Soluciones Objetivos Que el alumno: 1. Identifique la existencia de soluciones en los sistemas biológicos. 2. Explique los cálculos y procedimientos para preparar soluciones porcentuales, molares y normales, así como las diferentes diluciones de éstas. 3. Presente ejemplos de soluciones utilizadas en medicina (solución isotónica, Ringer, Darrow y Hartman). Responda a las siguientes preguntas: 1. ¿Qué es una solución? 2. ¿Cuántas clases de soluciones existen? 3. ¿Qué significan los siguientes términos: mol, solución molar y solución normal? 4. ¿Qué significan: v/v, p/v, p/p y ppm? 5. ¿Cuál es la composición de las siguientes soluciones: solución isotónica de cloruro de sodio, suero glucosado a 5%, Ringer-lactato? 6. ¿Cuáles son los tipos de soluciones que existen in vivo? Mencionar ejemplos. 7. ¿Qué es una solución isotónica? 8. ¿Qué es una solución osmolar? 9. ¿Cómo se calcula la osmolaridad de una solución? 10. ¿Qué les pasa a los eritrocitos cuando se ponen en contacto con soluciones salinas de diferente osmolaridad? 11. ¿Qué se entiende por dilución y dilución seriada de las soluciones? Material Por equipo: • 3 vasos de precipitado de 10 ml • 3 pipetas de 1.0 ml • 3 pipetas de 5.0 ml • 3 pipetas de 10.0 ml • Gradilla con 6 tubos de ensayo •Eritrocitos humanos lavados en solución. • Salina isotónica • Solución de azul de metileno al 1.0% • Cloruro de sodio en cristales (NaCl) • Balanza granataria Por grupo: • 1 Microscopio marca Leica. Procedimiento 1. Hacer los cálculos para preparar una solución de KCl al 3%. 2. Hacer los cálculos para prepara una solución de CaCl2 0.25 M se requieren 15 ml. 3. Calcular el volumen de H2SO4 se requiere para preparar una solución 3N 40 ml volumen final. 4. Hacer los cálculos correspondientes para comprobar que la solución a 0.9% de NaCl es isotónica con respecto al plasma (ver pag. 92). Considerar que: a) El cloruro de sodio se disocia en solución acuosa en los iones sodio y cloruro, por lo que la concentración iónica se duplica (1 mmol/l = 2 mosm/l). b) La presión osmótica normal del plasma es de 290-310 mosm/l. 5. Preparar 20 ml de una solución de NaCl a 4.5% (etiquetar como solución 1). 6. A partir de la solución anterior, preparar 25 ml a 0.9% (solución 2) y 50 ml a 0.045% (solución 3). 7. Colocar en tres tubos de ensayo las diferentes soluciones de cloruro de sodio preparadas en los puntos 1 y 2. Con la ayuda de un gotero (dejando caer lentamente por las paredes del tubo) 2 gotas de eritrocitos lavados. Mezclar con cuidado y dejar reposar a temperatura ambiente unos minutos. Valorar el grado de hemólisis que sufren los eritrocitos cuando se ponen en contacto con las diferentes soluciones. 8. Hacer los cálculos necesarios para preparar otras soluciones, por ejemplo: 500 ml de etanol a 45 % (a partir de etanol a 96 %).Expresar en meq/l una concentración de calcio de 11 mg/dl. Una solución contiene 14 g de glucosa en 25 ml. ¿Cuál es la concentración molar de la solución? A un enfermo hay que inyectarle 15 g de KCl y 126 g de glucosa (C6O6H12). ¿Cuánta agua habrá que añadirles para que resulte un suero 0.4 osmolar? 9. Calcular la osmolaridad a partir de la composición de algunas soluciones como Dextrosa a 10 % en solución salina a 0.45%. Dextrosa a 5 % en solución salina a 0.2 %. Hartman, Ringer y Darrow. 10. Hacer la dilución y redilución (dilución seriada) de la solución de azul de metileno como se muestra en el siguiente cuadro: DILUCIÓN SERIADA DE AZUL DE METILENO Tubo H2O Sol de azul Volumen de (ml) de metileno transferencia 1 2 0.5 ml* 2 2 0.5 ml 3 2 0.5 ml 4 2 0.5 ml 5 2 0.5 ml 6 2 0.5 ml *Nota: para mezclar al hacer las diluciones se debe succionar y soplar con cuidado la pipeta en cada tubo varias veces antes de transferir la dilución al siguiente tubo. Resultados 1. Expresar en forma ordenada los cálculos efectuados para cada uno de los ejercicios. 2. Deducir el movimiento o no del solvente cuando se ponen en contacto eritrocitos con soluciones hipo, hiper e isoosmóticas. 3. Calcular la dilución y la concentración de azul de metileno en cada uno de los seis tubos de la dilución seriada (ver pág. 93). Asegúrese que la coloración obtenida disminuya gradualmente conforme avanza la dilución. REFERENCIAS 1. Villazón SA, Cárdenas CO, Villazón DO, Sierra UA. Fluidos y electrólitos. México: JGH Editores; 2000. 2. Peña-Díaz A, Arroyo BA, Gómez PA, Tapia IR, Gómez EC. Bioquímica. Undécima reimpresión de la 2a. ed. México: Editorial Limusa; 2004. 3. Laguna J, Piña E. Bioquímica de Laguna. 