Seminario 3 - Universidad Nacional de La Plata

Facultad de Ciencias Exactas, Universidad Nacional de La Plata
Bioquímica II – 2007
Seminario 3: Ciclo de Ácidos Tricarboxílicos y del Glioxilato.
TEMARIO
Clase 1
Mitocondria, su estructura. Producción de AcCoA a partir de piruvato. Complejo de la piruvato deshidrogenasa. Enzimas y coenzimas
intervenientes.
Ciclo de Krebs. Intermediarios, enzimas, coenzimas. Posibles fuentes de acetil-CoA. Reacciones anapleróticas. Carácter anfibólico del ciclo de
Krebs. Regulación del ciclo.
Sistemas de transporte transmembrana de poder reductor: lanzaderas del fosfoglicerato y del malato/aspartato.
Clase 2
El ciclo de ácidos tricarboxílicos reductivos (rTCA).
Ciclo del glioxilato: localización celular y tisular, reacciones y regulación, síntesis neta de glucosa a partir de acetato en E. coli y plantas:
comparación con mamíferos.
BIBLIOGRAFÍA
- Nelson, DL y Cox, M.M. (2005) Lehninger Principles of Biochemistry, Cuarta Edición, Capítulo 16 Worth Publishers; 2005 (también
versiones en español de la Segunda y Tercera Edición). http://bcs.whfreeman.com/lehninger/
- Voet, D y Voet, JG (2004). Biochemistry, Tercera Edición, Capítulo 21.
http://he-cda.wiley.com/WileyCDA/HigherEdTitle/productCd-047119350X.html
- Donald Voet • Judith G. Voet • Charlotte W. Pratt (2006). Fundamentals of Biochemistry, Second Edition. Capítulo 16, by John Wiley &
Sons, Inc. http://he-cda.wiley.com/WileyCDA/HigherEdTitle/productCd-0471214957.html
- Reginald H. Garrett and Charles M. Grisham’s (2005) Biochemistry, Tercera Edición (también la segunda edición 1999), Capítulo 20,
Thomson Brooks/Cole. ISBN 0-534-49033-6 (http://chemistry.brookscole.com/ggb3)
- Rodney Boyer (2006). Concepts in Biochemistry. Third Edition. Capítulo 16, by John Wiley & Sons, Inc
http://bcs.wiley.com/he-bcs/Books?action=index&itemId=0471661791&bcsId=2779
- Berg, J.M., Tymoczko, J.L. & Stryer, L. (2006) "Biochemistry". 6th edn. W.H. Freeman. http://bcs.whfreeman.com/biochem6/
- Mathews, C.K., van Holde, K.E, & Ahern, K.G. (2000) "Biochemistry". 3rd edn. Benjamin Cummings. ISBN 0-8053-3066-6.
http://www.aw-bc.com/mathews/
PREGUNTAS GUIA
Estas preguntas marcan aquellos puntos en los que debe prestar particular atención cuando estudia el tema del libro. Las respuestas
aparecen en todos los libros de bioquímica por lo que no se desarrollarán en clase.
Clase 1
1 - El ciclo de ácidos tricarboxílicos (TCA, o Krebs) es una ruta muy conservada, y que participa en la oxidación completa de cadenas
carbonadas. Previo a su entrada en el ciclo, las cadenas carbonadas son convertidas a acetil-CoA, y los grupos acetilos resultan
oxidados a CO2 al ser incorporados a la ruta cíclica.
a) Escriba la fórmula desarrollada del Acetil-CoA
b) Identifique las reacciones redox del ciclo de Krebs. ¿Cuál o cuáles podrían ser las coenzimas intervinientes?. ¿Por qué?
c) Escriba la ecuación total que representa una vuelta del ciclo.
d) Cuáles son los productos del ciclo utilizables para la síntesis de enlaces de alta energía.
2 - Ubicación celular de ciclo de Krebs (procariotes y eucariotes). ¿Están las enzimas unidas a membrana? ¿ A cuál?
