Proteínas Fluorescentes
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Castroagudín, V.L. Proteínas Fluorescentes Verdes La Proteína Fluorescente Verde de Aequorea victoria (avGFP)a Historia La proteína fluorescente verde avGFP fue aislada de la medusa Aequorea victoria por Shimomura y su equipo en 1962. El investigador observó que una solución de avGFP se veía verdosa bajo la luz del sol, se tornaba amarillenta bajo una lampara de tungsteno, y fluorescía con luz verde brillante al ser irradiada con luz UV. Posteriormente, en 1971, este mismo grupo publicó el espectro de emisión de avGFP con su pico característico a 508 nm, notando que la bioluminiscencia verde del tejido vivo de la medusa también tenía un pico a esa longitud de onda. La aequorina, proteína de A. victoria a la que está asociada avGFP, emite luz azul (470 nm), a una longitud de onda cercana a la de excitación de avGFP. De ésto se postuló acertadamente que avGFP convertía la emisión azul de aequorina al brillo verde que presentan las células animales. En ese mismo año Morin y Husting descubren el mismo fenómeno en los celenterados Obelia (un hidroide) y Renilla, siendo los primeros en definir la “transferencia de energía radiativa”, como el mecanismo de excitación de avGFP in vivo. En 1974, se demostró que la aequorina podía transferir eficientemente su energía luminosa a su compañera cuando ambas proteínas estaban en contacto adsorbidas en un soporte catiónico. En 1878 se obtuvo la primera estimación, 27 kDa, para la masa de avGFP [1]. Un año después, por análisis de la proteína desnaturalizada, y de un fragmento proteolítico que conservaba propiedades de absorbancia características, se determinó que el cromóforo de avGFP es 4-hidroxibencilideno-imidazolina-5-ona, y que éste se encuentra unido al esqueleto peptídico a través de las posiciones 1- y 2- del anillo (ver Figura 2). Esto fue confirmado en 1996 por espectroscopía de masa (para mayor detalle ver referencia [2]). Aequorea y Renilla mostraron tener el mismo cromóforo, sin embargo la proteína de Renilla tiene un coeficiente de extinción superior, mayor estabilidad conformacional frente a cambios en el pH y tendencia a dimerizarse. Pero los avances cruciales en esta historia tuvieron lugar con el clonado del gen de avGFP, la confirmación en 1992 que su expresión en otros organismos creaba fluorescencia, y su síntesis in vitro en 1998 [3]. Comprobando así que el gen contenía toda la información necesaria para la síntesis postraduccional del fluoróforo, y que ninguna enzima específica de la medusa era requerida para ello. Las diferentes GFPs de distintos celenterados parecen ser compañeras de proteínas quimioluminiscentes (emisores primarios) y ejercer el control de la emisión de luz in vivo. Pero, aún no está aclarado (a) por qué estos organismos brillan; (b) por qué la emisión de luz verde es preferida a la luz de los emisores primarios; y (c) por qué la mayoría de estos animales marinos sintetizan una proteína separada en vez de mutar la proteína quimioluminiscente cambiando la longitud de su emisión. a Siguiendo las convenciones de la literatura, en esta monografía las proteínas fluorescentes se denominan de la siguiente manera: dos letras iniciales minúsculas refieren a la especie de la cual se extrajeron. Le sigue “FP” ( del inglés Fluorescent Protein). Por último un número final que indica la longitud máxima de emisión de fluorescencia en nm. La proteína fluorescente verde de A. victoria es conocida simplemente como avGFP. Los emisores primarios parecen contener cofactores externos (lumazinas, flavinas, peridinclorofila-a y otros cofactores tetrapirrólicos etc) como cromóforos, lo cual los descarta como sondas o marcadores biotecnológicos, (a pesar de ser altamente fluorescentes y atractivos pigmentos accesorios a larga longitud de onda). La correcta inserción de todos estos cofactores en otros organismos no se ha logrado aún. Estructura primaria y formación del fluoróforo -1- Castroagudín, V.L. Proteínas Fluorescentes Verdes La secuencia de 238 aminoácidos de avGFP [4] se presenta en la Figura 1. Se conocen varias mutantes, cuyas alteraciones influencian características específicas y algunas que han mejorado su expresión, pero no modificar el comportamiento general de la proteína. Figura 1, secuencia de avGFP salvaje. Los aminoácidos que forman el cromóforo se encuentran subrayados. MSE VAL ASP GLY LYS GLY VAL PHE HIS GLY LYS GLU ASN LYS LEU TYR ILE ILE HIS GLY LEU PRO LEU HIS SER VAL VAL GLU LEU LYS