Determinación de la actividad específica de la enzima lacasa

LABORATORIO DE INGENIERIA BIOQUIMICA III
PRACTICA NO 1
DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ESPECÍFICA DE LA ENZIMA LACASA
INTRODUCCIÓN
En trabajos de bioquímica, frecuentemente es necesaria la determinación de la
concentración de proteínas. Para tal objetivo existen diversos métodos y para la elección de
uno de ellos habrá que tener en cuenta lo siguiente:
o La cantidad total de proteína disponible
o La concentración de la solución
o La presencia de compuestos que interfieran en el ensayo
o La rapidez con la que se necesita el resultado
En 1972, Folin y Ciocalteau pusieron a punto un reactivo que lleva su nombre y que fue la
base del método descrito después de Lowry en 1951. En el primer paso se forma el complejo
de Biuret, dando la reducción de Cu2+ del complejo, para obtener Cu+ y enlaces peptídicos
oxidados. En el segundo paso, el Cu+ reduce el reactivo de Folin-Ciocalteau, dando lugar a
varios compuestos de color azul que se detectan a una longitud de onda de 750nm. El
componente activo de este reactivo es el ácido mixto fosfomolibdotúngstico. La reducción
de este reactivo se manifiesta por la pérdida de uno, dos o tres átomos de oxígeno del
tungstato y del molibdato, obteniéndose las especies de color azul. Además de la reacción
del complejo Biuret formado en la primera etapa, también contribuyen a la reducción del
reactivo las cadenas laterales de algunos aminoácidos (Tyr, Trp y en menor medida Cys-Cys,
y Cys-His). La susceptibilidad a la composición aminoacídica de las proteínas es una
desventaja del método, además algunos agentes reductores utilizados en las preparaciones
de las proteínas (-mercaptoetanol, ditiotreitol, EDTA) interfieren en el ensayo. El
procedimiento de Lowry esta sujeto a la interferencia por compuestos como el ión potasio,
magnesio, EDTA, Tris, reactivos con grupos tiol y carbohidratos. Otros métodos para
cuantificar la cantidad proteica es el método de Biuret, que es sensible a todos los anteriores
compuestos además de amonio y glicerol. Un procedimiento que elimina los problemas que
los dos métodos anteriores, además del tiempo del proceso, es el método de Bradford, que
esta basado en las propiedades químicas del principal compuesto, que es el azul brillante
de Coomassie G-250, y el cual forma un complejo colorido azul al unirse a las proteínas y rojo
en su forma libre. El complejo tiene un alto coeficiente de extinción molar y que se forma
rápidamente (2 min) y que es estable por 1 h.
Para la obtención de enzimas intracelulares a partir de microorganismos, se pueden usar
algunas técnicas para lograr la lisis celular, por ejemplo el rompimiento mecánico, presión
celular, sonicación, choque osmótico y rompimiento químico. Los hongos microscópicos,
poseen un sistema multienzimático sofisticado, que les permite desdoblar los nutrientes. Este
sistema enzimático sofisticado es capaz de romper enlaces altamente polimerizados. Las
principales enzimas que son causantes esta despolimerización son la Manganeso
peroxidasa, Lignino peroxidasa, superoxido dismutasa y la lacasa. Estas enzimas se
encuentran en hongos con una capacidad ligninolitica avanzada.
OBJETIVO
Que el alumno aprenda a calcular la actividad especifica, a través de la estimación
experimental de la velocidad de reacción de la enzima lacasa de hongos.
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MATERIALES
22 Tubos de ensayo (pequeños)
1 Gradilla para tubos
1 Probeta de 100 mL
4 Vasos de precipitados de 100 mL
1 Micropipeta de 1000 L
1 Micropipeta de 200L,
1 Piceta con agua destilada
1 Vortex
1 Espectrofotómetro
2 Celdas de Acrílico (profesor)
2 Pipetas Pasteur
1 Palangana
Puntas para Micropipeta (profesor)
Papel seda
REACTIVOS
Fosfato de sodio monobásico
Fosfato de sodio dibásico
NaCl
Albumina de Huevo
Agua destilada
2,6 dimetoxifenol (2,6DMP) (profesor)
Reactivo de Bradford (profesor)
Enzima Lacasa MtL (profesor)
ALUMNOS
Tijeras
Franela
Maskintape y Plumón con tinta Indeleble
PREPARACIÓN DE SOLUCIONES
(UN ALUMNO DE CADA EQUIPO SE PRESENTARA AL LABORATORIO PREVIO A LA PRACTICA)
A. 1000 mL de solución de NaCl 0.15 M
B. Preparación de 50 mL de solución estándar de Albúmina de Huevo a 1 mg/ mL en NaCl
0.15 M
C. 1000 mL de Solución amortiguador de fosfatos 50 mM, 1000mL pH 6.
D. Solución de Sustrato enzimático: 250 mL de Solución de 2,6 Dimetoxifenol (2,6DMP) a 0.5
mM en amortiguador de fosfatos pH 6.0
E. Solución de enzima: 50 mL de Solución de enzima lacasa MtL en amortiguador de
fosfatos 0.5mM a pH 6.0.
PROCEDIMIENTO:
Curva Patrón de Albúmina por el Método de Bradford para Cuantificación Proteica
1. Adicionar al tubo 1, 800L de solución patrón de albúmina y 800 L de NaCl 0.15 M, agitar
y tomar de este tubo 800L y adicionarlo al tubo 2, al cual se le adicionaran 800 L de
NaCl 0.15 M, agitar. Efectuar este proceso hasta el tubo número 11 del cual se
desecharan 800L.