5a.ed. México: Editorial El Manual Moderno; 2002: p. 41-56. 4. Holum JR. Fundamentos de química general, orgánica y bioquímica para ciencias de la salud. México: Editorial Limusa Wiley; 2001. 5. Farias GM. Química clínica. Décima edición México: Editorial El Manual Moderno; 1999. 6. Bloomfield MM.Química de los organismos vivos. México: Editorial Limusa; 1997. INSTRUCCIONES PARA EL USO DEL MICROSCOPIO MARCA LEICA 1. Nunca use un adaptador entre el cable y la fuente de alimentación. 2. Use siempre el microscopio sobre una superficie dura y estable. 3. Conecte el cable de alimentación del microscopio a una toma de corriente con conexión a tierra. Se suministra un cable de tres terminales con toma a tierra. 4. Encienda el microscopio girando el interruptor de control de la iluminación situado en la parte inferior izquierda del instrumento. 5. Coloque el interruptor de control de la iluminación en el nivel más bajo. El control de iluminación le permite ajustar la intensidad de luz. 6. Abra completamente el diafragma de apertura del condensador girando el anillo hacia el extremo derecho. 7. Usando el botón de enfoque del condensador, suba el condensador hasta el extremo superior de su desplazamiento. Iluminación critica únicamente: si el desplazamiento del condensador es excesivo, limítelo con el tornillo situado debajo de la platina hasta que la lente superior del condensador se encuentre debajo de la superficie de la platina. 8. Coloque la preparación de la muestra con la muestra en la platina. muestra con precisión utilizando el mando de enfoque micrométrico. 11. Ajuste los tubos oculares a la distancia de los ojos. 12. Al término del uso del microscopio retirar la muestra de la platina. 13. Bajar la platina hasta el tope y regresarla a su posición original si es necesario. 14. Colocar el revolver de los objetivos de manera que el objetivo de 4X sea el que quede en dirección de la lámpara. 15. Desconectar cable. el equipo y enrollar el 16. Limpiar la platina y oculares con un paño humedecido con metanol o con un limpia cristal comercial. 17. Colocar al microscopio la funda contra el polvo para mantenerlo en buenas condiciones físicas y mecánicas. Partes del microscopio: 1) -Oculares. 2) -Revolver con 4 objetivos 4X, 10X, 40X y 100X. 3) -Platina. 4).-Diafragma. 5) -Lámpara. 6).-Tornillo de la platina para desplazar la muestra. 7).-Interruptor de control de la iluminación. 8).-Tornillo macrométrico. 9).-Tornillo micrométrico. 9. Gire el revólver hasta situar el objetivo 4X en la posición de trabajo. (pag X) 1 10. Suba la platina girando el mando de enfoque macrométrico hasta que observe la preparación y, finalmente, enfoque la 2 6 9 8 7 3 4 Práctica 2 5 Práctica 2 Regulación del equilibrio ácido-base después del ejercicio muscular intenso y de la ingestión de bicarbonato de sodio Objetivos 1. Al finalizar la práctica, el alumno constatará las actividades reguladoras del pulmón y el riñón para mantener el equilibrio ácido-base en condiciones que tienden a romperlo. 2. Mediante la determinación del pH observará la variación de la concentración de hidrogeniones en la orina de un individuo que ha realizado ejercicio muscular intenso. 3. Relacionará los resultados obtenidos con los cambios metabólicos originados por el ejercicio muscular intenso. Conteste las siguientes preguntas: 1. ¿Por qué es importante que se mantenga constante, dentro de ciertos límites, el pH en el organismo? 2. ¿Cuáles son las fuentes de iones H + en el organismo? 3. ¿Cuáles son los sistemas reguladores que facilitan la eliminación del H+ producido en el organismo con el fin de mantener constante el pH sanguíneo? 4. ¿Cuáles son las reacciones de formación del ácido carbónico (H2CO3) a partir de CO2 y H2O, y de su disociación para formar el ion bicarbonato? Escríbalas. 5. ¿Qué sistemas amortiguadores participan directamente en la regulación del pH sanguíneo? 6. ¿Cuáles son los sistemas extrasanguíneos que tienden a mantener el pH extracelular? Escriba la ecuación de Henderson Hasselbalch aplicada al sistema y HCO3–/H2CO3 y, con base en ella, conteste la siguiente pregunta: 1. ¿Cómo participan el aparato respiratorio y el riñón en el control del pH sanguíneo? Material • Diez probetas o vasos de precipitado. • Orina. • Potenciómetro. • Piceta. Método Un alumno por equipo desayunará o comerá normalmente (evitar ingestión de jugos ácidos); después hará lo que se indica a continuación: 1. Tomar 250 ml de agua una hora antes de la clase práctica. Vaciar la vejiga y descartar esa orina. 