Facultad de Química Farmacéutica Departamento de Farmacia Laboratorio de Bioquímica

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Facultad de Química Farmacéutica
Departamento de Farmacia
Laboratorio de Bioquímica
Profesor : Rafael Salamanca F.
SEPARACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE UNA FRACCIÓN PROTEICA
En esta práctica trabajaremos con suero sanguíneo humano, del cual separaremos la
fracción de globulinas mediante precipitación con sulfato de amonio y cuantificaremos
tanto la fracción de globulinas como las proteínas totales mediante métodos
espectrofotométricos: el de Biuret y el de Lowry.
Reactivos:
1. Solución acuosa de NaCl 0.9%.
2. Solución saturada de sulfato de amonio (75g/100mL) en agua desionizada.
3. Solución patrón de albúmina (0.45 g en 100 mL de solución salina).
4. Reactivo de Gornall-Biuret.
Preparación de la muestra:
La fracción de globulinas se prepara de la siguiente manera:
Tome 1 mL de suero sanguíneo en un tubo de centrífuga, adicione 4 mL de agua destilada
y agite.
Adicione 5 mL de la solución saturada de sulfato de amonio gota a gota, con agitación
suave pero constante y preferiblemente en frío. Deje reposar durante 10 minutos y
centrifugue a 2000 g/15 min.
Descarte cuidadosamente el sobrenadante y redisuelva el precipitado con 5.0 mL de
solución salina. Esa es la solución usada para determinar las globulinas.
Para la determinación de proteínas totales usaremos una dilución 1/20 de suero sanguíneo
en solución salina.
Procedimiento Método de Biuret.
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Solución
Blanco (mL)
Solución salina
Solución patrón de
albúmina
Solución fracción de
globulinas
Suero diluído 1/20
Reactivo de Gornall
1.0
Patrón (mL)
Detn. de
Globulinas
Detn, de
Proteínas
totales
1.0
1.0
4.0
4.0
4.0
1.0
4.0
Agite cada tubo y deje reposar durante 30 minutos en la oscuridad. Leer la absorbancia a
540 nm.
Calcule en g/L la cantidad de globulinas y de proteínas totales en suero sanguíneo humano.
Método de Lowry
El método más exacto para la cuantificación de una proteína es su hidrólisis seguida de la
determinación de cada uno de sus aminoácidos.
Sin embargo, los métodos que comúnmente se siguen en el laboratorio dependen de la
composición aminoacídica de la proteína y como consecuencia una concentración absoluta
de la proteína no puede ser estimada.
De todos estos métodos, el de Lowry (1) es el más ampliamente usado, pues su sensibilidad
es moderadamente constante de proteína a proteína, lo cual, lo hace aceptable cuando se
trata de determinación absoluta en mezclas de proteínas o en extractos crudos.
Este método es mucho más sensible (unas cincuenta veces) que el de Biuret.
En él se combina la reacción de Biuret con la reducción de un reactivo
fosfotugstomolipdico (Reactivo de FOLIN-CIOCALTEU), la cual es debida
principalmente a la tirosina, el triptófano y en menor grado a la cisteína y la histidina.
Objetivo:
Determinar la concentración de una solución de albúmina.
Reactivos:
1. Reactivo de FOLIN-CIOCALTEU. Se usa en concentración 1 N.
2. NaOH 2 N.
3. Solución A: Na2CO3 en agua destilada 2% (p/v).
4. Solución B: CuSO4.5H2O en agua destilada 1% (p/v).
5. Solución C: Tartrato de sodio y potasio en agua destilada 2% (p/v).
6. Solución Patrón: Solución de albúmina 4mg/mL en NaCl 0.9% (p/v).
7. Solución complejante: se prepara inmediatamente antes de usar mezclando las
soluciones A:B:C cada una en una proporción 100:1:1 respectivamente.
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Procedimiento:
1. Hacer la siguiente curva estándar (mezcle suavemente):
Tubo
1
2
3
4
Solución patrón
(mL)
NaCl 0.9% (mL)
0
0.0125 0.025 0.0625 0.125 0.250 0.625 1.250 2.500
5
4.990
Concentración de
proteína
(mcg/mL)
0
10
4.980 4.940
20
50
5
6
7
8
9
4.880 4.750 4.380 3.750 2.500
100
200
500
1000 2000
2.1 A 0.2 mL de muestra o solución patrón agregue 0.2 mL de NaOH 2 N y lleve a 100ºC
por 10 minutos. (Para qué se hace esta manipulación?).