3 - ¿Cuál es la reacción enzimática que conecta la glicólisis con el Ciclo de Krebs? En que compartimiento tiene lugar y porqué tiene
fundamental importancia su carácter irreversible?
4 - ¿Qué factores regulan el flujo metabólico y la velocidad del ciclo de Krebs?
5 - ¿Cuál es la enzima del Ciclo de Krebs más sensible a la carga energética? Esta reacción decide no sólo la activación del ciclo sino también
el inicio de la síntesis de ácidos grasos. Explique la regulación de esta enzima en hígado para distintas situaciones metabólicas: a) a la
mañana en ayunas y b) después de una ingesta.
6 - Para qué existen las reacciones anapleróticas? ¿Qué importancia poseen en distintos tipos de organismos: plantas, bacterias y células de
mamíferos?
7 -El Acetil Co-A es un activador indispensable y un inhibidor de 2 reacciones metabólicas que tienen como sustrato al piruvato. Explique la
lógica metabólica de esta regulación y en que situaciones metabólicas concretas se presenta para los distintos tipos de células.
8.-Para los siguientes compuestos, indique cuáles pueden atravesar la membrana mitocondrial sin la necesidad de una transformación química.
Para aquellos que no la atraviesan de este modo, explique cómo se produce el transporte entre mitocondria y citosol y en qué situaciones
metabólicas ocurre dicho transporte y en qué sentido:
ATP
malato
citrato
Piruvato
acetil Co-A
aspartato
Oxalacetato
fosfoenolpiruvato
Clase 2
9. ¿Qué organismos presentan el ciclo del glioxilato?. ¿En qué compartimiento de la célula ocurre dicho ciclo?. ¿Qué actividades enzimáticas
mediría para constatar la presencia de este ciclo?.
10– Se supone que las bacterias del género Rhizobium no utilizan el ciclo de Krebs en su metabolismo, sin embargo utilizan varias de sus
enzimas en una ruta alternativa. ¿Qué pruebas experimentales realizaría para constatar esta suposición?
1
PROBLEMAS
Clase 1
1- Se divide un cultivo de células hepáticas permeabilizadas en tres subcultivos. A cada uno de ellos se adiciona una fuente de
carbono marcada con 14C, y se incuban en condiciones óptimas para el crecimiento celular aeróbico.
Subcultivo
Fuente de 14C
A
3-14C-piruvato
B
1-14C-gliceraldehído-3-P
C
5-14C-fructosa-6-P
a) Indique si se hallará, para cada caso, acetil-CoA marcado con 14C, y si es así, en qué posición del acetato se encontrará la
marca. Justifique su respuesta con rutas metabólicas detalladas (fórmulas, enzimas, coenzimas).
b) Indique cuál sería el destino de la marca luego de una vuelta del ciclo de Krebs.
c) Calcule la cantidad de poder reductor en número de moléculas de NADH y FADH2 que se producirán durante la degradación
oxidativa completa de una molécula de cada uno de los sustratos indicados, hasta CO2+ H2O.
2-
En la tabla se muestran las concentraciones intracelulares de intermediarios del TCA en músculo esquelético distintas en
condiciones metabólicas.
a) Escriba las reacciones (con fórmulas químicas) que forman parte del ciclo e identifique las reacciones irreversibles.
b) Indique las enzimas que controlan el flujo metabólico en el ciclo y cómo se regula su actividad.
c) Explique los cambios observados en la tabla cuando el individuo pasa del estado de reposo a actividad.
d) Indique de donde provienen los metabolitos que alimentan el ciclo en estas condiciones, principales enzimas involucradas y
regulación.
