LANASEVE-PT-002 Diagnóstico de Brucelosis por el

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DIAGNÓSTICO DE BRUCELOSIS POR EL MÉTODO DE
ELISA COMPETITIVO (cELISA)
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1. Objetivo
Establecer procedimiento para el Diagnóstico de Brucelosis mediante el método ELISA Competitivo (cELISA).
2. Alcance
Aplica al Área de Brucelosis de la Sección Microbiología Médico Veterinaria y Laboratorios Regionales del
LANASEVE.
3. Responsabilidad y Autoridad
3.1 Jefe de Sección o Laboratorio Regional.
Velar para que se cumpla lo que indica este procedimiento e n su dependencia a cargo.
Efectuar el ensayo tal y como lo indica el procedimiento en ausencia del analista.
3.2 Gestor de Calidad
Velar por el cumplimiento de este procedimiento en las dependencias que lo efectúan.
3.3 Analistas de laboratorio
Llevar a cabo el ensayo conforme a lo que indica este procedimiento.
4. Definiciones
4.1 Anticuerpos: sustancias producidas por el sistema inmune para identificar, marcar y neutralizar elementos
extraños tales como bacterias, virus o parásitos (6.2).
4.2 Antígeno: sustancia que puede ser reconocida por componentes del sistema inmune (6.2).
4.3 Brucelosis: enfermedad infecciosa bacteriana producida por bacterias del género Brucella, que afecta a
mamíferos terrestres, marinos y al hombre. Según el DECRETO EJECUTIVO NO. 34858-MAG DEL 27 DE
NOVIEMBRE DE 2008, Intervención de la Brucelosis Bovina: se establece a la Brucelosis Bovina como enfermedad de
combate particular obligatorio (6.1, 6.4, 6.7).
4.4 cELISA: en este tipo de ensayo, el anticuerpo de la muestra va a competir con el conjugado por un número
limitado de sitios de unión del antígeno. Así, habrá ausencia de color en una muestras positiva debido a que el
sustrato no encontrará a la enzima por que el conjugado ha sido desplazado por el anticuerpo presente en la
muestra (ver figura 1) (6.3).
4.5 Conjugado: unión de un anticuerpo a una enzima. Este anticuerpo fue desarrollado contra un antígeno
específico (6.2).
4.6 ELISA: La técnica ELISA o ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas, o por sus siglas en ingles
Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, se basa en la detección de un antígeno inmovilizado sobre una fase
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sólida mediante anticuerpos conjugado con una enzima específica que desarrollará o no color (6.2, 6.3).
4.7 Hoja de trabajo: es la hoja donde se indica la información de las muestras que se montan, del ensayo
realizado, marca del kit, fecha de realización del ensayo, número de plato y de lote, además de la firma del
analista del laboratorio y del visto bueno del jefe.
4.8 Lector de ELISA: espectrofotómetro capaz de realizar lecturas seriadas de cada uno de los pocillos de la
placa para determinar la densidad óptica de los cromógenos más comúnmente utilizados (6.2, 6.3).
4.9 Placa de Ensayo: micro placa de 96 pocillos de plástico tratado para aumentar su capacidad de moléculas y
con fondos de pocillo ópticamente claros para poder realizar las medidas de densidad óptica en instrumentos
específicos (6.2, 6.3).
4.10 Suero de referencia: sueros control para determinar el buen funcionamiento de la prueba y para definir los
criterios de aceptación (6.3, 6.7).
4.11 Solución de frenado o parada: sustancia para detener la reacción entre el sustrato y la enzima y por lo
tanto detiene el desarrollo de color (6.2, 6.3).
4.12 Sustrato cromógeno: sustancia que desarrolla el color por su reacción con una enzima por ejemplo
peroxidasa (6.2, 6.3).
5. Abreviaturas y/o Siglas
5.1 D.O.: Densidad Óptica.
5.2 ELISA (siglas en inglés): Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas ó Enzyme-Linked Immunosorbent
Assay.
5.3 HRP: peroxidasa de rábano rusticano ó horse radish peroxidase.
5.4 IP: Inhibición Porcentual.
5.5 LANASEVE: Laboratorio Nacional de Servicios Veterinarios.
5.6 LPS: Lipopolisacárido.
5.7 mAb: anticuerpo monoclonal de ratón
6. Referencias y/o Bibliografía
6.1 Decreto Ejecutivo N° 34858-MAG del 27 de noviembre del 2008.
6.2 Goldsby R.A, T.J. Kindt, B.A. Osborne.2000. Kuby Immunology. 4th ed.W.H. Edit Freeman and Company.
USA.
