. Encontrándose
una sensibilidad del 100% y una especificidad del 83.3%.
Bajo esta perspectiva el propósito de este trabajo fue caracterizar y optimizar el antígeno del
Liquido Hidatídico de ovino para la sensibilización de las partículas de Látex, utilizado en el
diagnóstico de hidatidosis, disponiendo de un reactivo de buena sensibilidad y especificidad con
la finalidad de mejorar la eficiencia del diagnóstico, esta prueba es rápida, eficiente y muy útil
para trabajos de campo estudios de prevalencia, vigilancia epidemiología y así monitorear los
programas de control de esta zoonosis, con lo cual sería de utilidad para el diagnóstico de este
problema de Salud Publica que tiene gran repercusión humana, animal así como en la economía
Nacional por ser una enfermedad que ataca a la población adulta económicamente activa
Ala fecha los ensayos de aglutinación en látex tienen gran versatilidad de uso en el diagnostico de
diferentes enfermedades ya que al ser sensibilizados con antígenos o anticuerpos específicos nos
permite obtener un reactivo alternativo como prueba tamiz o de “screening”
ANTECEDENTES
La hidatidosis es una zoonosis endémica de importancia para la salud publica causado por un
helminto denominado Echinococcus granulosus, en la gran mayoría de los países ganaderos,
aunado esto problemas económicos y sanitarios . donde los canales de desagüe están situados
en la superficie de la tierra y muchos animales al mismo que beben, depositan sus excretas
creándose así un circulo cerrado. Desde el punto de vista geográfico, la infestación hidatídica
aparece donde coexisten los tres tipos de huéspedes: hombre, rumiante portador de la larva
(principalmente ovinos) y carnívoros portadores de la tenia adulta sobre todo perros.
En el ciclo evolutivo del parásito el perro es el principal portador y es el huésped final del parásito
adulto. La oveja y a la cabra actúan como huéspedes intermediarios y el hombre es un huésped
accidental. Los huevos del parásito, que se encuentran en las heces de los caninos; entran en
contacto con los huéspedes intermediarios al ingerir este los huevos. En el intestino delgado el
embrión liberado del huevo atraviesa la mucosa intestinal y pasa ala circulación portal y llega al
hígado donde generalmente queda enquistado o puede pasar de ahí al pulmón y otros órganos
desarrollándose el quiste hidatídico. El ciclo continua cuando el perro ingiere las larvas al comer los
5
quistes que se encuentran en las vísceras de un animal infestado. El hombre entra al ciclo por
contacto con las heces del perro contaminado. En el hombre las localizaciones mas frecuentes son
hígado, pulmón y mas raramente a otros órganos ( cerebro y riñones) .
Esta enfermedad aparentemente benigna debe ser considerada grave, no solo por las
complicaciones evolutivas a que esta expuesto y que pueden ser mortales, sino por la terapéutica
compleja y la elevada morbimortalidad que en algunas casos alcanzan el 10%. Pueden
desarrollarse como quiste hidatídico único en el 80%, doble o múltiple ( 3-4%). Las infestaciones
masivas son raras. En el hígado generalmente se desarrolla en el lóbulo derecho.(11 )
Los quistes hidatídicos tiene tasa de crecimiento lento pudiendo permanecer asintomático por 10
años o mas. La clínica es variada, pueden presentar dolor en el hipocondrio derecho o epigastrio,
dispepsia alimentaría post prandial, síntomas de dolor biliar y/o ictericia en los complicados, fiebre
y leucocitosis en los abscedados, cuadros respiratorios
sobre todo disnea cuando hay
complicaciones en el tórax.
El diagnóstico se realiza con estudios serológicos, que sean compatibles con pruebas radiológicos
ecografías y Tomografía axial computarizada(TAC) .
La ecografía detecta aproximadamente el 90% de los quistes, es eficaz con relación al costo en las
regiones endémicas; sin embargo es menos precisa que la TAC para detectar y delinear la
extensión del quiste. La sensibilidad de la TAC es del 100% y es útil cuando el diagnóstico de la
hidatidosis es incierto o cuando se sospechan complicaciones como ruptura o infección de un
quiste ya que a menudo es difícil diferenciar entre estos quistes complicados y los abscesos
amebianos o piógenos.
La cirugía sigue siendo el tratamiento de elección para la mayoría de los individuos por esta razón
los reactivos de diagnostico deben contribuir en forma oportuna al diagnóstico de la enfermedad.
El antígeno más utilizado para la preparación de reactivos de diagnóstico es el líquido hidatídico
de ovino, las procedentes del hospedador que penetran a través de las membranas ,entre las
cuales se encuentran las albúminas y gammaglobulinas, enzimas, Lípidos, proteínas y al menos
ocho antígenos de origen parasitario, así como corpúsculos calcáreos libres, que pueden tener un
papel de Barrera frente al ataque del complemento. Se ha detectado mediante inmunoblots tres
patrones antigénicos diferentes: Ovino, Bovino, Humano, equino y suino, siendo los perfiles ovino y
humano casi idénticos.