3-La
oxidación del acetil-CoA a CO2 a través del ciclo TCA es un proceso central del metabolismo energético, sin embargo
este ciclo también funciona en rutas biosintéticas generando intermediarios que dejan en ciclo para ser primariamente
convertidos en glucosa, ácidos grasos o amino ácidos no esenciales.
a)
Indique cómo hace el ciclo
para seguir funcionando cuando
algunos
de
sus
INTERMEDIARIOS
SON
REMOVIDOS.
Escriba
las
reacciones involucradas, indique
en que compartimiento se ubican y
como se regulan.
Indique la posición de las distintas
enzimas en el esquema mostrado
en la figura
b)
En otras condiciones
metabólicas por ejemplo cuando
ocurre el catabolismo de aminos
ácidos INGRESAN en el ciclo
2
INTERMEDIARIOS de 4- y 5-carbonos que deben ser removidos del ciclo por un proceso llamado CATAPLEROSIS. El proceso
de cataplerosis puede por ejemplo estar ligado a procesos biosintéticos como por ejemplo con:
1- gluneogénesis en el hígado y riñón,
2- síntesis de ácidos grasos en el hígado,
3- síntesis de glicerol en el tejido adiposo
Las enzimas que intervienen en este proceso reciben el nombre de “ENZIMAS CATAPLERÓTICAS” como por ejemplo Penolpiruvato carboxiquinasa (PEPCK), glutamato dehidrogenasa, aspartate aminotransferasa, y citrate liasa.
b1) Escriba las reacciones catalizadas por P-enolpiruvato carboxiquinasa (PEPCK) y citrato liasa. Indique el compartimiento
celular y cuáles es su función metabólica.
c) Indique con reacciones cómo se produce la síntesis de glucosa y glicerol a partir de
compuestos de 4 carbonos. Escriba
el nombre de las enzimas involucradas, indique en que compartimiento se ubican y como se regulan.
d)
En el caso de un microorganismo que crece en un medio que contiene alfa-ceto-glutarato de sodio como única fuente de C..
d1) Escriba las reacciones que permiten la oxidación completa del alfa-ceto-glutarato.
d2) Escriba la ecuación balanceada global de esta conversión.
d3) Suponiendo que se ha consumido el 20% (oxidación completa) del alfa-ceto-glutarato presente en 50 ml de cultivo
(concentración inicial de 5 g/L. ¿cuál es el poder reductor generado en moles de NADH o FADH2?
d4)¿Podría este organismo utilizar el alfa-cetoglutarato como única fuente de energía en anaerobiosis?
4- La reacción catalizada por la malato deshidrogenasa tiene un G0'= +7,1 kcal/mol.
0
a) Calcule la constante de equilibrio para la reacción a 25 C
0
b) Como G ' se supone a pH = 7, la constante de equilibrio obtenida en a) corresponde a
K'eq = [oxalacetato] [NADH]
[L-malato] [NAD+]
La concentración de L-malato medida en las mitocondrias de hígado de rata es alrededor de 0,20 mM, con una relación de
concentración de NADH/NAD+ 0.1. Calcule la concentración de oxalacetato a pH 7 en las mitocondrias de hígado de rata.
c) Las mitocondrias de hígado de rata son esféricas y poseen un diámetro de unos 2 m. Para apreciar la magnitud de la
concentración de oxalacetato en las mitocondrias calcule el número de moléculas de oxalacetato en una mitocondria.
d) Dado que el pH interno de las mitocondrias es levemente superior al pH exterior, indique la cantidad de moléculas de
oxalacetato por mitocondria a pH 7,5.
e) En forma esquemática explique el funcionamiento del antiporter malato-aspartato.
f) Prediga en qué sentido funcionará este antiporter si la relación [NADH] / [NAD+] es 0.002 en el citoplasma y 0.1 en
mitocondrias.
g) Explique como se transporta el NADH generado en la glicólisis a la mitocondria para que ocurra su oxidación completa (Dibuje
todos los transportadores intervinientes y con una flecha indique el sentido en que operan)
Datos: R=1.99 cal/mol
Clase 2
1- Las semillas de
muchas plantas poseen una alta proporción de aceites además de almidón como sustancia de reserva. Ud
sabe que estas semillas son capaces de utilizar el aceite como fuente de energía para germinar y crecer hasta constituir una
plántula con hojas capaces de hacer fotosíntesis.