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6.3 Manual: Brucella-Ab C-ELISA, Svanovir. ELISA test for the detection of Brucella antibodies in serum.
Discriminating between infected and vaccinated cattle. Svanova Biotech AB, Uppsala Science Park, SE-751 83
Uppsala, Sweden.
6.4 López-Goñi I. & I. Morriyón. 2004. Brucella molecular and cellular biology. 1st. ed. Horizon bioscience,
England.
6.5 LANASEVE-PT-002-RE-001 Hoja de Trabajo para ELISA.
6.6 LANASEVE-PE-001-RE-001 Reporte de Resultados de Brucelosis.
6.7 Office International Des Epizzooties. Bovine Brucellosis. OIE Terrestrial Manual 2009. Chapter 2.4.3, 6th Ed.,
Paris.
7. Descripción del Procedimiento
7.1- Fundamento Teórico
El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas competitivo SVANOVIR® (C- ELISA) es un ensayo para la
detección de anticuerpos en suero contra B. abortus y B. melitensis. Es un ensayo considerado multi especies ya
que permite la detección de anticuerpos específicos tanto en animales domésticos como silvestres.
El rendimiento de este test se puede comparar con el rendimiento de la prueba de fijación de complemento (6.3).
7.2 Principio del ensayo
El procedimiento para este ensayo consiste en exponer las muestras de suero a analizar diluidas en conjunto con
un anticuerpo monoclonal de ratón (mAb) (específico para un epitopo de la porción O-polisacárido del LPS-L) al
lipopolisacárido liso de B. abortus (LPS-L), que se encuentra adherido recubriendo cada una de las celdas de la
placa para microtítulo.
Luego de un período de incubación de 30 minutos, la placa es lavada y se le agrega el conjugado de cabra anti
IgG de ratón-peroxidasa HRP, el cual se une a cualquier mAb unido al LPS-L en la placa. Los materiales no
unidos son removidos durante el lavado antes de la adición de la solución de sustrato. El color se desarrolla
gracias a la acción del sustrato sobre el conjugado.
En ausencia de anticuerpos anti Brucella en la muestra de suero (muestra negativa), el mAb unido al epitopo opolisacárido del antígeno del LPS-L producirá el desarrollo de color. Si la muestra contienen anticuerpos
específicos contra Brucella (muestra positiva), competirán con el mAb por los sitios en el epitopo inhibiendo la
unión del mAb a la porción o-polisacáridos del antígeno LPS-L y por lo tanto también inhibiendo la producción de
color (6.3).
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7.3 Materiales, Reactivos y Equipos
7.3.1 Materiales
a) Agua bidestilada
b) Botella graduada con tapa de rosca de 500 ml
c) Botella graduada con tapa de rosca de 2000 ml
d) Botella de lavado o lavador automático de placas
e) Canaletas de depósito de las soluciones
f) Probeta de 1000 ml
g) Film adhesivo para sellar las microplacas o papel aluminio
h) Micropipeta monocanal ajustable que mida 5 µl, 45 µl,300 µl
i)
Puntas descartables para las micropipetas
7.3.2 Reactivos
a) Anticuerpo monoclonal (mAb) liofilizado
b) Buffer de dilución de muestras
c) Conjugado de IgG de cabra anti-ratón- peroxidasa. Listo para usar
d) Placas de microtitulación tapizadas con antígeno LPS-L de B. abortus
e) Solución PBS-Tween 20 X
f) Solución sustrato (tetrametil-benzidina en buffer de sustrato conteniendo H2O2). Almacenar en la
oscuridad
g) Solución de frenada o STOP listo para usar. Contiene acido sulfúrico (corrosivo)
h) Suero Control Positivo (BAC++) - Suero anti-Brucella bovino positivo fuerte, contiene 0.05% de mertiolato
i)
Suero Control Positivo Débil (BAC+) – Suero anti-Brucella bovino de un animal vacunado, contiene 0.05%
mertiolato
j)
Suero Control Negativo (BAC-) - Suero bovino negativo, contiene 0.05% mertiolato.