Según Cordero del Campillo 1999 (8) En el líquido hidatídico existe también histamina,
aglutinógeno con actividad anafiláctica y un ingrediente citotóxico termoestable de bajo peso
molecular que podrá penetrar a través de la pared del quiste e interferir localmente ala acción de
las células inmunocompetentes, facilitando la supervivencia del parásito, también hay anticuerpos
inespecíficos ,inmunoglobulinas especificas (IgG2a e IgG2b), una poliexamina y tres poliaminas
(putresinas, espermidina y ornitina descarboxilasa). Se ha localizado células que se marcan con
diferentes lectinas, así como células que contienen adenosina trifosfatasa y fosfatasa alcalina . Los
protocoescolex metabolizan los carbohidratos hasta formar acido láctico y acético y producen
pequeñas cantidades de pirúvico y succínico)
ORIOL , y col en 1971 demostraron que el antígeno del liquido hidatidico de carnero por estudios
de cromatografía e inmunoelectroforesis presenta dos componentes antigénicos principales:
Antígeno 5 ó A cuyo componente principal es una Lipoproteína termolábil y el Antígeno B con
una composición lipoproteína de mayor estabilidad al calor.
SIRACUSANO en 1991 ( ) por SDS-PAGE e Inmunoblot identificó como principales bandas
12,16 , 20 y la de 38 kD que es una de las principales subunidades del antígeno 5.
SHEPHERD Y MC MANUS en 1987(23) reportaron que el antígeno 5 reaccionó en forma cruzada
con anticuerpos humanos de una gran variedad de estos helmintos y parte de esta reacción se
ha asociado con la presencia de fosforilcolina unido ala subunidad de 38 kD, siendo la presencia
de este componente el que podria estar dando inespecificadad a la subunidad de 38 kD . Los
mismos autores reportan que la subunidades 12 y 16 kD del antígeno B fuerón específicos para el
E. granulosus , sin embargo no todos los pacientes producen anticuerpos contra estas bandas.
IRABUENA Y COL en 2000, (13) evaluarón en cuanto a ala composición química del líquido
Hidatídico de Bovino extraido de quistes fértiles y no fértiles demostrando que el contenido de
carbohidratos y lípidos fue mucho mayor en los quistes fértiles
6
( Carbohidratos: 5.13 mg/mL vs 1.70 mg/mL ; Lipidos: 1,84 mg/mL vs 0,49 mg/mL en quistes
fértiles y no fértiles respectivamente). Esto es consistente con la mayor concentración de
carbohidratos y lípidos encontrados en la superficie de los protoescolex. Así mismo los autores
estudiaron por Western Blot los componentes inmunogénicos de ambos tipos de Líquido
hidatídico encontrando que la principal diferencia es la presencia de bandas de 38 kD y 116 kD
en el antígeno proveniente de los quistes fértiles. Ambas bandas han sido reconocidas por los
sueros de pacientes con hidatidosis (5).
IRABUENA Y COL en 2000, compararon la eficiencia del diagnóstico mediante la prueba de
ELISA empleando antígeno extraído de quistes fértiles de Bovino con y sin tratamiento previo con
meta periodato de sodio a fin de oxidar epítopes de carbohidratos presentes en el antígeno e
inhibir la presencia de fosforilcolina. concluyendo los autores que este tratamiento con meta
periodato de sodio en las condiciones de adsorción del ELISA aumenta la eficiencia del diagnóstico
en su sensibilidad y especificadad ( Sensibilidad del antígeno sin tratamiento previo 81% vs. 88%
del antígeno con tratamiento; especificidad del antígeno sin tratamiento 95% vs 96 % del antígeno
con tratamiento ; eficiencia del diagnóstico del antígeno sin tratamiento 89% vs. 93 % del antígeno
con tratamiento)
En los últimos años se han implementado diversas técnicas serológicas de diagnóstico para la
hidatidosis humana entre las que destacan Hemaglutinación indirecta (HAI), Aglutinación de Látex
(AL) , Doble difusión arco 5 ( DD5), inmunoelectroforesis arco 5 (IEF) Inmunoensayo ( ELISA) y
Western blot.
La prueba de látex es una reacción de aglutinación (AL) fue descrita por Fishman (1960) y
KAGAN ,(1968) para el diagnóstico de infección hidatídica, impregnando partículas de Latex
sensibilizadas con líquido hidatídico .
SZYFRES &KAGAN en 1963(25) evaluaron mediante la prueba de Látex impregnado con liquido
hidatídico, un conjunto de 221 sueros, entre los cuales se encontraban 23 casos de hidatidosis
quirúrgicamente comprobados, y sueros de pacientes con enfermedades por helmintos, protozoos,
bacterias y virus, indicaron un 100 % de sensibilidad para descubrir anticuerpos en los sueros de
enfermos hidatídicos, y 97 % de especificidad con los demás sueros.
BARBIERE et al 1993, (4)utilizando partículas de látex de poliestireno sensibilizadas con una
fracción lipoproteica purificada por cromatografia de afinidad con Acrylic -heparina a partir de
liquido hidatídico fértil de Bovino , demostró un 87% de especificidad y 88 % de sensibilidad vs. la
prueba convencional de ELISA con la misma fracción lipoproteica dando sensibilidad de 83 % y 87
% de especificidad.