a-Explique mediante las fórmulas, ecuaciones y enzimas correspondientes como pueden las semillas obtener energía a partir del
aceite de reserva, suponiendo que la cantidad de almidón es muy escasa. Recuerde que la degradación de los ácidos grasos
produce el acetil CoA en el peroxisoma, pero que la mayor parte de la energía se produce en la mitocondria.
b-Basándose en las fórmulas que Ud escribió en el inciso anterior , indique la ecuación final para la obtención de ATP a partir de
acetil CoA y calcule los moles de ATP formados en la mitocondria por mol de acetil CoA producido en el peroxisoma al oxidarse
los ácidos grasos. Muestre claramente sus cálculos y use siempre números enteros.
3
c- Escriba la ruta y la ecuación neta para la formación de 1 mol de glucosa a partir de acetil CoA. Incluya las fórmulas y los
nombres de las enzimas. No repita las fórmulas y enzimas que mostró en el inciso a)
d- Si los acetil CoA producidos en el peroxisoma estuvieran marcados radioactivamente en el carbono 1 , indique cual/cuales de
los carbonos de la glucosa aparecerán macados.
e-Si sólo el 30% de la energía producida por el acetil CoA se usa para la gluconeogénesis , cuantos acetil CoA deberían
degradarse para sintetizar un mol de glucosa? Justifique su respuesta.
f-Teniendo en cuenta sus respuestas en los incisos b, c, d y e ) indique que porcentaje de la marca total contenida en los
acetil CoA del inciso ii)aparecerá en la glucosa.
Los siguientes estudios analizan el rol de las reservas de aceite durante la germinación y establecimiento de plántulas en
Arabidopsis thaliana. Esta especie posee una alta proporción de aceites y algunos carbohidratos en la semilla. La semilla debe
hidratarse para germinar y tiene que tener una fuente de energía para poder crecer. Hasta contar con una cantidad de hojas
suficientes para realizar fotosíntesis, la plántula puede usar sus reservas de la semilla. Con el objetivo de estudiar si los ácidos
grasos del aceite eran responsables del proceso germinativo, se aislaron mediante técnicas de ingeniería genética dos mutantes
de la mencionada especie que carecían de la enzima isocitrato liasa, icl -1 e icl -2 . La única diferencia entre estos dos mutantes
son las regiones del gen de la isocitrato liasa que se extrajeron para impedir que se exprese la proteína funcional.
La Figura 1A y B muestra el
Figura 1
efecto de la intensidad de la
luz (A), y las horas de luz
diarias (B) sobre la frecuencia
de
establecimiento
de
plantines con hojas
en
Arabidopsis salvaje y los
mutantes icl-1 e icl-2. PPFD:
densidad de flujo de fotones.
La figura 1C muestra el efecto
de la suplementación de
sacarosa sobre el crecimiento
de los tallos de los plantines
en las semillas salvajes y los
mutantes.
Además
las
semillas mutantes se trataron
con 3-nitropropionato (3-NP) e
itaconato (ITA), conocidos
inhibidores de la isocitrato liasa. Las letras H y h indican si los mutantes son homo o heterocigotos.
g-¿Porqué cree Uds que las plántulas salvajes no muestran diferencias con
las mutantes cuando hay luz suficiente y muestran diferencias cuando no la
hay? No escriba fórmulas para justificar su respuesta
h-¿Como interpreta los resultados de la figura 1 C?
Experimentos adicionales
i-Cuando se suministró acetato marcado con 14C a las semillas salvajes y
mutantes, el porcentaje de marca en carbohidratos resultó ser un 90%
menor en los mutantes icl- que en Arabidopsis salvaje. Indique la conclusión
que extrae de este experimento .
j- La Figura 2 muestra el contenido de ácidos grasos de los plantines
crecidos en oscuridad en ausencia (A) y presencia (B) de sacarosa.