2. Tomar 250 ml de agua inmediatamente antes de la clase práctica. 3. Orinar en un vaso de precipitado de 100 ml. Anotar el volumen de la muestra. 4. Ingerir 250 ml de agua. 5. Realizar ejercicio muscular intenso, como subir y bajar varias veces las escaleras de tres o cuatro pisos u otro ejercicio sugerido por el profesor. 6. Obtener muestras de orina cada 15 minutos, como en el inciso 3, hasta completar por lo menos cinco muestras. 7. A cada muestra se le determinará el pH inmediatamente después de haber sido obtenida ya que con el tiempo el pH tiende a aumentar debido a la pérdida de dióxido de carbono y a que el crecimiento bacteriano produce amoniaco a partir de la urea. Análisis de resultados Una vez obtenido el valor del pH para cada una de las 5 muestras de orina, trazar una gráfica de pH contra tiempo; interpretar los resultados y discutirlos en grupo. Segunda parte Objetivos 1. El alumno constatará el papel del riñón en el mantenimiento del equilibrio ácido-base en una situación de alcalosis metabólica provocada por la ingestión de bicarbonato de sodio. 2. Mediante la medición del pH, observar la variación de la concentración de hidrogeniones en la orina de un individuo que ha ingerido una carga de bicarbonato de sodio. Hipótesis Elabore la hipótesis apropiada. Material • Orina. • Solución de bicarbonato de sodio a 3%. • Potenciómetro. Método 1. Tomar 250 ml de agua una hora antes de la clase práctica. Vaciar la vejiga y descartar esa orina. 2. Tomar 250 ml de agua inmediatamente antes de la clase práctica. 3. Orinar en una probeta de 100 ml. Anotar el volumen de la muestra. 4. Ingerir 250 ml de agua con 7.5 g de bicarbonato de sodio. 5. Obtener muestras de orina cada 15 minutos, hasta completar por lo menos 5 muestras. 6. A cada muestra se le determinará el pH inmediatamente después de haber sido obtenida. Análisis de resultados Una vez obtenido el valor del pH para cada una de las cinco muestras de orina, trazar una gráfica de pH contra tiempo; interpretar los resultados y discutirlos en grupo. REFERENCIAS 1. Devlin TM. Bioquímica. Libro de texto con aplicaciones clínicas. 4a. ed. Barcelona: Editorial Reverte; 2004. 2. Montgomery R. Bioquímica: casos y texto. 6a. ed. Editorial Harcourt-Brace; 1998: cap.4. 3. Villazón SA, Cárdenas CO,Villazón Práctica 3 Titulación de un aminoácido con una base y la aplicación de la ecuación de Henderson y Hasselbalch. Determinación del pK1 y del pK2 Objetivos Que el alumno: 1. Experimente y entienda cómo se comporta un sistema amortiguador de pH. 2. Aprenda el uso de la ecuación de Henderson-Hasselbalch. 3. Aprenda a calcular el pK de un par ácidobase. 4. Mida el pH de diferentes sustancias y calcule su concentración de H+. 5. Aplique estos conocimientos al estudio de las propiedades de los aminoácidos. Para lograr lo anterior conteste las siguientes preguntas y planteamientos: 1. ¿Qué es el pH de una solución? 2. ¿Qué es un sistema amortiguador ácidobase y para qué sirve? 3. ¿Cuáles son los sistemas amortiguadores más importantes en biología? 4. Escribir la ecuación de HendersonHasselbalch. 5. ¿Qué es el pK de un par ácido base? 6. ¿Por qué es importante la concentración de H+ en los seres vivos? 7. Dibujar la fórmula de la glicina, de la lisina, de la histidina y del ácido aspártico e identificar a los grupos -amino y carboxilo de estos aminoácidos, así como su radical, e indicar la naturaleza del mismo. 8. ¿Qué les pasa a estos grupos funcionales cuando se someten a pH ácido o básico? 9. ¿Se pueden usar los aminoácidos como amortiguadores de pH? 10. ¿Son los aminoácidos buenos amortiguadores a pH de 7.0? 11. ¿Cuál es el punto isoeléctrico de los aminoácidos que tienen un grupo amino y un grupo carboxilo? 12. ¿Cuál es la carga eléctrica de los aminoácidos que tienen dos grupos carboxilo a pH de 7.0? 13. ¿Cuál es la carga eléctrica de los aminoácidos que tienen dos grupos amino a pH de 7.0? Material • Cuatro vasos de precipitado de 100 ml. • Pipeta de 1 ml (para el NaOH). • Potenciómetro. • Piceta para enjuagar el electrodo. • Glicina 0.025 mol/l pH 2. • Lisina 0.025 mol/l pH 2. • Ácido aspártico 0.025 mol/l pH 2. • Histidina 0.025 mol/l pH 2. • NaOH 1.0 mol/l. Método 1. Poner 20 ml de la solución de glicina en un vaso de precipitado de 100 ml. 2. Proceder a la medición del pH. 3. Añadir 0.1 ml de NaOH 1.0 mol/l. Agitar el vaso y volver a medir el pH; anotar los resultados. 4. Repetir el paso 3 hasta llegar a un pH aproximado de 12. 