La prueba de aglutinación de látex sensibilizado con antígeno de liquido Hidatídico de ovino se
basa en la interacción especifica antígeno-anticuerpo en las que por adsorción sobre la superficie
de las partículas de látex (sensibilización) magnifican o amplían la reacción antígeno anticuerpo
que ocurre cuando ellas se mezclan, las partículas de látex de poliestireno se unen al antígeno y
este al fragmento cristalizable (Fc) de moléculas de inmunoglobulinas G (IgG), estos anticuerpos
multivalentes se acoplan a múltiples antígenos adheridos a partículas de látex, se produce un
entramado que da como resultado una aglutinación ó agrupamiento visible de las micro esferas
semejante a una leche cortada(1,2,3).
la reacción de aglutinación se ve influenciada por exceso o escaso antígeno del liquido hidatídico
adherido a su superficie de las partículas, suspensión madre de partículas muy diluida o
concentradas o la presencia de exceso de anticuerpos en el proceso de reacción pudiendo no
observarse aglutinación y para estabilizar la reacción coloidal del sistema látex- antígeno se
hace uso de tampones o Buffers a pH adecuados. El control de estos factores permiten estabilizar
el sistema logrando la equivalencia Látex - antígeno - anticuerpo cuyo efecto es una reacción de
aglutinación optima (2).
Actualmente se utiliza la prueba de Doble difusión Arco 5 y la prueba de Western blot en el
diagnostico de la Hidatidosis, la prueba Doble difusión Arco 5 tiene limitaciones en su sensibilidad
(57 %) aunque su especificidad es muy buena (100%) pero demanda un tiempo prolongado para
obtener resultados; la prueba de Western blot tiene una sensibilidad de 80% y una especificidad
de 100% pero para diagnóstico rutinario resulta costoso, poco práctico y demanda mucho tiempo.
Por otro lado es importante resaltar que en el Perú, aun no se dispone de un mapa
Seroepidemiológico completo de la enfermedad por lo que es de vital importancia contar en
nuestro medio con reactivos de diagnóstico rápido que sea altamente sensible, especifico y
7
práctico que permita el análisis de un gran numero de muestras en un tiempo corto como es el
caso de la prueba de aglutinación de látex.
OBJETIVOS
Caracterizar las condiciones fisicoquímicas óptimas para la sensibilización de las partículas de
Látex, con el antígeno del Liquido Hidatídico de ovino para el diagnóstico de hidatidosis mediante
la prueba de látex.
MATERIAL Y METODOS
METODOLOGIA
CARACTERIZACION Y OPTIMIZACION DEL ANTIGENO HIDATIDICO:
Según la metodología del Centro Panamericana de Zoonosis (5,7) los quistes hidatídicos
infectados con larvas de Echinococcus granulosus, se obtuvo de Ovinos (carneros) recién
faenados de mataderos de Lima y provincia, el contenido acuoso llamado Liquido hidatídico se
extrae mediante punción - aspiración con aguja y jeringa, descartando los quistes calcificados
supurado o infectados.
Al microscopio se observó elementos formados sobre la membrana germinativa del quiste
Hidatídico como es escolex, protoescloex envainados de morfología ovoidea, protoescolex
desenvainados, presencia de ganchos rostelares intactos, abundantes corpúsculos calcáreos de
los protoescolex, cápsulas incubatrices y quistes hijos endogenos indicando fertilidad del quiste.
Para determinar la viabilidad del protoescolex in vitro (morfología,motilidad y capacidad de
evaginación espontánea de los protoescolex) se utilizó colorante vital ( Solución acuosa de eosina
al 1% ) los protoescolex viables no tomarón la coloración y los no viables se tiñen de color rojo.
Un vez obtenido el líquido Hidatídico transparente se adiciona azida de sodio 1g/L y EDTA 10mM ,
se sedimenta, decanta y el sobrenadante se centrifugó a 1000 g durante 30 minutos, se dializa a
4 o C frente a varios cambio de agua destilada y por varias horas. Se concentra hasta sequedad
por el proceso de Liofilización y se almacena a 4 º C.
El antígeno Hidatídico liofilizado se controló mediante la prueba de inmuelectroforesis (IEF) a fin
de verificar la presencia del arco 5 utilizando agarosa al 0,9% en solución tampón de Veronal pH
8,2 utilizando 200 mg/mL de Antígeno Hidatídico, consiste en separar las diversas fracciones
antigénicas presentes en el liquido Hidatídico (proteínas) y suero cargadas negativamente y bajo
la influencia de una campo eléctrico, migran en la dirección del electrodo de carga opuesta
(electrodo positivo o ánodo) a velocidades diferentes debido a su masa y carga neta separándose
una de otras.
Para visualizar el perfil de la bandas antigénicas frente a suero positivo de Hidatidosis se realizó
la prueba de Western Blot para ello se determinó las proteínas totales por el método Lowry 1951
en una muestra de 0,012 mg obteniéndose 3,671 g/ dl de proteínas Totales empleando un gel de
poliacrilamida al 12% y SDS 1 %, los antígenos fueron separados en condiciones de reducción ( 5
% 2 mercaptoetanol) y las proteínas antigénicas del Antigeno hidatídico son separadas por
electroforesis y después transferidas a una membrana de nitrocelulosa luego se bloquea con
leche descremada al 5 % en PBS, luego es lavado y coloca los suero positivo de Hidatidosis e
incubado por 24 horas, luego se realiza los lavados con PBS-T por 5 minutos cada uno , se
adiciona una solución de Anti-IgG humano marcado con peroxidasa apropiadamente diluido en
PBS-TL, incubar por 1 hora ,realizar los lavados con PBS- T 5 veces por 5 minutos y 1 vez con
PBS. Se realizó el revelado con una solución de DAB (Diamino bencidina) y peróxido de hidrógeno
al 30% ( H2O2) en PBS.