THR SER ASP TYR ASP VAL ARG GLU GLU ILE LYS GLU TYR PRO SER ASN GLU GLY LYS PRO ASN GLY THR LEU THR ARG PHE VAL ASP LYS ILE ASP TYR MSE VAL ASP GLN VAL THR GLU PHE MSE GLY ILE GLY GLU LEU PRO PHE TYR PHE GLN GLY PHE GLU GLY ASN ALA ASN GLY GLN LEU GLN LYS VAL ASP GLU LEU HIS GLY LYS VAL SER PRO LYS GLU ASN GLU LEU ASN TYR ASP PHE SER ASN LEU SER ARG THR GLU GLU VAL LYS ASP PHE PRO TYR ASP SER ARG TYR GLY LYS ILE ASN LYS LYS VAL THR PRO ALA ASP ALA LEU LEU GLU PHE ALA ILE TRP GLY HIS ALA THR LYS ASP GLY LEU SER GLN ILE GLN PRO ASP LEU HIS ALA TYR PHE LEU SER THR CYS PRO VAL MSE MSE ILE THR THR ILE GLY HIS LYS ARG LEU ILE ASN SER MSE GLY LYS THR ASP VAL TYR THR THR GLN LYS PRO PHE ARG LEU ASP HIS ASN ASN HIS ALA GLY HIS LYS VAL ILE GLY GLY SER GLY THR LEU CYS ARG GLU PHE ALA VAL PHE LYS VAL GLY ASN ASP ASP TYR ASP LEU THR Como se mencionó anteriormente el fluoróforo es 4-hidroxibencilideno-imidazolina-5-ona (ver Figura 2), formado por los residuos 65 al 67 (SerTyr-Gly en avGFP) y su síntesis ha sido aclarado. Primero, avGFP se pliega en su conformación nativa, luego se forma la imidazolina por ataque nucleofílico de la amida de la Gly 67 sobre el carbonilo del residuo 65 (ciclación), seguido por deshidratación. Finalmente, el oxígeno molecular sustrae el hidrógeno del enlace C-C de la Tyr 66, conjugando el anillo fenólico con el imidazólico. En ese momento el cromóforo adquiere absorbancia en el visible y capacidad de fluorescer. Este mecanismo esta basado en lo siguiente [5 - 7]. a) El oxígeno atmosférico es necesario para la maduración del crómoforo, es decir, para que éste fluoresca. b) La fluorescencia de avGFP aparece con una cinética exponencial simple, al tomar contacto con el aire. Dicha cinética no es afectada por la concentración de proteína o cofactores celulares. c) Los análogos de imidazolinas se auto-oxidan espontáneamente. d) La ciclación propuesta se asemeja a la ciclación isoestérica observada para enlaces Asn-Gly. Además Gly 67 es un residuo muy conservado en distintas GFP. e) La espectroscopía de masa, indica que la GFP preformada anaeróbicamente pierde solo 2 Da por exposición al aire, lo que es consistente con la pérdida de dos hidrógenos. Esto implica que la deshidratación (-18 Da) debe haber ocurrido anaeróbicamente, precediendo a la oxidación. f) La cinética de refolding proteico ha sido ampliamente caracterizada, a partir de cuerpos de inclusión sin cromóforos, proteínas desnaturalizadas con un cromóforo maduro y proteínas desnaturalizadas con el cromóforo reducido por ditionito. La -2- Castroagudín, V.L. Proteínas Fluorescentes Verdes renaturalización fue medida por la aparición de la fluorescencia y la resistencia a la digestión con tripsina, proporcionando las constantes cinéticas que se ven en la Figura 2. Figura 2. Mecanismo propuesto para la formación del crómoforo por Cubbit en.1995, [1]. -3- Castroagudín, V.L. Proteínas Fluorescentes Verdes Estudios cristalográficos: estructura secundaria y terciaria Aunque la avGFP fue cristalizada en 1974, su patrón de difracción no se reportó hasta 1988. La estructura fue resuelta en 1996 por dos grupo de investigación independientemente: el de Örmo (1EMA) y el de Yang (1GFL); ambas se resolvieron a 1.9 Å. Estructuras de otras mutantes han aparecido posteriormente [8]. La avGFP está compuesta por once cordones antiparelelos y una hélice . Los cordones forman un barril de 40 Å, atravesado por la hélice , (Figura 3) . El fluoróforo está sujeto a la hélice y sumergido en el centro del barril. Esta estructura, ha sido llamada -can (literalmente lata-). Un número sorprendente de grupos polares y moléculas de agua estructurada aparecen en el core, adyacentes al cromóforo (Figura 4). Casi la mayoría de la secuencia es utilizada en formar el barril y la hélice axial, por ello no hay lugares obvios donde puedan realizarse recesiones y reducir el tamaño de la proteína significativamente. Los residuos 1 y 230-238, están desordenados y no pudieron ser resueltos por difracción. Estas regiones corresponden a las máximas recesiones en ambos extremos que pueden hacerse conservando la función biológica (fluorescencia). Figura 3. Estructura de avGFP en la que se observan los once cordones en el barril y el cilindro hueco central atravesado por una hélice . El cromóforo (en gris – y en naranja en la figura inferior) se encuentra en el centro del barril. -4- Castroagudín, V.L. Proteínas Fluorescentes Verdes Figura 4. Cadenas laterales, carbonilos y amidas de la cadena peptídica, y