Figura 2
Figura 2 Días a partir de la hidratación de la semilla
Para el caso de la Figura 2 A los mutantes no crecen apreciablemente.
Explique porqué hay degradación de lípidos al suplementar con sacarosa los
plantines y no hay degradación en ausencia de sacarosa. ¿Cual es el sustrato para la respiración ?
4
2-
Muchos organismos autótrofos fijan CO2 empleando el ciclo de Calvin-Benson o pentosas reductivas. En cambio los
microorganismos extremófilos (aquellos que se han adaptado a condiciones extremas como ambientes a altas temperaturas,
extremadamente ácidos o anaeróbicos) pueden emplear rutas alternativas. Ud esta estudiando el metabolismo de Chlorobium
tepidum, bacteria del azufre verde (es fotosintética) y encuentra que dicha
bacteria posee dos sintasas dependente de ferredoxina que no se encuentran en
CO2
COOH
otros organismos fotosintéticos y una ATP citrato liasa similar a la de organismos COSCoA
C O
eucariotas. Las reacciones catalizadas por estas enzimas se muestran en la figura: CH
2
a. Escriba los nombres de los compuestos mostrados en la figura. Ud ha estudiado
CH2
CH2
una vía metabólica en que intervienen esos compuestos, ¿cuál es?.
2Fdred CoA CH2
b- Podría emplear alguno/s paso/s de la vía mencionada en el inciso anterior junto COOH
COOH
con las reacciones de la figura para lograr la transformación de CO2 en piruvato Si
CO2
su respuesta es afirmativa, haga un esquema de la vía metabólica propuesta por
COOH
la cual Chlorobium tepidum fijaría CO2 e indique qué enzimas de dicha vía serían COSCoA
C O
las mismas que la vía del inciso a y cuáles deberían ser reemplazadas por otras
CH3
enzimas.
CH3
2Fdred CoA
c- Cuál es la ecuación global de la vía de fijación de CO2 de Chlorobium
tepidum hasta piruvato como producto final. Compárela con la vía del inciso a
d- Cuál es la actividad catalítica de las enzimas de
COOH
las reacciones mostradas en las figuras. Proponga
COOH
CoA
CH2
un mecanismo para dichas reacciones.
COSCoA
C O
e. Escriba la vía metabólica que permite que esta
HO C COOH
+ CH
3
bacteria transforme de conversión del CO2 en
CH2
CH
2
glucosa.
ATP ADP + Pi COOH
COOH
f. Escriba la ecuación global de la conversión de
CO2 en glucosa. Compárela con el rendimiento
obtenido en la combustión completa de glucosa.
h. indique cuáles serán los puntos más importantes de regulación en esta ruta metabólica.
3.-
Ud está estudiando el metabolismo de otra bacteria
fotosintética fijadora de CO2 que utiliza el ciclo del ácido 3hidroxipropionato, cuyas reacciones se detallan en la figura.
a- Empleando la información que aparece en la figura plantee
la ecuación global del ciclo.
b- Escriba las reacciones por las cuales puede transformar
glioxilato en glucosa. Escriba también la ecuación global.
c- Combinando las ecuaciones de los incisos a y b, indique
cuál es el gasto energético para la fijación de CO2
d- Proponga un mecanismo para las reacciones de fijación de
CO2 que aparecen en las figuras.
4- Leuconostoc mesenteroides
es una bacteria anaeróbica, productora de ácido láctico, que se desarrolla en el vino a pHs
moderados. Estas bacterias metabolizan la glucosa por una vía fermentativa especial que produce etanol y lactato como
productos finales. En el esquema 1 se señala el flujo general de los átomos de carbono de esta ruta, sin indicar en forma
exhaustiva todas las reacciones involucradas, y se resalta la producción y el consumo de ATP y NADH en distintas etapas del
mismo. Uno de los intermediarios de esta ruta fermentativa es el 2-ceto-3-desoxi-gluconato, que sufre una descarboxilación y
fosforilación (a expensas de Pi) oxidante en la misma reacción enzimática, produciendo 2-desoxi-ribonil-1-fosfato (escriba la
fórmula).