5. Hacer lo mismo (pasos 1 a 4) para los otros tres aminoácidos. Análisis de resultados 1. Hacer una gráfica de pH vs volumen en ml de NaOH gastados luego de tomar en cuenta que cada 0.1 ml de NaOH diluido en 20 ml aumenta la concentración de OH en 5 mM. 2. Localizar en la gráfica el pI y los diferentes pK de los aminoácidos. 3. Mediante la ecuación de HendersonHasselbalch cuantificar la relación entre cada par de especies ionizables de los aminoácidos a diferentes pH. 4. Identificar a qué pH tienen poder amortiguador. Medición del pH y cálculo de la concentración de H+ en diferentes líquidos Método 1. Pedir a los alumnos desde la clase anterior que traigan diferentes muestras, tales como leche, café, refresco, orina, saliva, jugo de frutas, etcétera. 2. Colocar los líquidos en un vaso de precipitado y medir el pH en el potenciómetro. Análisis de resultados Calcular la concentración molar de H + en cada uno de las muestras estudiadas. REFERENCIAS 1. Devlin TM. Bioquímica. Libro de texto con aplicaciones clínicas. 4a. ed. Barcelona: Editorial Reverte; 2004. 2. Lehninger AL, Nelson, DL. Principios de bioquímica. 4a. ed. Barcelona: Ediciones Omega; 2005 Práctica 4 Estudio de las proteínas corporales Objetivos 1. Aplicar los conocimientos generales sobre las proteínas al estudio de las proteínas corporales. 2. Conocer las alteraciones más frecuentes de las proteínas plasmáticas y sus consecuencias. 3. Conocer los métodos generales para el estudio de las proteínas plasmáticas. 4. Determinar la concentración sérica de proteína total y de albúmina e interpretar los resultados obtenidos. INTRODUCCIÓN Las proteínas son polímeros lineales constituidos por los aminoácidos, que se unen entre sí por medio de enlaces tipo amida denominados enlaces peptídicos. Los polímeros compuestos por dos aminoácidos forman un dipéptido, por tres, un tripéptido; cuando el número de aminoácidos es mayor, oligopéptidos y polipéptidos o simplemente se denominan péptidos. Las proteínas son moléculas constituidas por una o más cadenas polipéptidicas. Las proteínas pueden ser clasificadas en función de aspectos tan diversos como su composición, su disposición espacial, su función biológica y su localización. Atendiendo a su localización dentro del organismo humano, las proteínas pueden clasificarse en: • Hísticas o tisulares, son las proteínas de los tejidos. • Plasmáticas o hemáticas, son las proteínas de la sangre. Aunque las proteínas tisulares son de gran importancia en el organismo, las localizadas en la sangre (la hemoglobina en los eritrocitos y las proteínas plasmáticas), por su gran accesibilidad, proporcionan con facilidad información importante y, por lo tanto, son las más utilizadas en el laboratorio clínico. Proteínas plasmáticas La sangre está constituida por formas celulares en suspensión (eritrocitos, leucocitos y plaquetas) en un medio líquido llamado plasma. El plasma se obtiene cuando, inmediatamente después de extraer la sangre, se le agregan anticoagulantes como oxalato, citrato, EDTA o heparina y se centrifuga. Si se recoge sangre sin anticoagulante y se deja que ésta coagule, el líquido que se separa se llama suero. El suero carece de células y de factores de la coagulación incluyendo la proteína fibrinógeno, pues ésta ha sido transformada en fibrina insoluble en el proceso de la coagulación. El fibrinógeno constituye sólo de 3 a 6% del total de las proteínas en plasma. El agua constituye 92 a 93% del plasma o suero y en ella encontramos electrolitos, metabolitos, nutrientes, hormonas y proteínas en una proporción de 7 a 8%; de estos solutos presentes, las proteínas son las que están en máxima proporción, aproximadamente 6 a 8 g/dl de suero y este valor es 0.2 a 0.4 g/dl mayor en plasma por la presencia de fibrinógeno. Las proteínas plasmáticas son un grupo de más de 100 moléculas distintas con características y funciones muy diversas, aunque para fines prácticos el término "proteína plasmática" se usa para todas aquellas proteínas cuya concentración en el plasma sea mayor a 10 mg/dl y que cumplan con alguna función específica dentro de él. Aproximadamente son 20 las proteínas que cumplen con ambas definiciones. Todas estas proteínas, a excepción del fibrinógeno, se encuentran tanto en plasma como en suero. La mayoría de las proteínas plasmáticas son sintetizadas por el hígado. Las proteínas del plasma, al igual que otras proteínas del organismo, son destruídas y reemplazadas constantemente, con una vida media de aproximadamente 10 días. Las funciones de las proteínas plasmáticas pueden agruparse en tres grandes