SOLUCIÓN SALINA TAMPONADA
Para la preparación de las partículas de látex y el antígeno del Liquido hidatídico se hace
uso de tampones o Buffer a fin de estabilizar el sistemas látex- antigeno. Solución Salina
Buffer fosfato (PBS) pH 7,4: Fosfato de potasio dibásico 1,82 g/L, Fosfato de sodio monobásico 0,22,g/L,
8
Cloruro de Sodio 8,76 g/L, Agua destilada c. s. p1000 mL. Solución Salina Tamponada de Glicina (SS
TG) pH 8,2 : Cloruro de Sodio 9,0 g., Cloruro de calcio 1,0 g,, Glicina7,31 g,, Merthiolate 0,100 g.,
Agua destilada c. s. p. 1000 mL.
PREPARACION DE LA SOLUCIÓN MADRE DE PARTICULAS DE LATEX
A partir de las concentraciones 9,7 % , 9% y al 5 % de partículas de látex Poliestireno de 0,19 um
de diámetro ( Bangs Laboratorios, Inc) se preparó suspensión madre (esquema 1) a fin de
optimizar los tiempos de reacción de aglutinación observándose reacción a los 30 segundos, 2
minutos y 4 minutos respectivamente.
Esquema 1
Partículas de Látex Comercial 0,19 u m
Suspensión al 9,7 %, 9% y 5%
1 m L de partículas de Látex
4 m L de tampón de PBS pH 7,4
Solución Madre de partículas de látex
OPTIMIZACION DEL ANTIGENO DEL LIQUIDO HIDATIDICO DE OVINO
Se prepara concentraciones de 12 mg/ mL ; 8 mg/mL; 4 mg/mL ; 2 mg/mL del antígeno de liquido
Hidatídico, para determinar la concentración optima del Antígeno Hidatídico. (esquema 2)
Esquema 2
24 mg Antígeno Hidatídico
2 mL tampón de Glicina
Centrifugar
30 minutos x 2000 rpm
Sobrenadante
0,5 mL
0,5 mL
+
0,25
-------------12 mg/mL 8 mg/mL
0,25
+
0,50
------4 mg/mL
0, 25 mL
+
1,25 mL Tampón de Glicina
------------2 mg/mL
9
SENSIBILIZACION DE LAS PARTICULAS DE LATEX CON EL ANTIGENO HIDATIDICO
PREPARADO
A 3 mL de tampón de glicina pH 8,2 se agrega 1.0 mL de la solución de antígeno de líquido
Hidatídico ala concentración óptima para su empleo en la prueba y se añade luego 0,6 mL de la
suspensión madre de partículas de Látex, se agita e incuba la mezcla durante 30 minutos a 37 oC
y luego se deja estabilizar por 15 días a 4 oC.
DETERMINACION DE LA
PARTICULAS DE LATEX
CONCENTRACION
OPTIMA PARA LA
MARCACION DE
Las suspensiones de Látex sensibilizados con las concentraciones de Antígeno del líquido
hidatídico de 12 mg/mL ; 8 mg/mL ;
4 mg/mL;
y 2 mg/mL se controlan con 10 sueros
positivos de pacientes de hidatidosis; y 10 sueros de control negativo.
PREPARACION DEL CONTROL DE PARTICULAS LATEX SIN SENSIBILIZAR
No es un fenómeno que aparezca con frecuencia se ha comprobado que algunos sueros
precipitan las partículas de Látex sin sensibilizar .Debido a esto se recomienda someter a todos
aquellos sueros que aglutinan las partículas de látex sensibilizadas (prueba de látex positiva) a un
control de aglutinación empleando partículas de látex sin sensibilizar.
Los sueros que presentan aglutinación con el reactivo de látex sensibilizado se someten a este
control siguiendo el mismo procedimiento anterior ,en aquellos sueros que aglutinen las partículas
de látex sin sensibilizar, la aglutinación de las partículas de Látex sensibilizadas no tienen ninguna
significación diagnóstica. (Ver esquema 3)
Esquema 3
SUSPENSION MADRE DE PARTICULAS
DE LATEX
- 0,3 mL de la suspensión Madre
- 2 mL de Tampón de Glicina
ENSAYO DE AGLUTINACION DE LATEX
La prueba de aglutinación en Látex se ha utilizado mucho y con buen éxito como prueba de
laboratorio rápida y sencilla. La prueba de efectúa utilizando una pipeta pasteur o micro pipeta se
deposita una cantidad 0,02 mL ó 20 uL del suero sobre una placa de vidrio y con otra pipeta se
deposita 0,02 ml ó 20 uL del reactivo de látex sensibilizado al lado del suero y se mezclan ambas
con un palillo o mondadientes mediante movimiento circular. El suero y el Antigeno deben estar
aproximadamente ala temperatura ambiente. Se balancea continuamente a mano durante 30
segundos y se lee a simple vista sobre fondo oscuro. la continua agitación es muy importante para
obtener resultados fiables.