moléculas de agua presentes en el microentorno del cromóforo. Probables puentes de hidrógenos se indican con línea de puntos, con la distancia marcada en Å Estructura cuaternaria: dimerización La forma del espectro de excitación de la avGFP salvaje depende de la concentración de proteica, implicando fenómenos de asociación. En 1996, Tang estableció que esta proteína forma dímeros con KD= 1 x 10-4 M. La interfase de dimerización incluye residuos hidrofóbicos (Leu 206, Leu 221 y Phe 223) e hidrofílicos (Tyr 39, Glu 142, Ans 144, Ser 147, Asn 149, Tyr 151, Arg 168, Asn 170, Glu 172, Tyr 200, Ser 202, Gln 204 y Ser 208). En la estructura determinada por difracción de Rx se observan dímeros dependientes del método de crecimiento del cristal. En cambio la GFP de Renilla es un dímero obligado que sólo se separa en condiciones desnaturalizantes. También se ha logrado cristalizar esta proteína monómero, reemplazando la Ser 65 por Thr. Clasificación de las GFPs En base a las propiedades espectrales del cromóforo las variantes de GFP pueden ser divididas en siete clases [1]: CLASE I. (Equilibrio fenol-fenolato). A este grupo pertenecen la avGFP, que presenta el espectro más complejo de todas las GFP. Posee un máximo de excitación a 395 nm y otro a 475 nm, siendo el primero tres veces mayor en amplitud que el segundo. A pH 7.0, la excitación a 395 nm origina una banda de emisión a 508 nm, mientras que excitando a 475 nm, se obtiene emisión a 503 nm. El hecho de que el máximo de emisión dependa de la excitación indica la existencia de dos formas del cromóforo, que no llegan al equilibrio en el tiempo de vida del estado excitado. A pH 10-11, cuando la proteína está cerca de desnaturalizarse, incrementos en la [HO-] aumentan la amplitud de la absorción a 475 nm a expensas del pico a 395 nm. La forma más simple de interpretar este fenómeno es pensar que el pico a 475 nm de debe a la absorción del fenolato. Mientras que el pico a 395 representa la absorción del fenol. A su vez la emisión a 503 nm podría deberse al fenol, mientras que el pico a 508 nm correspondería a la emisión del fenolato. Este último, además podría desprotonarse en el estado excitado, pues el pKa de los fenoles es menor en este estado. El mecanismo más probable a través del cual ocurre la transferencia de protones desde y hacia el fenol, es via puentes de hidrógeno entre de moléculas de agua y la Ser 205 al Glu 222. En la estructura cristalina del monómero de avGFP salvaje, la Thr 203 (capaz de rotar y estabilizar el oxianión) existe en dos conformaciones: 85% con el grupo OH alejado del oxígeno fenólico y 15% rotado hacia él. Esta proporción coincide con la estimación espectroscopica sobre la relación fenol/fenolato en el equilibrio [8]. La coexistencia de ambas especies de cromóforos que dan dos picos en el espectro de la proteína salvaje, tiene pocas ventajas y varias desventajas para su uso como herramienta molecular. Si la avGFP será detectada por el ojo desnudo, la excitación con UV es conveniente, pues el UV es invisible. Sin embargo, debido a que la iluminación intensa con UV puede dañar al ojo, un -5- Castroagudín, V.L. Proteínas Fluorescentes Verdes filtro externo debe ser empleado. También el scatering, autofluorescencia y la posibilidad de fotodegradaciónde los tejidos son más severos con excitación por UV. Por ello, la excitación a 470 nm reduciría estos problemas, pero ésta es ineficiente dado que sólo el 15% del cromóforo se presenta como anión. La fotoisomerización, el desplazamiento del equilibrio fenol/fenolato posterior a la excitación lumínica, es el mayor impedimento para la cuantificación de la fluorescencia en imágenes, aunque permite el monitoreo del tráfico y difusión de proteínas marcadas con avGFP, por irradiación local de una célula con un punto o franja de UV intensa y siguiendo luego por análisis de imágenes, la tasa de fotoisomerización. Este fenómeno de fotoisomerización es el responsable a su vez de la intermitencia de la fluorescencia en esta clase de proteínas, que puede llevar a importantes errores experimentales cuando la desaparición o la intensidad de la fluorescencia sea la señal esperada, (un profundo análisis del tema considerando aspectos estructurales, cinéticos, energéticos y termodinámicos puede hallarse en las referencias [9] a [13]). La avGFP se ha pliega correctamente a temperatura ambiente o debajo de ella (consideremos que los organismos en los cuales se encontró esta proteína, hasta ahora, ninguno es de aguas cálidas) es estable y