grupos: de transporte como la transferrina, lipoproteínas y la albúmina; de defensa del organismo en el ataque a agentes extraños o para limitar la respuesta inflamatoria, como las inmunoglobulinas, la a1-antitripsina, la haptoglobina y el complemento. Por último, para mantener la presión oncótica de la sangre, necesaria para prevenir pérdidas de líquido del espacio vascular al intersticial: la albúmina es el ejemplo más importante de este grupo. Métodos para el estudio de las proteínas plasmáticas El laboratorio clínico cuantifica en una muestra de suero las concentraciones de proteína total y de albúmina. A partir de estos datos, se calcula la fracción globulina como la diferencia entre los dos resultados anteriores y la relación albúmina/globulina se calcula a partir de estos últimos. La concentración de otras proteínas se determina por grupos (por ejemplo, las gamma-globulinas) o individualmente por métodos inmunoquímicos (por ejemplo algunas hormonas o marcadores tumorales). Las enzimas se estudian evaluando su actividad catalítica o su concentración de masa mediante métodos inmunoquímicos. También es posible el estudio fraccionado de las proteínas, para lo que se recurre a otros procedimientos más precisos de gran ayuda clínica, como la electroforesis, la inmunoelectroforesis y la inmunodifusión radial de proteínas plasmáticas. Proteína total La suma de las concentraciones de todas y cada una de las proteínas presentes en el plasma se conoce como proteínas totales y la cifra normal, en promedio, es de 7.1 g/dl, siendo las cifras límite entre 6 y 8 g/dl. Las proteínas totales están integradas por albúmina (más de la mitad) y las globulinas; estas últimas agrupan a todas las proteínas que no son albúmina. La concentración de las proteínas plasmáticas en un momento determinado es el resultado de tres procesos: la velocidad de síntesis, el volumen del líquido en que se distribuyen y la velocidad de degradación. En diversos estados patológicos, estos procesos pueden superponerse. En la práctica, la determinación de la concentración de la proteína total es un parámetro que sólo refleja los cambios de las proteínas más abundantes, como la albúmina y las inmunoglobulinas. La determinación de proteína total es útil en el diagnóstico de enfermedades del hígado, de los riñones y de la médula ósea. En clínica se puede observar hiper o hipoproteinemias, pero tanto en unas como en otras, frecuentemente existe disminución de la generalmente aumento de globulinas, en alguna de sus fracciones. La determinación de las proteínas totales suele realizarse en el suero que carece de fibrinógeno y de cualquier anticoagulante que pueda diluir levemente las proteínas en el plasma. Albúmina La albúmina es la principal proteína plasmática y es sintetizada y secretada por el hígado a razón de 12 g al día. Supone alrededor de 25% de la producción proteica hepática total y la mitad de toda su proteína secretada. La albúmina es una proteína globular compuesta por 585 aminoácidos en una sola cadena polipeptídica con 50% de α-hélice y 15% de estructura β, posee 17 puentes disulfuro y tiene una vida media entre 14 y 20 días. En el adulto normal se degradan diariamente 12 g de albúmina que pueden proveer de aminoácidos para la síntesis de otras proteínas. Además de esta función nutritiva, la albúmina ayuda a conservar la distribución normal de agua ya que produce cerca de 80% del efecto osmótico de las proteínas plasmáticas totales, debido a su alta concentración y bajo peso molecular. La albúmina interviene en el equilibrio ácidobásico y se encarga también del transporte de varias sustancias como son los ácidos grasos, la bilirrubina, varias hormonas e incluso algunos fármacos (sulfonamidas, penicilina G, aspirina, entre otras). Alteraciones en la concentración de albúmina. La más común es la disminución en su concentración o hipoalbuminemia. En general, la disminución de 1 g de albúmina sérica equivale a una pérdida de 30 g de proteína tisular. Las principales causas de hipoalbuminemia son las enfermedades renales, la desnutrición por baja ingestión de proteínas y la síntesis deficiente como consecuencia de la insuficiencia hepática, sobre todo en casos de cirrosis. La manifestación clínica más llamativa de la hipoalbuminemia es el edema. Las cifras normales de albúmina son de 4.5 g/dl y las cifras límite entre 3.5 y 5 g/dl. La relación normal A/G es mayor de uno y es un indicador importante en algunos estados patológicos. Una relación A/G baja puede obtenerse porque