7.3.3 Equipo
a) Agitador Orbital de placas
b) Cronómetro
c) Lector de microplacas: con un filtro de 450 nm.
d) Lavador de placas (En los laboratorios donde hay disponible)
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e) Refrigerador o cámara de refrigeración: de 0 °C a 4 °C
7.4 Precauciones y/o puntos críticos
a) Mantener el kit y todos los reactivos a 4 °C +/-2 °C.
b) Evitar la contaminación bacteriana o fúngica de los componentes del kit.
c) No utilizar el kit con posterioridad a la fecha de vencimiento.
d) Utilizar agua destilada o ultrapura (agua de Milli Q o equivalente) para preparar los reactivos a
utilizar en los análisis.
e) No entremezclar componentes o folletos de instrucciones de kits con diferentes lotes.
f) Si el suero contiene células en suspensión, hay que centrifugar el tubo a 2500 rpm durante 10 minutos,
para separar el suero de las células.
g) Debe examinarse la muestra del suero y determinar su idoneidad para la prueba.
h) Verificar que no haya precipitación de cristales en la solución PBS-Tween 20 X concentrado. Si hay
presencia de cristales, calentar en baño maría y mezclar bien.
i)
Agregar el buffer diluyente de las muestras cuidadosamente dentro de la botella para evitar que se forme
espuma. Preparar inmediatamente antes de usar. Mezclar suavemente, no utilizar mezclador vortex.
j)
El anticuerpo monoclonal no se debe mezclar con vortex o mezcladores rotativos ni cualquier otro modo
que produzca espuma. Basta con mezclarlo suavemente, invirtiéndolo manualmente varias veces.
k) El tiempo de diferencia entre los controles/muestra y la adición del mAb no debe exceder los 10 minutos.
l)
Es importante que la muestra ha analizar y el anticuerpo monoclonal estén bien mezclados hasta formar
una mezcla homogénea para aumentar al máximo el acoplamiento.
m) La Solución de Sustrato es irritante para los ojos, el sistema respiratorio y la piel. Evitar el contacto con
piel y ojos.
n) La solución de frenado o parada contiene ácido sulfúrico, es un ácido fuerte y puede producir
quemaduras por lo tanto se debe manejar con cuidado.
o) Asegurarse de que el lector de microplacas ha tenido un período de calentamiento de 3 minutos por lo
menos y que la lámpara funciona.
p) Este kit es utilizado para diagnóstico in vitro exclusivamente.
7.5 Preparación de Reactivos
7.5.1. Buffer PBS-Tween: Diluir la solución PBS-Tween 20 X concentrado 1/20 en agua destilada. Preparar 500
ml por plato agregando 25 ml de solución PBST a 475 ml de agua destilada y mezclar totalmente.
7.5.2. Solución de anticuerpo monoclonal (mAb): Reconstituir el mAb liofilizado con 6 ml de Buffer.
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7.5.3. Todos los reactivos deben equilibrarse a una temperatura ambiente de 18 °C a 25 °C antes de su empleo.
7.6 Incubación del suero, el conjugado y el antígeno
a) Diluir las muestras y controles directamente en el plato.
b) Agregar 45 µl del Buffer Diluente para Muestra a todos los pozos que se utilizan en el análisis y a los
pozos control (ver figuras 1, 2 en Anexos).
c) Agregar 5 µl de los sueros control: Positivo Fuerte, Positivo Débil y Negativo dentro de cada pozo
respectivamente. Correr cada control en duplicado. Estos sueros control se colocan en la columna N° 1
del plato. (ver figuras 1,2 en Anexos).
d) Agregar 5 µl de Buffer Diluente a los pozos H y G de la columna N° 1 designados como Control
Conjugado, Cc). (Ver figuras 1, 2 en Anexos).
e) Agregar 5 µl de cada una de la muestra de suero a analizar en el resto de la placa en duplicado.