10
Un suero positivo mostrará grumos de partículas látex, y un suero negativo se mantendrá
uniformemente turbio ó permanecen en suspensión. Algunos sueros pueden mostrar trazas de
aglutinación, que no se considera. La lectura de la prueba se hace mejor contra un fondo oscuro,
empleando una fuente indirecta de luz. Paralelamente se realiza utilizando un suero positivo
conocido, uno negativo y un control de partículas de látex como control del procedimiento.
La estabilidad del antigeno es buena y puede mantenerse en refrigeración hasta que se requiera
su uso.
SUEROS
Para el estudio de la sensibilidad y especificidad del reactivo se utilizó 40 sueros provenientes del
departamento de Junín zona de Pachacayo, Huancavelica y seroteca del laboratorio de Zoonosis del INS
15 sueros eran de pacientes con hidatidosis serologícamente positivo ala prueba de inmunoblots;
5 sueros de pacientes con cisticercosis, 5 sueros de pacientes con toxoplasmosis y 15 sueros de
control negativo.
RESULTADOS
Se caracterizó y optimizó el antígeno del liquido Hidatídico mediante el estudio microscópico y
macroscópico se verificó la presencia del arco 5 por la prueba de inmuelectroforesis y para
visualizar el perfil de bandas se realizó la prueba wester blots.De las concentraciones de 12
mg/mL ; 8 mg/mL ; 4 mg/mL ; 2 mg/mL del antígeno del Liquido Hidatídico se determinó que la
concentración 12 mg/mL fue la optima a ser sensibilizado con las partículas de látex.
se sensibilizó diferentes concentraciones de suspensiones madre a partir de partículas de Látex
al 9,7%,9% y 5% a fin de mejorar los tiempos de reacción de aglutinación, obteniéndose reacción
de aglutinación a los 30 segundos, 2 minutos y 4 minutos respectivamente, la preparación al 9,7 %
dio un resultado inmediato.
Utilizando tampón de Glicina a pH 8,2 y tampón fosfato salino a pH 7,4 se ha estabilizado el
sistema látex-antigeno- anticuerpo
Para evaluar la sensibilidad y especificidad de la prueba se examinaron 40 sueros (ver tabla 1,2 ).
De este conjunto 15 eran muestras de pacientes con hidatidosis, 5 sueros de pacientes con
cisticercosis, 5 sueros de pacientes con toxoplasmosis y 15 sueros de control negativo
De los15 sueros fueron de hidatidosis positivos, 12 fueron positivos y 3 resulto negativo a la
prueba de Látex. Los sueros de pacientes con cisticercosis, toxoplasmosis y los sueros de control
negativo de zona endémica resulto negativo.
Tabla 1
Prueba de Aglutinación de Látex
para el diagnostico de la Hidatidosis
Sueros de diagnóstico serológicamente positivos No muestras
con antígenos homólogos
examinadas
Negativo
Positivos
SUEROS DE HIDATIDOSIS
15
3
12
SUEROS DE CISTICERCOSIS
05
5
0
SUEROS DE TOXOPLASMOSIS
05
5
0
SUEROS CONTROL NEGATIVO
15
15
0
40
28
12
TOTAL
11
Tabla 2
Sensibilidad y especificidad de la prueba de Aglutinación de Látex
para el diagnostico de la Hidatidosis
SUEROS
REACTIVO DE LATEX
Positivos
SUEROS REACTIVOS
Negativo
total
3
15
15
15
28
30
12
VP
FP
0
SUEROS NO REACTIVOS
FN
TOTAL
VP = Verdaderos positivos
FN = Falsos negativos
SENSIBILIDAD:
VP
------------- x 100
VP +FN
ESPECIFICIDAD:
VN
------------- x 100
VN +FP
VN
12
VN = Verdaderos negativos
FP = Falsos positivos
12
--------------- X 100 = 100%
12 + 0
15
--------------- X 100 = 83,3%
15 + 3
DISCUSION
El diagnostico serológico de la echinococosis quística durante los últimos años se enfocó a mejorar
las técnicas de diagnóstico tanto en su sensibilidad como en su especificidad los cuales varia de
acuerdo ala naturaleza, pureza, calidad de los antígenos empleados y la sensibilidad y
especificidad intrínseca de las técnicas serológicas frente alas respuestas del huésped.
La fuente mas importante de antigeno para el diagnostico de esta parasitosis es el liquido
hidatídico contenido en el quiste o estado larvario del helminto cuya composición según Cordero
del Campillo M.1999 nos da información de lo complejo que es su composición química en:
histamina, aglutinógeno (actividad anafiláctica) y un ingrediente citotóxico termoestable de bajo
peso molecular (este penetra a través de la pared del quiste e interfiere localmente ala acción de
las células inmunocompetentes, facilitando la supervivencia del parásito) también hay anticuerpos
inespecíficos, inmunoglobulinas especificas (IgG2a e IgG2b),una poliexamina y tres poliaminas
(putresinas, espermidina y ornitina descarboxilasa) así como células que contienen adenosina
trifosfatasa y fosfatasa alcalina.