2.2 Lleve a temperatura ambiente y adicione 2 mL de solución complejante recientemente
preparada. Agite y deje reposar por 10 minutos.
2.3 Agregue 0.2 mL del reactivo de FOLIN, inmediatamente agite y deje en reposos por
30 minutos en la oscuridad.
2.4 Lea absorbancia a 750 nm si la concentración de proteína es menor de 500 mcg/mL. A
550 nm si la concentración está entre 1000 y 2000 mcg/mL ( Por Qué?).
2.5 Grafique una curva estandar de absorbancia en función de la concentración inicial de
proteína y utilícela para por extrapolación determinar la concentración de la solución
albúmina problema en g/L.
BIBLIOGRAFIA:
1. Lowry, O. H., Rosebrough, N.Y., Farr, A.L. and Randall, R.J.
J.Biol.Chem. 193, 265-275. (1951)
2. Methods in Molecular Biology Vol. 1. Edited by Walker J.M,(1984).
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Profesor : Rafael Salamanca F.
ENZIMAS : TIROSINASA
Frecuentemente se consideran las enzimas como “materiales exóticos obtenidas de fuentes
exóticas”. En parte esto ha sido cierto pues la mayoría de enzimas son extraídas de órganos
de animales mediante complicados procesos de separación y purificación lo que las hace
tremendamente caras.
Es conocido que cuando las papas, las manzanas, bananos y otras frutas se parten, les
aparece un color café. Esto es debido a la conversión de Tirosina a Melanina por una serie
de reacciones mostradas abajo. Este mismo proceso hace que la piel se torne café luego de
exponerse a la radiación ultravioleta.
El albinismo (3.4) se caracteriza por la ausencia de pigmento de la piel, pelo y retina. Esta
enfermedad presenta varios grados, pudiendo ser completa, es decir con ausencia total del
pigmento, o incompleta, en cuyo caso la falta de pigmento se limita a determinadas áreas.
La melanina, pigmento del pelo, piel y ojos, es una sustancia polimérica de estructura
desconocida que se origina como ya se dijo por la oxidación de la Tirosina.
La única enzima implicada en las conversaciones citadas es la TIROSINASA (o-difenol O2
oxidorreductasa E.C. 1.14.18.1.). Esta metal-enzima es la que está en el interior de las
frutas antes mencionadas y como la reacción requiere de oxígeno molecular, la
pigmentación, no ocurre si la parte interior de estas frutas no está expuesta al aire.
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COOH
COOH
HO
O
O2
NH2
HO
COOH
O2
NH2
Enz
O
HO
T irosina
NH2
Enz
Dopa quinona
DOPA
HO
O
HO
COOH
HO
COOH
NH
CO2
O
NH
NH
HO
Dopa crome, 420 nm
O
O
N
O
NH
O
O
N
O
Melanina
Parte experimental:
Reactivos usados:
Solución fosfato 0.1M pH 7.2
Solución fosfato 0.1M pH 6.0
Solución DOPA 0.03 M (en buffer fosfato de pH 6.0)
Manzanas, papas, bananos
Arena lavada con ácido
Lienzo o pañuelo limpio
Mortero
Spectronic 20
Hielo picado.
1. Extracción de la enzima:
Como fuente de tirosinasa se emplean papas, bananos y/o manzanas. Entre 10 y 15 gramos
de la fruta se colocan en un mortero pre-enfriado y se agrega 30 mL de solución fosfato pH
7.2.
Si se usa bananos agregue 60 mL con el objeto de que la mezcla quede filtrable. Agregue
unos pocos gramos de la arena lavada con ácido y con la mano del mortero triture la fruta.
Filtre con un lienzo o pañuelo y centrifugue por 5 minutos en una centrífuga clínica, la
solución sobrenadante se decanta y se coloca en un baño hielo. El extracto de la papa se
diluye con nueve (9) volúmenes de buffer: el extracto de manzanas se ensaya sin dilución y
el banano se diluye con cuatro (4) volúmenes de buffer0.1M pH 7.2.