(Referirse a la figura 2 en Anexos).
f) Agregar 50 µl del mAb a todos los controles y a las muestras.
g) Sellar el plato con una hoja de plástico adhesivo, tapa plástica ó papel aluminio y mezclar los reactivos
totalmente con el agitador de platos por 5 minutos. Alternativamente golpear suavemente los lados del
plato.
h) Incubar a temperatura ambiente de 18 °C a 25 °C por 30 minutos.
i)
Lavar el plato/tiras utilizando una micropipeta multicanal, 4 veces con PBS-Tween Buffer llenando los
pozos con 290 µl en cada lavado o enjuague. Vaciar todo el fluido de los pozos y golpear con firmeza el
plato contra papel toalla limpio para eliminar las últimas trazas de fluido.
j)
Agregar 100 µl de Solución de Conjugado a cada pozo. Sellar el plato con papel adhesivo tapa plástica ó
papel aluminio e incubar a temperatura ambiente de 18 °C a 25 °C de por 30 minutos.
k) Lavar el plato/tiras utilizando una micropipeta multicanal 4 veces con PBS-Tween Buffer llenando los
pozos con 290 µl en cada lavado. Vaciar todo el fluido de los pozos y golpear con firmeza el
l)
plato contra papel toalla limpia para eliminar las últimas trazas de fluido.
7.7 Incubación con la solución de sustrato cromógeno
a) Agregar 100 µl de solución de sustrato a cada pozo e incubar por 10 minutos a una temperatura de 18 °C
a 25 °C. Tomar el tiempo con el cronómetro después de llenar el primer pozo.
b) Parar la reacción al cabo de 10 minutos, agregando 50 µl de solución de parada o frenado a cada pocillo.
Agregar la solución de parada o frenado en el mismo orden que la solución sustrato en el paso 7.7.a).
c) Medir la densidad óptica (D.O) de los controles y las muestras en un lector ELISA de microplacas a 450
nm (emplear aire como blanco). Medir la D.O. dentro de los 15 minutos después de agregar la solución
de parada o frenado.
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7.8 Lectura del ensayo y cálculo de los resultados
7.8.1 Calcular la media de los valores de la densidad óptica para cada control y muestra.
7.8.2 Los resultados para los sueros de control y de análisis se expresan en tanto por ciento de inhibición (% PI)
de actividad del anticuerpo monoclonal (mAb) contra el antígeno.
7.8.3 El coeficiente PI para cada muestra se calcula según la siguiente fórmula:
PI = 100 – [Media Densidad Óptica de las muestra/controles] x 100
Media Densidad Óptica del control conjugado Cc
Ejemplo:
PI = 100 – [ [ ____0,300____ ] x 100]=70,900 %
1,030
7.8.4 Los resultados deben ser anotados en LANASEVE-PT-002-RE-001 Hoja de Trabajo para ELISA.
7.9 Interpretación de Resultados
7.9.1 Criterios de validación: Lo sueros de control para el ensayo deben ajustarse a los límites especificados
durante la normalización, el perfeccionamiento y puesta en práctica del ensayo. Los datos se expresan en
valores D.O y en PI para el control conjugado y en PI para los otros controles (positivo, positivo débil y negativo).
7.9.2 Valores de los controles y sus límites de control*
a) D.O Control Conjugado : 0,75 a 2,00 densidades ópticas.
b) PI Control Positivo: 80 % a 100 %
c) PI Control Positivo Débil: 40 % a 65 %
d) PI Control Negativo: - 5 % a 10 %
Nota: Estos límites pueden variar para cada lote.
*Si la prueba es inválida, la técnica puede ser sospechosa y el ensayo debe repetirse.
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7.9.3 Interpretación de los resultados
a) IP = < 30% Negativo. La muestra no contiene anticuerpos específicos contra B. abortus.
b) IP = ≥ 30% Positivo. La muestra contiene anticuerpos específicos contra B. abortus.
7.9.4 El Reporte de Resultados se elabora utilizando el documento LANASEVE-PE-001-RE-001 Reporte de Resultados de
Brucelosis.
8. Anexos.
Figura 1.
Esquema del procedimiento del ensayo cELISA para el diagnóstico de Brucelosis.
A) Añadir controles y sueros de prueba (1:10),
B) Agregar el anticuerpo monoclonal,
C) Mezclar y dejar incubar ½ hora y luego lavar 4 veces,
D) Añadir conjugado anti-ratón cabra con peroxidasa HRP,
E) Dejar incubar ½ hora y luego lavar 4 veces,
F) Añadir sustrato y leer a los 10 minutos en el fotómetro a 450 nm.
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Figura 2. Formato de la hoja de trabajo para la ubicación de los controles y muestras.
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