5
Si L.mesenteroides se cultiva en presencia de citrato como única fuente de C, las células crecen más lentamente,
transformando el citrato en piruvato y acetato como productos finales. El acetato es eliminado al medio de cultivo y el piruvato se
acumula dentro de la bacteria sin sufrir más modificación. En esta ruta, el citrato es modificado por la enzima citrato liasa para
producir oxalacetato y acetato en una ruta que no rinde ATP (ver esquema 2). Aparentemente, estas bacterias obtienen energía
del medio cuando crecen en citrato mediante la generación de un potencial de membrana asociado al transporte de citrato
dentro de la bacteria, combinado con el transporte de un ácido orgánico (X) fuera de la misma.
Cuando se estudió el cometabolismo de citrato y glucosa por L.mesenteroides se observaron tres fenómenos:
I.
las células crecían más rápidamente que cuando se las cultivaba en presencia glucosa solamente
II. el metabolismo de la glucosa cambiaba en los últimos pasos (ver esquema 3)
III. el citrato se consumía mucho más rápidamente que cuando se las cultivaba en presencia de citrato solamente, y era
convertido en lactato y acetato como productos finales (esquema 2)
En las figuras A y B se comparan la utilización /producción de citrato, piruvato y lactato en células de L. Mesenteroides cultivadas
en presencia de citrato (figura A) o citrato y glucosa (figura B).
Si el ensayo de cometabolismo se realizaba utilizando cantidades catalíticas de glucosa se observaba sólo el fenómeno 2. Si a
este medio se agregaba lactato, la velocidad de consumo de citrato aumentaba (figura C).
Cuestiones a resolver:
a) Escriba (con fórmulas, actividades enzimáticas y cofactores) una ruta metabólica CREIBLE para el metabolismo fermentativo
de la glucosa en L. Mesenteroides. Indique además los 2 posibles destinos del acetilfosfato, según las distintas condiciones
de cultivo mencionadas en el texto.
b) Tal como en el inciso anterior, escriba una ruta metabólica CREIBLE para el metabolismo fermentativo del citrato en esta
bacteria.
c) Explique los resultados que se obtienen de comparar las gráficas A y B e indique cual podría ser la razón del cambio de la
velocidad de consumo y el destino metabólico del citrato cuando este se cometaboliza con la glucosa. Indique porqué razón el
producto final del metabolismo del citrato es el piruvato, cuando las bacterias se cultivan en presencia de citrato solamente y
en cambio es el lactato cuando las bacterias se cultivan en presencia de citrato y de glucosa en conjunto.
d) Conjugue las 2 rutas metabólicas descriptas en los
incisos a y b e indique cual podría ser su
regulación mostrando la ganancia neta de energía
y en poder reductor en cada caso (crecimiento con
y sin citrato)
e) Teniendo en cuenta que el acetilfosfato es un
intermediario de alta energía que puede ser
utilizado en la síntesis de ATP (esquema 3),
indique claramente porqué la bacteria no puede
utilizar este intermediario para sintetizar ATP si
crece en presencia de glucosa solamente, y en
cambio lo destina a la síntesis de etanol. Además,
explique que cambios a nivel molecular permitirían
explicar el cambio en el destino metabólico de la
glucosa cuando esta se cometaboliza con el
citrato.
f)
Explique los resultados que se obtienen de
comparar las gráficas A y C e indique cual es la
razón más probable por medio de la cual el lactato
puede aumentar la velocidad de consumo del
citrato. ¿Cuál podría ser la identidad del ácido X
mencionado en el texto?
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