ENZIMOINMUNOENSAYO PARA LA CUANTIFICACIÓN DE IgG
1.- INTRODUCCIÓN
El enzimoinmunoensayo (ELISA) es un método empleado habitualmente para la
detección y/o cuantificación de sustancias, generalmente proteínas, que se encuentran
en concentraciones muy bajas. El método combina la especificidad de unión de los
anticuerpos con la amplificación de "señal" que brindan las reacciones catalizadas por
enzimas. En la práctica clínica es la técnica inmunológica más empleada. Se utiliza
para cuantificar, entre otras cosas, hormonas, marcadores tumorales, para determinar
la presencia de antígenos microbianos y para la determinación cualitativa o cuantitativa
de anticuerpos totales o frente a algún antígeno en particular.
En esta práctica se determinará la cantidad de IgG total en varias muestras
problema. La cantidad de IgG que contienen estas muestras es similar a la que
podríamos esperar en LCR, líquido sinovial o en el sobrenadante de un cultivo de
linfocitos, es decir, muy inferior a la del suero. La determinación se llevará a cabo
mediante un enzimoinmunoensayo en fase sólida de tipo "sandwich". Para ello se
inmovilizan anticuerpos de cabra anti IgG humana (anticuerpo de captura) a un soporte
sólido y se añade la muestra problema, dejando que la IgG presente sea "capturada"
específicamente por los anticuerpos inmovilizados. Después de lavar se añadirán
anticuerpos de oveja anti IgG humana conjugados a la enzima peroxidasa (anticuerpo
de detección). Después de incubar y lavar, se añadirá el sustrato de la enzima. Al
formarse el producto, un cromógeno que se añade junto al sustrato y que está
acoplado a la reacción, dará lugar a una sustancia coloreada, que puede ser medida
con ayuda de un espectrofotómetro. La cantidad de sustancia coloreada formada
estará en relación directa con la cantidad de IgG presente en la muestra problema.
Para conocer su concentración exacta se comparará la absorbancia del problema con
la absorbancia de blancos y patrones de referencia que contienen concentraciones de
IgG conocidas y que se han procesado en paralelo.
2.- OBJETIVOS
Al finalizar la práctica el alumno debe ser capaz de:
-
Diseñar un ELISA cualitativo y cuantitativo para cualquier proteína
Inmovilizar proteínas (Ag/Ac) a un soporte plástico
Llevar a cabo todas las fases de un enzimoinmunoensayo
Determinar el tramo de la curva obtenida en el que se pueden estimar
concentraciones
3.- EQUIPAMIENTO
-
Módulos MaxiSorp (Nunc) de 16 pocillos de fondo plano y marcos.
Tubos de ensayo para preparar diluciones y gradillas
Micropipetas y puntas de 5-200 (amarillas) y 200-1000 µl (azules)
Matraces Erlenmeyer
Parafilm
Papel secante
Agitador horizontal
Bomba de vacío
Espectrofotómetro Titertek Multiskan
4.-REACTIVOS
-
PBS pH 7.2
Para 1L:
NaCl
H2KPO4
HNa2PO4
KCl
-
2.93g
1.59g Ajustar a pH 9.6.
Tampón citrato pH 5.5
Para 1L:
Citrato trisódico dihidrato
-
-
-
Ajustar a pH 7.2
Tampón bicarbonato 0.05M, pH 9.6
Para 1L:
HNaCO3
Na2CO3
-
8.00g
0.20g
1.15g
0.20g
29.4 g Ajustar a pH 5.5 con ácido cítrico 1M.
BSA (fracción V de albúmina bovina, Sigma, St. Luis, MO)
Antisuero de cabra (purificado por cromatografía de afinidad) frente a IgG humana
(Beckman, Sa Jose, CA). Concentración: 0.1 mg/ml
Suero humano de concentración de IgG conocida. Preparar previamente las
siguientes diluciones: 104 ng/ml, 2*103 ng/ml, 4*102 ng/ml, 80 ng/ml y 16 ng/ml, usando
como diluyente PBS- 1% BSA.
Antisuero anti IgG humana obtenido en oveja, purificado por cromatografía de
afinidad y conjugados con peroxidasa (peróxido de hidrógeno oxidorreductasa, EC
1.11.1.7) (Serotec, Oxford, Gran Bretaña)
OPD (1,2 fenilendiamina, Merck, Darmstadt, Alemania)
H2O2 3% (Foret, Barcelona)
H2SO4 1N (Panreac, Barcelona)
Muestras problema proporcionadas por el profesor
5.- PROCEDEMIENTO (por parejas)
5.1- [Primer día] Inmovilización de anticuerpos de captura al soporte sólido.
1º) Ajustar una tira de 16 pocillos MaxiSorp a un marco.
2º) Preparar 1.7 ml de una dilución de Ac de cabra anti IgG humana a 1µg/ml en
tampón bicarbonato.
3º) Pipetear 100 µl/pocillo.
4º) Incubar a 4C de 12 a 48h
5.2- [Segundo día] Lavado (eliminación del exceso).
1º) Aspirar el contenido de los pocillos con bomba de vacío.
2º) Pipetear 300µl de PBS/pocillo.
3º) Repetir la aspiración, el pipeteo de PBS y de nuevo la aspiración.
4º) Invertir los pocillos y golpear varias veces sobre secante para no dejar gotas.
5.3- Patrones de referencia, muestras problema y blancos.
1º) Pipetear, por duplicado, 100 µl/pocillo de cada uno de los patrones de
referencia (ver figura siguiente).
2º) Pipetear de igual manera las muestras problema y el blanco (PBS- 1% BSA).
A
B
C
D
E
F
G
H
1
ng/ml
2*103 ng/ml
4*102 ng/ml
80 ng/ml
16 ng/ml
Problema 1
Problema 2
Blanco
104
2
=
=
=
=
=
=
=
=
3º) Incubar 20 minutos a temperatura ambiente en agitación.
4º) Eliminar el exceso lavando como en el paso 5.2.
5.4- Anticuerpo de detección.
1º) Una pareja preparará, para todo el grupo, 20 ml de Ac de oveja anti IgG
humana conjugado con peroxidasa a dilución 1/20 000 (v/v) en PBS-1% BSA.
2º) Pipetear 100µl en todos los pocillos.
3º) Incubar 20 minutos a temperatura ambiente con agitación.
4º) Lavar como en el paso 5.2.
5.6- Sustrato y cromógeno.
1º) Preparar (una pareja para todo el grupo) 20 ml de la mezcla: OPD 0.5 mg/ml,
H2O2 0.05% (v/v) disuelto todo en tampón citrato.
2º) Pipetear 100µl en todos los pocillos.
3º) Incubar 5-15 minutos en oscuridad hasta que se observe color.
4º) Detener la reacción con 50 µl/pocillo de H2SO4 1N añadiéndolo en el mismo
orden en que se pipeteó la mezcla sustrato-cromógeno.
5.7-Lectura y representación gráfica.
1º) Determinar la absorbancia a 492 nm en un lector de placas, restando a cada
pocillo la lectura de los blancos.
2º) Trazar la gráfica patrón, log Concentración de IgG vs ABS492.
3º) En el tramo recto interpolar los valores de ABS492 de las muestras problema.
Muestra
Problema 1
Problema 2
Concentración Media del
obtenida
grupo
Concentración
teórica
1E5
IgG (ng/ml)
1E4
1E3
1E2
1E1
1E0
0
0.2
0.4 0.6 0.8
ABS (492 nm)
1
1.2
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elisa