fluoresce hasta los 65 ºC. Utilizando DNA shuffling se han obtenido mutantes que mejoran el plegado a 37ºC, temperatura de trabajo en la mayoría de los cultivos celulares, reduciendo la formación de agregados a altas concentraciones e incrementando la difusibilidad de la proteína. CLASE II (Cromóforo fenolato). Esta clase de avGFP es la más ampliamente utilizada; combina una alta fluorescencia con espectros de excitación y emisión simples. La mutación S65T, es la más común para causar la ionización del cromóforo, aunque también otros residuos alifáticos como Gly, Ala, Cys y Leu, tienen efectos similares. La triple mutante F64M, S65G, Q69L obtenida por mutagénesis al azar, es muy popular. En S65T avGFP el pico de excitación a 395 nm se suprime, dado que no existe el fenol, y el máximo 470-475 nm del anión se intensifica de cinco o seis veces en amplitud y se corre a 489-490 nm. La oxidación del fluoróforo maduro es cerca de cuatro veces más rápida que en la proteína salvaje. Es estable cuando se expresa temperatura ambiente, pero tiende a plegarse mal y producir agregados no fluorescentes a temperaturas mayores. La Ser 65 promueve la ionización del cromóforo porque en la estructura nativa sólo esta serina puede formar un puente de hidrógeno con la cadena de Glu 222 para permitir la ionización de ese carboxilato, el cual está 3.7 Å de distancia del cromóforo. Gly, Ala y Lys no pueden formar estos puentes, y Thr o Cys son demasiado grandes para adoptar la conformación correcta en el “super poblado” interior proteico. Los otros grupos polares que solvatan al fluoróforo son entonces suficientes para promover su ionización, mientras que si el Glu 222 es un anión, las repulsiones electrostáticas prohiben al fluoróforo convertirse en un anión también. Esta hipótesis explicaría por qué la mutación del Glu 222 a Gly da el mismo espectro que las mutantes en la Ser 65. A pesar de los beneficios de esta mutante, no se han detectado, en la bibliografía consultada, ejemplos de la aplicación de E222G. CLASE III (Fenol en el cromóforo). La ionización del cromóforo puede ser reprimida a través del cambio de la Thr 203 a Ile, suprimiéndose el pico de excitación a 475 nm, dejando solamente el de menor longitud de onda (399 nm). El cromóforo, presumiblemente, no puede solvatarse una vez que el OH de la Thr no está presente, por lo tanto queda neutro en la mayoría de las moléculas en estado basal. Sin embargo, la emisión se da a 511 nm porque ocurre desprotonación en este estado. -6- Castroagudín, V.L. Proteínas Fluorescentes Verdes En lo que respecta a la optimización en el proceso de plegamiento, estas mutantes poseen la ventaja de ser fotoquímicamente más simples. Al carecer del pico de excitación a 479-490 nm, pueden emplearse junto con las avGFP clase II para una doble marcación. Las longitudes de onda para su excitación, se ajustan a la mayoría de los equipos de microscopía de fluorescencia diseñados para indicadores racionales de excitación, pudiéndose eliminar cualquier problema en el registro de las imágenes causado por la alternancia de los filtros de emisión. Esta clase de avGFP posee además la mayor diferencia entre los máximos de excitación y emisión, este gran corrimiento de Stokes puede ser una ventaja para la utilización de láseres. CLASE IV (Fenolato en sistema electrónico apilado). Las mayores longitudes de onda de emisión son alcanzadas a través de mutaciones que apilen anillos aromáticos, que generalmente son de la cadena lateral del residuo 203, cerca del anión fenolato del cromóforo y del residuo 65. Todos los aminoácidos aromáticos –His, Trp, Phe y Tyr- en posición 203, incrementan la de excitación y emisión hasta 20 nm, en el orden mencionado. Estas mutantes, fueron diseñadas a partir de la estructura cristalina de S65T, con la expectativa de que una polarizabilidad adicional en la zona del cromóforo e interacciones -, redujeran la energía del estado excitado, y con ello, incrementaran tanto la de excitación, como la de emisión. El reemplazo de la Gln 69 por Lys, produjo un corrimiento extra de 1-2 nm, llevando la emisión a 529 nm, y donde a pesar de que esta longitud es de luz verdoso, la cola a mayor longitud de onda del espectro es suficiente para que la fluorescencia observada sea amarilla. Por ello las avGFPs clase IV se han llamado YFP ( Yellowish Fluorescent Protein- Proteínas Fluorescentes Amarillentas), nombre que también a sido aplicado a la proteína fluorescente de Vibrio fischeri, conocida en el mercado como Bio Yellow (Pharmeningen). Algunas de estas mutantes exhiben un decaimiento en el rendimiento cuántico con perdidas en la fluorescencia superiores al 90% y extraordinariamente cortos períodos de vida interpretados en términos de conversiones internas, producidos por movimientos de torsión en el cromóforo inducidos por la luz con que se los excita [14]. Para mas datos sobre la dinámica intramolecular de estas proteínas y la influencia de la misma en los ensayos experimentales, ver la referencia original [15]. CLASE V (Indol en el cromóforo). La sustitución Y66W, da lugar a un nuevo cromóforo con un anillo indólico es vez de uno fenólico. Las longitudes de emisión y excitación se corren a 436 y 476 nm respectivamente, intermedias entre las que hallamos cuando están presentes en el cromóforo un fenol neutro o un fenolato aniónico. Esta mutante requiere otros cambios para alcanzar un brillo adecuado. Las proteínas de esta clase se denominan Cyan Fluorescent Proteins, CFP, (Proteínas Fluorescentes color Cyan), dado el color azul-verdoso o cyan de su emisión. Una curiosidad de este grupo, es que los espectros de absorción y emisión presentan una curva con dos hombros, en vez de un pico definido, esto puede deberse a distintos estados vibracionales u otros estados cuánticos que se equilibran dentro del tiempo de vida del estado excitado. CLASE VI (Imidazol en el cromóforo). La mutación Y66H ubica un grupo imidazólico en el cromóforo, y corre la longitud de onda de excitación más aún que en los ejemplos de la Clase V. Los picos de excitación y emisión están respectivamente en 383 y 447 nm, por lo tanto la fluorescencia emitida es azul, (ver Figura 11). Se denomina a es este grupo es BFPs, Blue Fluorescent Proteíns (Proteínas Fluorescentes Azules). Varias estructuras de este grupo ya han sido resueltas. Son útiles para marcaciones dobles. -7- Castroagudín, V.L. Proteínas Fluorescentes Verdes A pesar de que mediante mutaciones se ha mejorado su velocidad de plegamiento, las BFP tienen bajo rendimiento cuántico y son muy fáciles de decolorar (fotobleaching). CLASE VII (Fenilo en el cromóforo). Las menores longitudes de onda de excitación de obtienen con una Phe en la posición 66. Esta mutante ha sido muy poco estudiada ya que por ahora no se ha propuesto un uso práctico para ensayos que requieran una proteína con longitud de excitación tan corta (360 nm). Sin embargo demuestran que cambios en el residuo 66 puede crean un cromóforo con una gran variedad propiedades. Relación entre la estructura y las propiedades ópticas La avGFP desnaturalizada tiene sus máximos de absorción a 384 nm, a pH ácido o neutro; y a 448 nm a pH alcalino, con un pKa de 8.1. Estos máximos de absorbancia y excitación, bastante similares a los de la proteína intacta, sirvieron como una de las primeras pruebas para postular la presencia de un cromóforo neutro y uno aniónico. La proteína fluorescente desnaturalizada o pequeños fragmentos de proteólisis conteniendo el cromóforo son no fluorescentes, presumiblemente porque el cromóforo está expuesto al quenching por choque con moléculas de agua, de oxígeno paramagnético o isomerización cis-trans [2]. La pequeña diferencia entre los máximos de absorbancia entre la proteína nativa y desnaturalizada obviamente se debe al ambiente estructurado de ésta última. En particular, a la Arg 96 que ubica una carga positiva muy cerca del grupo carbonilo de la imidazolina. Este catión estabilizaría electrostáticamente la intensa densidad electrónica del cromóforo en el estado excitado. Esta atracción electrostática explica el corrimiento hacia el rojo de la proteína intacta respecto a la desnaturalizada. Es más, se ha demostrado que cambiando la Arg 96 por Cys, en S65T, se produce un corrimiento hacia el azul en el máximo de excitación, 489 a 472 nm, y en el de emisión: de 511 a 503 nm. Efectos del ambiente sobre las propiedades de las GFPs Efecto del pH La proteína avGFP salvaje absorbe menos a altos pH (11-12), mientras que la fluorescencia se debilita a 395 nm y se intensifica a los 470 nm [11]. Tales valores de pH, nunca se hallan en sistemas vivos. La fluorescencia de la avGFP es también atenuada a pH ácido, con un pKa aparente de 4.5. Varias mutantes con propiedades espectrales mejoradas a pH 7, son más sensibles al pH que la proteína original siendo atenuadas en un 50% a pH 5.5. Han sido hallados en algunas especies de la Clase IV (donde la Thr 203 es reemplazada por un aminoácido arómatico) pKas tan altos como 6.8. Sería de esperar que al no