La prueba de inmunoelectroforesis es utilizada como criterio de control de calidad del antigeno
según Capron y sus colaboradores (1967) demuestran que al comparar el antigeno producido con
un antigeno de referencia frente a un suero anti líquido hidatídico de referencia se verifica la
formación del arco 5 bien definido, su morfología y ubicación es imagen en espejo de la morfología
y ubicación del arco 5 resultante de la interacción del anti suero patrón y el antigeno de referencia
12
que según Capron y et- al 1970; Yarzabal y Capron,1971 este arco 5 es de particular importancia
por su especificidad para Echinococcus granulosus.
ORIOL, y col en 1971 demostraron que el antígeno del liquido Hidatídico de ovino por estudios de
cromatografía e inmunoelectroforesis presenta dos componentes antigénicos principales: Antígeno
5 ó A cuyo componente principal es una Lipoproteína termolábil y el Antígeno B con una
composición lipoproteína de mayor estabilidad al calor, encontrado en la muestra utilizada en la
preparación del antigeno del Liquido Hidatídico.
para visualizar el perfil de bandas se realizó la prueba wester blots observándose un perfil típico
del antígeno Hidatídico a acuerdo alo encontrado por Sirucusano en 1991 por SDS-PAGE e
Inmunoblot se identificó como principales bandas 12,16 , 20 y la de 38 kD que es una de las
principales sub unidades del antígeno 5.
Así como se ha indicado que la calidad, pureza y naturaleza del antigeno influyen en las
preparaciones de los reactivos de diagnostico, también influye la concentración del antigeno del
Liquido Hidatídico, las partículas de látex y los sistemas buffer a diferentes pH como se describe
a continuación: se preparó concentraciones de 12 mg/mL, 8 mg/mL, 4 mg/mL 2 mg/mL de antigeno
del Liquido Hidatídico en la concentración 12 mg/mL se observa un mejor agrupamiento de las
micro esferas semejante a una leche cortada indicando en este caso que un escaso antigeno
adherido alas partículas de látex no permite visualizar la equivalencia antigeno- anticuerpo cuyo
efecto es una reacción de aglutinación optima. Siendo esto uno de los factores a considerar en
este tipo de reacción.
Así mismo se preparó suspensiones madres a partir de concentraciones de partículas de látex al
9,7 %, 9 % y 5 % se obtiene en 30 segundos, 2 minutos y 4 minutos reacción de Aglutinación
respectiva, la concentración al 9,7% dio una reacción de aglutinación inmediata indicándonos que
las suspensiones madres de partículas de látex muy diluida toman un tiempo mayor en aglutinar.
según Molina Bolivar y colaboradores 1998 sugieren el uso de tampón de reacción formado por
ácido bórico (H3B03) 0,015M a pH 8 con una concentración de Mg (N03)2 superior ó igual a 0,3M
mas 0,170 M de cloruro de sodio (NaCl) para mejorar la estabilidad pero utilizando los tampones
buffer fosfato pH 7,4 según la nota técnica #205 Bangs laboratories, Inc y tampón de glicina
segúnTécnicas para el diagnostico inmunológico de la Hidatidosis Humana 1974, podemos
observar una adecuada estabilidad coloidal de las partículas látex sensibilizadas con el antigeno
del liquido hidatídico.
De los 15 sueros de enfermos de Hidatidosis confirmado el reactivo de aglutinación de látex
preparado nos ha detectado 12 sueros.
No se observó reacción cruzada con los sueros de cisticercosis, toxoplasmosis y el suero control
negativo resulto negativo.
De acuerdo a estos resultados la prueba es de 100% sensible para detectar anticuerpos en los
sueros hidatídicos y 83,3% especifica con los demás sueros. Solo tres pacientes hidatídico nos dio
resultado negativo ala prueba de látex para el diagnostico de la hidatidosis
La sensibilidad obtenida en el reactivo de látex preparado es igual al encontrado SZYFRES
&KAGAN en 1963 quienes evaluaron mediante la prueba de Látex impregnado con liquido
hidatídico, un conjunto de 221 sueros, entre los cuales se encontraban 23 casos de hidatidosis
quirúrgicamente comprobados, y sueros de pacientes con enfermedades por helmintos, protozoos,
bacterias y virus, indicaron un 100 % de sensibilidad para descubrir anticuerpos en los sueros de
enfermos Hidatídicos, y 97 % de especificidad con los demás sueros.
Y por Devi Chandrakesan S Parija S.C. en 2003 (9) quien aplicó la prueba de aglutinación de
Látex sensibilizado con suero hiper inmune(anticuerpos hidatídicos) obtenidos en conejos Nueva
Zelandia para detectar antígenos en el liquido Hidatídico de pacientes con quiste, sometidos a
cirugía obteniendo un 100% de sensibilidad y no mostrando reacción cruzada con otros antígenos
según el autor utilizan anticuerpos para sensibilizar las partículas de látex.
La prueba de Látex es un prueba tamiz (de “screening” ) es útil, simple y poco costoso para
encuestas epidemiológicas de un gran numero de muestras de sangre en áreas endémicas.
El examen radiográfico de un gran numero de pobladores rurales, con ocasión de la campaña
antituberculosa en Uruguay, ha indicado la presencia de quistes hidatidicos pulmonares en
muchas personas sin síntomas clínicos. Datos similares los obtuvo Mc Carthy en Nueva Zelandia
basándose en exámenes de autopsia.