existe hiperglobulinemia, hipoalbuminemia o ambas. Separación electroforética de las proteínas del suero Las técnicas de electroforesis, enfoque isoeléctrico y cromatografía de intercambio iónico son algunas de las más importantes para el estudio de las proteínas basadas en su carga eléctrica. En la electroforesis, si se colocan las proteínas en un soporte (geles poliméricos, almidón o papel) inmersas en una solución amortiguadora a un pH determinado dentro de un campo eléctrico, las proteínas se desplazan hacia un polo cargado. En función de la relación entre el pH del amortiguador y el pI de la molécula, ésta se moverá hacia el cátodo, hacia el ánodo, o permanecerá estacionaria (pH=pI), por influencia del campo eléctrico externo. Cuando se realiza la electroforesis en papel o acetato de celulosa a pH 8.6, que es un pH significativamente superior al pI de las principales proteínas plasmáticas cuyo peso molecular oscila entre 66 000 y 700 000, las proteínas están cargadas negativamente y se mueven hacia el polo eléctrico positivo. En función de su velocidad de desplazamiento, las proteínas del suero se separan en cinco fracciones principales: albúmina, globulina α-1, globulina α-2, globulina β, fibrinógeno θ (para plasma solamente) y globulina γ (Fig. 5.1). La electroforesis no separa los componentes proteicos en sustancias químicamente puras: algunas de estas fracciones representan decenas a cientos de proteínas individuales y diferentes que sólo tienen en común la misma velocidad de desplazamiento electroforético. Hay que tener en cuenta que la migración a distinta velocidad en el campo eléctrico, obedece a la forma y carga de la molécula y menos a su tamaño o peso molecular. Las membranas de acetato de celulosa tienen la ventaja de ser químicamente homogéneas y poder transparentarse, con lo que las sustancias que se separan pueden cuantificarse por densitometría, una vez teñidas. Este aparato condujo históricamente a la separación y clasificación operacional de las proteínas del plasma humano (Fig. 5.1). El área de cada pico determina la concentración de la proteína que posee esa movilidad particular. La electroforesis separa las proteínas del suero en patrones que pueden ser altamente específicos para ciertas enfermedades como sucede en el mieloma, el síndrome nefrótico, la cirrosis o las quemaduras corporales extensas (Fig. 5.1). Proteínas específicas Las proteínas plasmáticas de interés clínico pueden determinarse por procedimientos cuantitativos específicos que proporcionan una información clinica más precisa que los métodos anteriores. La cuantificación se realiza mediante métodos como la nefelometría, la turbidimetría y la inmunodifusión radial y métodos de inmunoanálisis con reactivos marcados, como el radioinmunoanálisis, el enzimoinmunoanálisis, el fluoroinmunoanálisis y el luminoinmunoanálisis. Tabla 5.1 Algunas proteínas cuya concentración se determina en el suero NOMBRE DE LA PROTEÍNA g/L PROPIEDADES Y FUNCIÓN MOTIVO PARA LA PRUEBA Albúmina 35-50 Transporte de múltiples sustancias Desnutrición Hepatopatía Neoplasias Ig G 8-17 Inmunidad humoral Inmunodeficiencias Mieloma C3 0.50.9 Proteína del complemento Obstrucción biliar Lupus eritematoso Proteína C reactiva <0.005 Implicada en la respuesta inmune Infecciones agudas Proteína fijadora de vitamina D 0.20.55 Une y transporta vitamina D3 Daño hepático grave Haptoglobina 0.53.2 Fija la hemoglobina Hemólisis Síndrome nefrótico Fibronectina 0.250.4 Promueve la adhesión celular, une fibrina Sepsis Leucemia Pancreatitis aguda Transferrina 2.34.3 Transporte de hierro Hemocromatosis malnutrición Ceruloplasmina 0.20.55 Transporte de cobre Daño hepático grave Síndrome nefrótico La tabla 5.1 describe algunas de las proteínas cuya cuantificación es de utilidad clínica. Alteraciones de las proteínas plasmáticas Dada la gran diversidad de funciones desempeñadas por las proteínas plasmáticas en el organismo, son también muchas las alteraciones o disfunciones que pueden aparecer. Las alteraciones pueden clasificarse en: • Alteraciones en la cantidad de proteínas totales. • Alteraciones en las fracciones obtenidas tras una electroforesis, disproteinemias. • Presencia en el plasma de alguna Ig anormal y/o de alguno de sus fragmentos, paraproteinemias. • Circulación en plasma de Ig que precipitan al descender la temperatura. Crioglobulinemia. • Defectos aislados de alguna fracción. Material • Gradilla con 6 tubos de ensayo • 2 Pipetas de 5 ml, • Pipetas automáticas • Puntas para pipetas