2. Incluir 4 tubos más. En el primer tubo se colocarán 800L de solución de enzima lacasa.
En el tubo dos se adicionaran 800 L de solución de enzima lacasa con 800L de solución
de NaCl 0.15 M, agitar. Se tomaran 800L de esta mezcla y se adicionan al tubo 3 y se
efectuara el proceso se la sección 1, para las diluciones.
Tubo
0
1
2
*
*
*
10
11
Sol. Albumina (L)
0
800
800
*
*
*
800
800
NaCl 0.15M (L)
800
800
800
*
*
*
800
800
Vol. Total (µL)
800
800
800
*
*
*
800
800
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Conc. [mg/mL)]
*
*
*
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Una vez efectuadas las diluciones (tomando en cuenta que la concentración de cada tubo
será de la mitad del anterior), se adicionan 200L de Reactivo de Bradford a todos los tubos;
agitar y dejar en reposo. Después de 10 minutos, tomar la lectura de la absorbancia de
cada tubo en celdas de acrílico, a la longitud de onda de 595 nm, ajustando previamente
el espectrofotómetro con el blanco (tubo 0).
Ensayo Enzimático
1. Disponer 5 tubos de ensaye y efectuar las diluciones como en la sección anterior,
tomando en cuenta que la concentración de cada tubo será de la mitad del anterior
Tubo
0
1
2
3
4
Sol. de Lacasa
(L)
0
900
900
900
900
Fosfatos pH 6.0
(L)
900
900
900
900
900
Vol. Total (µL)
900
900
900
900
900
2. En el espectrofotómetro elegir la opción de “cinética”, con la siguientes condiciones:
Para la determinación con 2,6-DMP elegir una 469 nm, tiempo de retardo = 0 minutos,
intervalos de 25 segundos, tiempo total 5 minutos.
3. Adicionar al tubo cero 100µL de 2,6-DMP agitar y colocar en una celda de acrílico este
servirá como blanco espectrofotométrico.
4. Una vez ajustado el blanco, adicionar el tubo uno 900µL de 2,6-DMP y anotar la lectura
de la absorbancia cada 25 segundos hasta que se cumplan los 5 minutos.
5. Una vez concluido el tiempo efectuar el mismo procedimiento anterior para el tubo 2 y
los demás tubos.
PREREPORTE
Cada equipo entregará al profesor los resultados de las absorbancias de la curva patrón y
del Ensayo Enzimático al finalizar la práctica.
REPORTE DE RESULTADOS
a) Curva patrón de proteína:
o Construir una grafica de absorbancia a 595 nm contra concentración de
albúmina y mostrar en una tabla los resultados de la regresión lineal.
o Elaborar una tabla con la absorbancia de las muestras de enzima lacasa, el factor
de dilución y determinar la concentración de las diluciones de enzima por intra o
extrapolación a la curva patrón.
o Determinar la concentración promedio real de la enzima en la solución.
b) Ensayo de Actividad:
o Construir las curvas de progreso (abs vs tiempo), respecto a las diluciones de
enzima con 2,6 DMP (analice la pendiente de cada curva).
o En una tabla mostrar los resultados de la actividad enzimática, (utilizando el
coeficiente de extinción molar del sustrato oxidado, DMP= 49600 M-1cm-1), la
concentración de enzima, el factor de dilución, la actividad enzimática específica
para cada uno de los tubos.
o Estimar la actividad específica promedio real la enzima lacasa en Unidades
Internacionales Enzimáticas Específicas.
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No se olvide de incluir la desviación estándar y el % de error grupal para cada una de las
determinaciones.
c) En ANEXOS: Mostrar en forma adecuada y entendible todos los cálculos efectuados para
las secciones a y b.
CUESTIONARIO
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Investigue la estructura química del principal componente del reactivo de Bradford
Analizando la estructura química, ¿Cuál sería el fundamento de la reacción de Bradford?
Enliste que reactivos son compatibles con el reactivo de Bradford
Efectúe una tabla de la comparación de la sensibilidad del método de Lowry, Biuret y
Bradford al cuantificar una serie de proteínas
¿Qué enzima de los hongos estudiados es la que esta actuando sobre los sustratos
ensayados?
¿Cómo se define la actividad de una enzima y describa las unidades dimensionales?
¿Qué diferencia existe entre las Unidades Internacionales (UI) y unidades enzimáticas
específicas (UIE)?
Que es un Katal (Kat) y exprese las unidades dimensionales?
Si una enzima que tiene una actividad de 50 unidades internacionales específicas y la
enzima tiene un peso molecular de 78500 g/mol cual será su actividad en Katales (Kat)
BIBLIOGRAFÍA
1. Bradford M. M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry.
72: 248-254.
2. Bio-Rad Protein assay: Guide Bio-Rad assay. 2005, USA.
3. Segel C. (1976) Enzyme Kinetics. Edition, John Wile & Sons. NY, USA.
4. Wang D. I., Cooney C. L., Demain A. L., Dunnill P., Humphrey A. E. and Lilly M. D. (1979)
Fermentation and Enzyme Technology. John Wiley & Sons. NY. USA.
5. Solomon E. I., Sundaram U. M. y Machonkin T. E. (1996) Multicopper oxidases and
oxigenases. Chem. Rev. 96: 2563-2605.
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