estar presente el OH de la treonina el fenolato del cromóforo se destabilice. Sin embargo el efecto del ácido atenúa la fluorescencia totalmente, en vez de correrla hacia menores que corresponderían al cromóforo protonado. La sensibilidad de esta proteína a pH intermedios tienen ventajas y desventajas; ya que la fluorescencia no se desarrolla en organelas ácidas como lisosomas, endosomas o el aparato de Golgi. Esta sensibilidad puede ser utilizada como un indicador de pH intracelular, dirigiendo la proteína a los distintos compartimentos celulares. No obstante hay que introducir controles de calibración para descartar efectos inespecíficos. Efectos de la temperatura y la concentración proteica A altas concentraciones de proteína se amplifica el pico máximo de excitación a expensas del de 470 nm, porque la agregación impide la ionización. El aumento de la temperatura de 15 a 65 ºC decrece modestamente la excitación a 395 nm y la incrementa a 470 nm; mayores temperaturas causan desnaturalización, con pérdida del 50% de la -8- Castroagudín, V.L. Proteínas Fluorescentes Verdes fluorescencia a 78ºC. Como se mencionó anteriormente, incrementar la temperatura de 20 a 37 ºC afecta profundamente la maduración de avGFP salvaje. Efectos Post-Excitación Las GFPs tienen una admirable capacidad para sufrir transformaciones fotoquímicas, las cuales posibilitan la visualización o el transporte de proteínas fusionadas o marcadas con ellas. Una zona definida de una célula o tejido puede momentáneamente exponerse a una iluminación muy intensa y analizarse las reacciones fotoquímicas y las fotoconversiones posteriores a la iluminación, que sufren las proteínas mediante la toma de imágenes en el transcurso del tiempo. Como mínimo cuatro conversiones fotoquímicas fueron descriptas para una o más GFPs [1]: 1. Fotoblanqueamiento simple e irreversible. 2. Conversión del máximo de excitación de 395 a 475 nm. 3. Pérdida de la excitación a 488 nm, reversible por iluminación a 406 nm (ocurre en las BFP: el crómoforo es llevado a un estado excitado protonado (no fluorescente), con un máximo de excitación a 406 nm; posteriormente la excitación a ésta restablece la fluorescencia). 4. Generación de fluorescencia roja luego de iluminar a 488 nm en condiciones anaeróbicas. Resta mucha investigación para dilucidar este mecanismo, pero ha sido de gran utilidad para medir in vivo la capacidad de difundir de las avGFP en bacterias. Demanda de O2 La demanda de O2 para deshidrogenar el enlace - del residuo 66, implica que la proteína no puede volverse fluorescente en anaerobios obligados. Esto limita el rango de sistema en los que se puede expresar esta proteína. Una vez que se ha completado la maduración el O2 ya no se necesita. Por otro lado la oxidación es un paso lento, lo que no permitiría monitorear cambios rápidos en la expresión de genes. La dependencia con la pO 2 no ha sido caracterizada por ello, no se sabe si la pO2 atmosférica aceleraría la oxidación. La mutante S65T ha mostrado tener una constante de oxidación exponencial de 0.5 h, cuatro veces mayor que la de la proteína salvaje. Ensayos histológicos Los solventes ácidos así como el glutaraldehído y formaldehído utilizados para fijar cortes histológicos, causan la desnaturalización y pérdida de la fluorescencia de estas proteínas. Detección de las proteínas fluorescentes: factores a considerar En la presente sección del trabajo cabe mencionar algunos otros aspectos, en este caso no del ambiente, que pueden afectar a la proteína, no como tal, sino como reactivo en un experimento de biología molecular o celular. El nivel de expresión y de detección de las proteínas fluorescentes depende de muchos factores, los mas importantes son: La cantidad total de proteína 1. Numero de copias del gen y duración de la expresión 2. Fuerza transcripcional de los promotores y enhancers -9- Castroagudín, V.L. Proteínas Fluorescentes Verdes 3. Eficiencia de la traducción, incluyendo la secuencia de Kozak y el uso de codones 4. Ausencia de splicing en el mRNA, degradación de proteínas y exportación Eficiencia de la formación postraduccional del Fluoróforo 1. Solubilidad versus formación de cuerpos de inclusión 2. Disponibilidad de chaperonas 3. Mal plegamiento por fusión a proteínas del hospedador 4. Tiempo, temperatura, disponibilidad de O2 , velocidad intrínseca de ciclación/oxidación Propiedades moleculares de la proteína madura 1. Longitudes de onda de excitación y emisión 2. Coeficiente de extinción y rendimiento cuántico de la