automáticas • Reactivo de Biuret para determinación de proteína: tartrato de K-Na 15 mmol/l, yoduro de sodio 100 mmol/l, ioduro de potasio 15 mmol/l y sulfato de cobre 5 mmol/l. • Espectrofotómetro a 540 nm. • Solución reactiva para albúmina: verde de bromocresol a pH 4.2 • Espectrofotómetro a 630 nm. • Suero problema. • Solución estándar de proteínas 7 g/dl. • Solución estándar de albúmina 5 g/dl. • Jeringa*, ligadura y torundas con alcohol. Precauciones. Evítese la hemólisis. La concentración de las proteínas del plasma se modifica por la postura, de forma que existe un incremento de entre un 10% y un 20% tras 30 minutos de pasar de la posición acostada a la ortostática. Además la aplicación de la ligadura para extraer la sangre puede producir un aumento significativo al cabo de unos minutos. En ambos casos, la modificación se debe a un aumento del paso de líquido desde el compartimiento vascular hacia el intersticial. Método Para la determinación de proteína total se utiliza el método de Biuret modificado, el cual es de gran especificidad y precisión. Los polipéptidos que contengan, por lo menos, dos enlaces peptídicos reaccionan con las sales de cobre en medio alcalino para formar un quelato 2+ coloreado (violeta) entre el ion Cu y los átomos de oxígeno del carbonilo y de nitrógeno de la amida del enlace peptídico. La concentración de este complejo es proporcional a la concentración de proteína total en la muestra. La absorbencia se determina a 540 nm con un blanco de reactivos. Preparar la siguiente serie de tubos: No. de tubo Estándar Suero problema Reactivo de Biuret 1. Blanco 2. Estándar - 25 µl - 3. Suero problema 25 µl 1 ml 1 ml 1 ml Mezclar e incubar 15 min a temperatura ambiente. Leer frente al blanco de reactivos a 540 nm. El color es estable durante 30 min. Cálculo: ASuero X [Estándar g/dl] = [Proteína Total g/dl] A Estándar Donde A es la absorbencia. El resultado se obtiene en g/dl. El método es lineal hasta valores de 15 g/dl (150 g/l). Valores esperados: Recién nacidos 5.2 - 9.1 g/dl Niños (hasta 3 años) 5.4 - 8.7 g/dl Adultos 6.0 - 8.0 g/dl Para la determinación de albúmina se requiere de la fijación específica del verde de bromocresol a esta proteína a determinado pH produciéndose un cambio de coloración, de amarillo verdoso a verde azulado. El cambio en la coloración es directamente proporcional a la concentración de albúmina en la muestra. La absorbencia se determina a 630 nm con un blanco de reactivos. Preparar la siguiente serie de tubos: No. de tubo Estándar Suero problema Reactivo de albúmina 1. Blanco 2. Estándar - 10 µl - 3. Suero problema 10 µl 2 ml 2 ml 2 ml Mezclar e incubar 10 min a temperatura ambiente. Leer frente al blanco de reactivos a 630 nm. El color es estable durante 60 min. Cálculo: ASuero X [Estándar g/dl] = [Alb’umina g/dl] A Estándar Donde A es la absorbencia. El resultado se obtiene en g/dl. El método es lineal hasta valores de 6 g/dl (60 g/l). Los valores mayores de 6 deben diluirse 1:2 con solución salina. Valores esperado de 3.5 a 5 g/dl (50 g/l). REFERENCIAS 1. Peters TJ. Clin Chem. 1968; 14: 1147. 2. Murray KR, Granner DK, Mayes PA, Rodwell VW. Bioquímica de Harper. 16a. ed. México: Editorial El Manual Moderno; 2004. 3. González de Buitrago JM. Bioquímica clínica. Madrid: McGraw-Hill Interamericana; 1999. 4. Laguna-Piña. Bioquímica. 4a. ed. México: Salvat; 1990. Cap. 4. 5. Pacheco Leal D. Bioquímica médica. México: Editorial Limusa; 2004. Práctica 5 Cinética enzimática. Efecto de la concentración del sustrato sobre la velocidad de reacción enzimática Objetivos El alumno: 1. Explicará el efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad de una reacción enzimática. 2. Calculará por métodos gráficos la velocidad máxima y la constante de Michaelis de una reacción enzimática. 3. Conocerá los diferentes tipos de inhibidores que existen y estudiará su efecto sobre la Km y V máx. 4. Conocerá aspectos básicos de fotocolorimetría (ver pág, 115). Para lograr los objetivos de esta práctica contestar las siguientes preguntas: 1. ¿Qué es la velocidad de una reacción enzimática? 2. ¿Cómo se define la constante de Michaelis (Km) de una reacción enzimática? 3. ¿Cómo se define la velocidad máxima (V máx) de una reacción? 4. ¿Para qué le sirve a un médico la determinación de la actividad de algunas enzimas? 