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2. Ensayo enzimático:
La enzima se ensaya colorimétricamente midiendo la velocidad de conversión del 3,4dihidroxifenilalanina (DOPA) a Dopa-Chrome.
El ensayo se lleva a cabo colocando entre 0.50 y 1.0 mL del extracto enzimático en una
cubeta colorimétrica completando el volumen a 4.0 mL con buffer fosfato de pH 6.0.
La reacción se inicia agregando 1.0 mL de la solución de sustrato (0.03 M de Ledopa).
Debe tenerse un blanco que contenga la misma cantidad de enzima, igual de buffer fosfato y
1.0 mL de agua destilada en lugar de sustrato y agítese bien.
Se lee absorbancia a = 420 nm, inmediatamente después de agregar el sustrato y se sigue
leyendo cada minuto por un lapso de 10 minutos. La actividad enzimática se mide tomando
la diferencia entre la lectura inicial y final dividida por el intervalo de tiempo. Esta
actividad también puede ser determinada de la pendiente del gráfico. Absorbancia vs
tiempo.
En otro tubo, agregue entre 0.5 y un mL de extracto enzimático, complete a 4.0 mL con
buffer de pH 6.0 y caliente por 10 minutos, en un baño de agua hirviendo, enfríe y proceda
a agregar un mL de sustrato. Paralelamente prepare un patrón adecuado que permita
establecer un contraste respecto a la actividad enzimática.
Lea absorbancia vs tiempo por 10 minutos. Qué observa?
.
Agregue a otro tubo, entre 0.5 y un mL de extracto enzimático, complete a 4.0 mL con
buffer de fosfato pH 6.0 y un cristal de NaCN y 1.0 mL de sustrato, Paralelamente prepare
un patrón adecuado que permita establecer un contraste respecto a la actividad enzimática.
Lea absorbancia vs tiempo como los anteriores casos durante 10 minutos, Qué sucede?.
Compare la actividad (Abs / min / g de material) de su extracto con la de los compañeros.
Revisar conocimientos de Cinética enzimática.
3. Bibliografía
1. Enzyme Nomenclature
International Union of Biochemistry, ElsevierSci.Publ.Co.Inc.Amsterdam114(1973).
2. Friedman M.R.,Daron H:H:
J.Chem.Ed.,54,256(1977).
3. Boyer R.F.
J.Chem.Ed.,54,585(1977).
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Profesor : Rafael Salamanca F.
FOSFATASA ALCALINA
1. GENERALIDADES Y PRINCIPIO DEL MÉTODO:
La fosfatasa alcalina (E.C. 3.1.3.1.) hidroliza los fosfoésteres, liberando el fosfato
inorgánico.
RCOOP + H2O
RCOO- + Pi
Ejerce su acción a pH elevado, del orden de 10. La presencia de iones Zn2+ es necesaria para
su actividad, mientras que el fosfato la inhibe.
La especificidad de la enzima por R es débil (estructuralmente es posible variar R
conservando la actividad enzimática) y R puede ser un radical alquílico o fenílico.
R-OH puede ser un alcohol primario o secundario, un fenol o un alcohol cíclico. El sustrato
que usaremos en este ensayo será el p-Nitrofenilfosfato.(PNPP).
OPO3--
OH
H2O
Enz
--
NO2
PNPP
HPO3
NO2
PNP
Este sustrato es incoloro pero por hidrólisis se libera el p-Nitrofenol (PNP), que es amarillo
y absorbe a  = 410 nm, lo cual posibilita “seguirlo” fotocolorimétricamente. Este es el
principio fundamental de esta práctica.
En resumen:
2. Si por acción de la enzima se produce el p-nitrofenol, precisamos de un método que
nos permite cuantificar ésta sustancia para así calcular la velocidad de la reacción
medida por la enzima.
Para ello debemos hacer una curva de calibración:
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SECCIÓN EXPERIMENTAL: Construcción de una curva de calibración.
Reactivos:
a) Buffer de glicina 0.05 M, pH = 10.4
b) Solución fosfato disódico 0.5 M.
c) Solución de p-Nitrofenol (PNP) 10-4M. (Para esta solución y las disoluciones sucesivas,
utilice el buffer de Glicina como solvente).