13
Las tasas de prevalencia de hidatidosis de poblaciones humanas en áreas endémicas se basan
sobre todo en datos de casos clínicos-quirúrgicos. Se sabe, sin embargo, que los casos clínicos
son solo una parte del total de ellos y no indican la verdadera prevalencia de la infección
La prueba de aglutinación látex es aplicable a estudios en gran escala, en diferentes especies
animales, tanto en los huéspedes intermediarios, como en el perro, puede ser importante en
encuestas epizootiologicas y para apreciar el valor de distintas medidas de control. se empleo en
Nueva Zelandia con sueros animales y los resultados fueron prometedores .
Muestras de sangre obtenidas para otros propósitos pueden ser usadas para estas encuestas, la
prueba puede ser hecha sin dificultad tanto en el laboratorio como en el campo teniendo como
ventaja de no requerir equipo especial; sin embargo requiere una ulterior evaluación con la prueba
de wester Blots, DD5 u otros para confirmar el diagnostico.
La prueba de látex es promisoria como procedimiento rápido de tamiz, para otras enfermedades
parasitarias.
CONCLUSION
La Hidatidosis es una zoonosis de importancia en Salud publica, donde los sistemas de
diagnostico deben ayudar a confirmar el diagnostico clínico utilizando antígenos estandarizados
para la correcta selección de los pacientes que necesiten tratamiento.
La prueba de aglutinación de látex sensibilizado con antígeno de liquido Hidatídico de ovino es
una prueba sencilla y aplicable como prueba tamiz para el diagnostico de la hidatidosis en el
laboratorio y en campo.
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS REVISADAS
1) BANGS LABORATORIES.INC. TECH NOTE # 205 REV 002
ACTIVE: 8/31/99 “
COVALENTCOUPLING” en linea. Fecha de acceso 26 de septiembre 2003. http:
//www.bangslabs.com
2) BANGS LABORATORIES .INC. TECH NOTE # 201 REV 001 ACTIVE: 8/29/99 “ WORKING
WITH MICROSPHERES” en linea. Fecha de acceso 2 de Marzo 2002. http:
//www.bangslabs.com
3) BANGS LABORATORIES .INC. TECH NOTE # 301 REV 001
ACTIVE: 8/2/99 “
INMUNOLOGICAL APPLICATIONS” en linea. Fecha de acceso 20de Marzo 2004. http:
//www.bangslabs.com
4) BARBIERI M, STERLA at. al 1993. HIGH PERFORMANCE LATEX REAGENT FOR HYDATID
SEROLOGY USING AN Echinococcus granulosus LIPOPROTEIN ANTIGEN FRACTION
PURIFIED FROM CYST FLUID IN ONE STEP. REV.INT. J. PARASITOL; 23(5): 565’72,1993
AUG.
5) CENTRO PANAMERICANO DE ZOONOSIS . 1979 . PRUEBA DE DOBLE DIFUSION ARCO 5
PARA EL DIAGNOSTICO DE LA HIDATIDOSIS HUMANA. NOTA TECNICA No 22 –SET
BUENOS AIRES,RAMOS MEJIA.
6) CORREA TINEO, SANTOS, et. al 2000. HIDATIDOSIS HEPATICAÑREVISION DE CASOS
INTERVENIDOS QUIRURGICAMENTE EN EL HOSPITAL MILITAR CENTRAL. LIMA- REVIS.
DIAGNOSTICO. VOL. 3 NUMERO 3-JULIO 2000.
7) CENTRO PANAMERICANO DE ZOONOSIS,1974. TECNICAS DE DIAGNOSTICO DE
HIDATIDOSIS HUMANA .SERIE DE MONOGRAFIAS CIENTIFICAS Y TECNICAS.
ARGENTINA.
8) CORDERO DEL CAMPILLO F. A.- 1999.COMPENDIO DE PARASITOLOGA
VETERINARIA.MCGRAW –HILL INTERAMERICANA.- MADRID
9) DEVI CHANDRAKESANS, PARIJA SC.(2003) LATEX AGGLUTINACION TEST (LAT) FOR
ANTIGEN DETECTION IN THE CYSTIC FLUID FOR THE DIAGNOSIS OF CYSTIC
ECHINOCOCCOSIS. DAN Y MICROBIOL INFECT DIS; 45(2)123- 126 –INDIA.
10) FERNANDEZ , EDUARDO D. – 2003. ANTIGENOS Y PRUEBAS INMUNOLÓGICAS EN LA
SEROLOGIA DE LA HIDATIDOSIS. FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES –UNIVERSIDAD
NACIONAL DE LA PATAGONIA-ARGENTINA
11) HERRERA FABIAN, PEDRO. TESIS 1996: HIDATIDOSIS HEPATICA EN LOS SERVICIOS
DE CIRUGIA DEL HOSPITAL DOS DE MAYO 1991-1995.