fluorescencia 3. Suceptibilidad a la fotoisomerisasión y fotobleaching 4. Dimerización Relación señal/ruido 1. Autofluorescencia de las células y medios de cultivo 2. Localización de la proteínas, difusión versus confinamiento a pequeñas regiones subcelulares o tisulares 3. Calidad de la excitación, filtros de emisión y espejos dicroicos 4. Sensibilidad, ruido y corriente oscura del fotodetector En vegetales ha sido imprescindible la modificación de codones para eliminar un sitio críptico de splicing, así mismo como para mejorar la expresión en mamíferos. También, para mamíferos, se agregó la secuencia de Kozac para iniciar la traducción. Se realizaron muchas mutaciones con el objetivo de mejorar y acelerar el plegado, la mayoría de ellas consisten en el reemplazo de residuos voluminosos por otros más pequeños (ver Figura 5). Para mejorar el proceso de plegamiento se pueden emplear chaperonas. Esto último llevó a la utilización de las proteínas fluorescentes a ser sustratos útiles para seguir el funcionamientos de las chaperonas mismas, proveyendo un sistema continuo y no destructivo para observar el plegamiento, pues sólo cuando sea exitoso, se verá fluorescencia. Figura 5. Mutaciones más importantes en la estructura de GFP que mejoran el plegamiento a 37ºC Örmo M, et al. Science 273: 1392-95. (1996) Aplicaciones de las Proteínas Fluorescentes - 10 - Castroagudín, V.L. Proteínas Fluorescentes Verdes Aplicaciones pasivas Las aplicaciones pasivas en investigaciones, especialmente en biología celular de las proteínas fluorescentes (PF), pueden dividirse entre los usos como marcador ( tag) o indicador (Reporter Gene, Cell Marker o Fusión Tag). El uso como marcador, el mayoritario a la fecha —sólo basta con colocar proteínas fluorescentes en un buscador en la WEB y observar los miles de publicaciones que las emplean en las más dispares disciplinas—, reflejan los niveles de expresión o la ubicación subcelular causada por los dominios marcados o por proteínas del hospedador que han sido fusionadas a una proteína fluorescente. Como indicador, la fluorescencia es también alterada postraduccionalmente por el ambiente químico o intreracción proteína-proteína. Al no ser esta proteína una enzima, su utilización es prometedora en embriones intactos y animales trangénicos, y el control de la transferencia de genes. Pero a causa de que la marcación carece de amplificación, la sensibilidad del método se limita no por el instrumento sino por la autofluorescencia de los tejidos. Para duplicar la fluorescencia del entorno y lograr un ensayo detectable Se necesita una cantidad de proteína fluorescente de 1M (105 copias en un volumen celular típico de 1-2 pL) de avGFP correctamente plegada de proteínas [1]. Por ello es tan intensa la búsqueda de mutantes altamente fluorescentes. Cuando se observan proteínas fluorescentes en un compartimento dado de la célula, se requiere menos concentración, ya que es muy grande el contraste con el resto de la célula no marcado. El uso más extendido de las PF es como proteínas marcadoras fusionadas a otra. En estos casos, se debe verificar que la fusión no afecte el plegamiento. Además, como ambos extremos terminales están muy próximos, se han hecho estudios para fusionar la proteína que se quiere estudiar en loops o dominios externos, no críticos para la fluorescencia. Proteínas fluorescentes como indicadores activos La coraza rígida con que protege la estructura terciaria al cromóforo, le permite fluorescer y lo protege del fotoblanquemiento, pero dificulta ser sensible al ambiente. Sin embargo Haups ha demostrado que un grupo hidroxilo de la Tyr 66 apunta hacia la superficie del barril y forma un puente de hidrógeno con una molécula de agua del solvente, una segunda molécula de agua en la superficie de la proteína ubicada a 4.16 Å de la anterior, podría comunicar por rearreglos dinámicos de alrededor de 1 Å al OH de la Tyr 66 el pH del seno del solvente [10]. Más ejemplos como este quedan por descifran para comprender como a pesar de su rígida estructura estas proteínas son tan buenos biosensores. Muchas mutantes que pueden ser indicadores de los cambios ambientales, se han logrado en los últimos años, no sólo alteradas para “medir” el pH, sino también con sitios de fosforilación, donde se incorporan fosfatos sólo en condiciones definidas. Otro ejemplo es una avGFP fusionada a la proteína Shaker del canal de potasio, que constituye el primer sensor óptico del potencial de membrana genéticamente codificado. Pero la