5. ¿Cuáles son las enzimas cuya determinación tiene valor diagnóstico? Hipótesis Si la velocidad de una reacción enzimática es proporcional a la concentración del sustrato; cuando la concentración del sustrato es muy alta, por lo tanto la enzima se satura y alcanza su velocidad máxima. La enzima que sirve de modelo en esta práctica es la glucosa oxidasa acoplada a la peroxidasa. Fundamento El método se basa en el hecho de que la glucosa, en presencia del oxígeno del aire y con la participación de la glucosa oxidasa, se oxida hasta ácido glucónico. El peróxido de hidrógeno que se forma en el curso del proceso se descompone mediante la peroxidasa. El oxígeno atómico que se desprende en esta última reacción se combina con un cromógeno que se colorea al oxidarse. La intensidad de la coloración del cromógeno oxidado es proporcional a la concentración de glucosa. La glucosa oxidasa (ß-D-glucosa: oxígeno óxidorreductasa, EC1.1.2.4) tiene un peso molecular de 160 000. Existe en forma dimérica y contiene dos moles de FAD como grupo prostético por mol de enzima. La glucosa oxidasa es altamente específica, hecho que ha permitido su empleo para el análisis cuantitativo de glucosa. La reacción consiste de dos pasos: 1. Glucosa+glucosa oxidasa-FAD δ– gluconolactona + glucosa oxidasa-FADH2 2. Glucosa oxidasa-FADH2 + O2 glucosa oxidasa-FAD + H2O2 La δ4-gluconolactona se hidrata espontáneamente dando ácido glucónico. La reacción global se expresa: Glucosa oxidasa Glucosa + O2 Acido glucónico + H2O2 La peroxidasa cataliza la transferencia de oxígeno del peróxido a un aceptor que es cromógeno como la ortotoluidina, la ortodianisidina, la 2,2-azino-bis (3- etilbencentiazolin-6-sulfónico) o la 4-aminoantipirina (y fenol) que se colorean al oxidarse. La reacción se expresa: E+S ES 1. Cálculo de la concentración inicial de sustrato en cada tubo; tomar en cuenta que la solución de glucosa contiene 40 µmolas ml–1. 2. La velocidad será igual a las unidades Klett por .5 min-1 de incubación. 3. Con los datos obtenidos completar el cuadro 5.2 y hacer las dos gráficas en papel milimétrico. 4. Hacer una segunda gráfica con los valores de 1/v vs 1/[S]. 5. Calcular el valor de la velocidad máxima (Vmáx) y de la constante de Michaelis (Km) con y sin inhibidor. 6. Determinar el tipo de inhibidor de acuerdo con las gráficas del punto anterior. 7. Analizar si los resultados obtenidos están de acuerdo con la hipótesis planteada. E+P Material y reactivos • 2 Gradillas con 8 tubos de ensaye cada una. • 1 Pipeta de 5 ml. • 2 Pipetas de 5 ml. • 1 Matraz Erlemeyer de 100 ml. • Fotocolorímetro con filtro azul. • Solución estándar de glucosa 40 mmol/l y una dilución 1:10 de ésta para los tubos 2, 3 y 4. • 2 frascos con solución de enzimas: 41.6 Uml–1 de glucosa oxidasa, 4.6 Uml–1 de peroxidasa, ortodianisidina 0.21 mmol/l. • Solución de azida de sodio 400 mmol/l como inhibidor. • Gotero con HCl. Método I (con azida de sodio) 1. En un matraz Erlenmeyer de 100 ml preincubar 20 minutos la solución de enzimas con 0.3 ml del inhibidor. 2. Preparar la siguiente serie de tubos (tabla 1). 3.- Considerar un intervalo de 30 segundos para cada tubo al agregar la enzima. 4.- Agitar cada tubo e incubar 5 minutos temperatura ambiente y de inmediato detener la reacción agregando 3 gotas de HCl concentrado Considerar un intervalo de 30 segundos para cada tubo al agregar el HCl. Método II (sin inhibidor) 1.- Preparar nuevamente una serie de tubos como lo indica la tabla 1. 2.- Repetir los paos 3 y 4 del Método I Leer ambas series de tubos en el fotocolorímetro; utilizar como blanco el tubo 1. Resultados (cuadro 5.2) REFERENCIAS 1. Devlin TM. Bioquímica. Libro de texto con aplicaciones clínicas. 4a. ed. Barcelona: Editorial Reverté; 2004. 2. Lehninger AL, Nelson, DL. Principios de bioquímica. 4a. ed. Barcelona: Ediciones Omega; 2005. 3. Mathews CK, van Holde KE. Bioquímica. 3a. ed. España: McGraw-Hill Interamericana; 2003. Tubo No. 1 2 3 4 5 6 7 8 Solución glucosa (ml) de H2O (ml) Soución de enzimas (ml) 0.0 1.0 3 dil 1:10 0.1 0.9 3 dil 1:10 0.25 0.75 3 dil 1:10 0.5 0.5 3 0.1 0.9 3 0.25 0.75 3 05. 0.5 3 1.0 0.0 3 4. Voet D, Voet JG, Pratt C. Fundamentals of biochemistry. USA: John Wiley and Sons; 1999. Cuadro 5.2 Resultados Tubo No Concentración de sustrato molas de glucosa inicial ml-1 ABCISAS (X) Velocidad de la reacción unidades Klett 5 min-1 ORDENADAS (y) Velocidad de la reacción con INHIBIDOR Unidades Klett 5 min -1 1 2 3 4 5 6 7 8 Cuadro 5.3 Resultados (inverso) Tubo No. 1 2 3 4 5 6 7 8 Concentración de sustrato molas de glucosa inicial ml-1 ABCISAS (X) Velocidad de la reacción unidades Klett 5 min-1 1/V ORDENADAS (Y) Velocidad de la reacción con INHIBIDOR 1/V Unidades Klett 5 min–1 (Y)