14
12) GONZALES DE BUITRAGO,1992. MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TECNICOS PARA EL
DIAGNOSTICO SEROLOGICO DE LA HIDATIDOSIS HUMANA.. SERIE DE NORMAS
TECNICAS No22)
13) IRABUENA, ALBERTO AND COL. 2000. CARACTERIZATION AND OPTIMIZACION OF
BOVINE Echinococcus granulosus CYST FLUID TO BE USED IN IMMUNODIAGNOSIS OF
HYDATID DISEASE BY ELIZA. Rev. Inst.Med. Trop. S. Paulo vol. 42 n. 5 San Paulo
Sept/Oct. 2000.
14) ORTONA E. SIRACUSANO UN, CASTRO, RIGANO R. MUHLSCHLEGEL F.IOPPLO ET. AL
1995 EL ANTICUERPO MONOCLONAL ANTIGENO B DE E.GRANULOSUS PARA LA
PURIFICACION Y DESCUBRIMIENTO DE ANTIGENO B-APPL.PARASITOL 1995 36:220 5
15) LARRIEU .E.
V.M. VARELA-DIAZ. 1983 .HIDATIDOSIS HUMANA:APORTE DEL
INMUNODIAGNOSTICO ALA DETECCION Y REGISTRO DE CASOS EN PROVINCIAS DE
RIO NEGRO,ARGENTINA E.J.BOL-CHILE-PARASIT.;83-9
16) MINISTERIO DE SALUD. DIRECCION DE SALUD-DIRECCION DE SALUD .1998 PASCO,
PROGRAMA CONTROL DE ZOONOSIS.
17) MOLINA BOLIVAR , JOSE ANTONIO; GALISTEO GONZALES, FRANCISCO; HIDALGO
ALVAREZ, ROQUE. 1998. TAMPÓN DE REACCION PARA ESTABILIZAR PARTICULAS
LATEX- IgG PARA TEST DE INMUNOAGLUTINACION
18) MUZULIN, P, KAMENETZK Y L , GUTIERREZ A, NAIDICH A, ROSENZVIT, M. , GUARNERA ,
E. ANÁLISIS DE LA VARIABILIDAD GENETICA DEL ANTIGENO B DE E. Granulosus
19) PLANCHART, SANDRA, BOTTO, CARLOS, ALARCÓN DE NOYA, BELKIS et al 1994EVALUACIÓN DE LAS TÉCNICAS DE DOBLE DIFUSIÓN, ENSAYO INMUNOENZIMATICO E
INMUNOBLOTTING EN EL DIAGNOSTICO DE LA HIDATIDOSIS HUMANA EN AREAS
TROPICALES. REV. INST. MED. TROP. S. PAULO, VOL 36 No 3,BRASIL
20) ROXANA BENITES VILLACORTA, 1996 .TESIS HIDATIDOSIS EN EL HOSPITAL
ARZOBISPO LOAYZA, TECNICAS QUIRURGICAS.
21) KANGAR, J.R.; KAUSHIK,SP.; SAWHNEY, I.M.S. et al .1992. SPECIFIC ANTIBODIES IN
SERUM
OF
PATIENTS
WITH
HYDATIDOSIS
RECOGNISED
BY
INMUNOBLOTTING,J.med.Microbiol,36: 46-51, 1992
22) SANCHEZ ROMANI. 1995. TESIS “DETERMINACION ACAO DE ANTIGENOS RELEVANTES
DA FORMA LARVAR EQCHINOCOCUS GRANULOSUS; PADRIONIZACAO E APLICAODO
“INMNOBIOT” NO DIAGNOSTICO DA HIDATIDOSE HUMANA.” RIO DE JANEIRO.
23) SHEPHERD, J AND MCMANUS,D. 1992 . SPECIFIC AND CROS-REACTIVE ANTIGENS OF
Echinococcus granulosus INFECTION.Ann. Trop.Med.Parasitol 86(5): 503-509,
24) STERLA,S ; LJUNGSTROM,I. ANS NIETO,A. 1996. MODIFIED ELIZA FOR HYDATID
SERODIAGNOSIS
THE
POTENCIAL
OF
PERIODATE
TREATMENT
AND
PHOSPHORYLCHOLINE INHIBITION. Serodiag.Immunother.infec. Dis. 8: 145-148,1996
25) SZYFRES, BORIS; KAGAN, IRVIN G. 1963. PRUEBA MODIFICADA DE AGLUTINACIONDE
LATEX COMO PROCEDIMIENTO TAMIZ PARA HIDATIDOSIS. Boletín de la OPS; 54(3):20812 Mar.1963
26) UNMSM; GUIAS PRATICAS PARASITOLOGIA .2005. López Urbina,Tereza, Casas Astos Eva;
Chávez Velásquez Amanda y Serrano Martínez, Marcos
27) VASQUEZ MEDINA, NEMESIO .1974 TESIS HIDATIDOSIS PULMONAR EN EL SERVICIO
SANTA ROSA DEL HOSPITAL DOS DE MAYO.
28) VILLAVICENCIO, PROCEDIMIENTOS DE PURIFICACION CARACTERIZACION DE LAS
PROTEINAS, BIOQUIMICA.
29) WOODWARD, M ; YOUNG JR. W.W. & BLOODGOOD,R.A..DETECTION OF MONOCLONAL
ANTIBODIES SPECIFIC FOR CARBOHYDRATE EPITOPES USING PERIODATE
OXIDACION.J.immunol.Meth,78. 143.153.19985.