manera más general de hacer un sensor bioquímico con una proteína fluorescente es explotar la capacidad de transferir la energía de resonancia de la fluorescencia (en inglés FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer), entre dos proteínas de diferente color. FRET es un fenómeno mecánico cuántico que ocurre cuando dos fluoróforos estas próximos (<100 Å de distancia) y el espectro de emisión de uno, el dador, se superpone con el de excitación del segundo, el aceptor. Bajo estas condiciones, la excitación del dador produce la emisión del receptor a expensas del pasaje de energía. Cualquier señal bioquímica que cambie la distancia entre los fluoróforos o su orientación de sus dipolos en el espacio, modulará la eficiencia de FRET. Los cambios en la emisión de la relación aceptor/dador, son ideales para obtener imágenes celulares y utilizar citometría de flujo, porque las dos emisiones pueden obtenerse simultáneamente y sus razones cancelan las variaciones dadas por la concentración de proteínas, grosor de la célula, fluorescencia de medio, haciendo absoluta la eficiencia de detección. Este mismo método ha sido empleado en el estudio de la dimerización de los - 11 - Castroagudín, V.L. Proteínas Fluorescentes Verdes factores de transcripción, fusionando BFP y GFP a cada uno de los factores, las proteínas fluorescentes serán capaces de dar FRET cuando las proteínas que las acompañen interactúen. Si unimos proteínas fluorescentes por un corto péptido que contenga la secuencia de restricción de una proteasa, los cambios en FRET pueden utilizarse para seguir el funcionamiento de esta enzima; pues FRET se interrumpirá cuando ambas proteínas sean separadas por proteólisis. Con avGFP se han fabricado los primeros indicadores dinámicamente sensibles; en 1997 dos grupos por separado, han unido dos proteínas fluorescentes, por un péptido de 26 aminoácidos conteniendo un dominio de unión a Ca++ de la calmodulina. Este espaciador daba lugar al desarrollo de FRET de BFP a GFP, porque es lo suficientemente largo y flexible para permitir que las proteínas se dimerizaran. Pero cuando unía Ca++, o sea cuando este estaba presente en el medio, cambiaba su conformación e interrumpía la FRET. Este sensor tiene innumerables aplicaciones en el estudio del tejido muscular y en neurobiología. Para ahondar en el tema consultar la referencia [16]. La técnica de FRET, en resumen, presenta las siguientes ventajas: Trabajar in vitro y con células vivas de mamíferos, no sólo levaduras. Responder dinámicamente a las modificaciones postraduccionales. Alta resolución temporal (milisegundos) y espacial (submicrones). La interacción con otras proteínas puede darse en cualquier lugar de la célula, no necesitan ser enviadas al núcleo. 5. El grado de disociación puede ser cuantificada, si el 0% y el 100% de unión pueden ser determinados in situ. 6. La eficiencia de FRET al 100% de complejación aporta información estructural. 1. 2. 3. 4. Y ciertas desventajas: 1. Deben expresarse proteínas de fusión, donde ambas partes deben permanecer funcionales. 2. Si las PFs están muy distantes unas de otras (a > 80 Aº) o mal orientadas, FRET fallará. 3. Incluso sin asociaciones, la superposición de espectros contribuye aporta algo de señal en los de FRET. 4. Se necesitan controles positivos y negativos. 5. La homodimerización es más difícil de monitorear que la heterodimerización. - 12 - Castroagudín, V.L. Proteínas Fluorescentes Verdes Una Nueva técnica: Sistema de Excitación por Dos Fotones Una de las técnicas nuevas más promisorias en microscopía de fluorescencia de alta resolución es la excitación por dos fotones. En esta técnica dos fotones infrarrojos golpean un fluoróforo con una diferencia de fentosegundos, y la suma de sus energías simula un solo fotón de longitudes de onda medio, o sea del UV al azul. Esta coincidencia requiere flujos extremadamente grandes y por ello ocurre solamente en un grado significativo en el foco de un microscopio de gran apertura numérica iluminado por un pulso de láser. Dado que otras regiones de la muestra, las que no están en los planos del foco, no son eficientemente excitadas, no emiten fluorescencia y no están sometidas a fotobleching o daños por la luz. Las avGFP salvaje, Clase V y Clase VI son buenos fluoróforos para esta técnica. La proteína salvaje presenta condiciones óptimas al ser vivamente excitadas con pulsos de 700 – 800 nm, los cuales son los rangos óptimos de funcionamiento de los láseres comerciales de titanio-zafiro. - 13 -