Tubo
Dilución 10-4M
Vol. de la dilución
(mL)
Fosfato de sodio 0.5M
Buffer de Glicina





1
1
3
2
1:2
3
3
1:4
3
4
1:8
3
5
1:16
3
Blanco
0
0
1
0
1
0
1
0
1
0
1
0
0
3
Calcule las concentraciones de PNP para cada tubo.
Determine porcentaje de Transmitancia.
Calcule Absorbacia.
Realice el gráfico de A en función de la concentración de PNP
Exprese la concentración en moles/L.
INFLUENCIA DE LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO SOBRE LA VELOCIDAD
DE UNA REACCIÓN ENZIMÁTICA.
Determinación de parámetros cinéticos: Km y Vm.
Reactivos:
a) Buffer de glicina 0.05 M pH = 10.4
b) Solución acuosa de fosfato disódico 0.5M
c) Solución acuosa de p-Nitrofenilfosfato (PNPP) 510-3M
d) Solución acuosa de ZnCl2 610-4M
e) Solución enzimática: Suero sanguíneo diluido 1:4 con buffer de glicina.
f) Solución patrón de PNP 0.310-4M. Debe tener la siguiente composición:
 Solución de PNP 0.310-4M……………….300 mL
 Solución de fosfato de sodio 0.5 M………..100 mL
Determinar:
 % Transmitancia (con ayuda del blanco de buffer de glicina).
 Calcular Absorbancia.
 Qué pasa cuando se adiciona fosfato disódico 0.5M a la reacción enzimática ?
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DETERMINACIÓN DEL TIPO DE INHIBICIÓN.
Reactivos:
a) Los mismos que para la determinación de Km y Vm.
b) Solución acuosa de Na2HPO4 0.510-2M.
Procedimiento:
Seguir el mismo procedimiento que se llevó a cabo en el numeral 2., hacer las
diluciones 1:2, 1:4, 1:8 y 1:16 (4.0 mL de c/u). Preparar 5.0 tubos numerados del 1 al 5
y un blanco, las siguientes mezclas:
Tubo
0.5 mL PNPP
Inhib.0.510-2M
Buffer
de
Glicina
Sln. ZnCl2
1
1
0.5
1.5
2
1:2
0.5
1.5
3
1:4
0.5
1.5
4
1:8
0.5
1.5
5
1:16
0.5
1.5
Blanco
0
0.5
2.0
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
Colocar los tubos a 37ºC por 5 minutos, luego adicionar 0.5 mL de la solución
enzimática, minuto a minuto, incubar 15 minutos a 37ºC, al final de los cuales se
detiene la reacción con Na2HPO4 0.510-2M (1mL para c/tubo). Leer absorbancia.
Resultados:
 Calcular para cada concentración de PNPP la velocidad de la reacción presentando
los resultados en forma de tabla.
 Graficar 1/Vo vs 1/So en la misma gráfica de (2).
 Calcule Ki, Km y Vm, “deducir” el tipo de inhibición.
Nota:
a) En todos los ensayos enzimáticos, es fundamental que el material de vidrio este limpio.
b) Donde se dice agua, debe usarse destilada y/o desionizada.
c) Todas las mediciones de volúmenes deben ser exactas.
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Profesor : Rafael Salamanca F.
DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD ESPECÍFICA DE FOSFATASA ALCALINA
Con base en las prácticas anteriores, deberá el estudiante diseñar y realizar la presente práctica y presentar un
informe escrito..
Sugerencias:
1. Nombre en su grupo de trabajo una persona que se encargue de coordinar el trabajo del mismo..
2. Haga un plan del trabajo a realizar, y elabore un cronograma de actividades y designe el o los
responsables de ejecutarlas. (Tenga en cuenta el tiempo de que dispone para esta actividad).
3. La primera de las actividades debe ser la consulta bibliográfica pertinente.
4. Dispone Usted de todos los reactivos y equipos con que cuenta el laboratorio. Si precisa realizar ensayos
preliminares, los puede hacer cuando desee: solicite las llaves del laboratorio al monitor.
5. Si tiene dificultades, acuda a su profesor.