Aislamiento de órganos linfoides de ratón

EXTRACCIÓN DE SANGRE Y ÓRGANOS LINFOIDES DE RATÓN.
AISLAMIENTO DE LINFOCITOS.
1.- INTRODUCCIÓN
En inmunología humana es frecuente el empleo de animales de laboratorio para la
obtención de antisueros o complemento, para la generación de anticuerpos monoclonales o para la
producción de líquido ascítico a partir de hibridomas. En esta práctica se aprenderán las técnicas
básicas de manipulación de ratones que pueden tener utilidad en Inmunología. Se llevarán a cabo
técnicas de inyección subcutánea e intraperitoneal, extracción de sangre del plexo axilar y mediante
punción intracardiaca, extracción de órganos linfoides y aislamiento de células a partir de estos
tejidos sólidos.
Los ratones deben ser manipulados con cuidado pero con decisión para evitar estresar al
animal, lo que puede resultar en mordeduras o arañazos al experimentador y en daños innecesarios
al animal. Debe tenerse en cuenta que los ratones son más agresivos que las ratas y tenderán a
morder instintivamente.
2.- OBJETIVOS
Al finalizar la práctica el alumno será capaz de:
- Sujetar manualmente los ratones para ser correctamente inyectados, sin riesgo personal y sin dañar
al animal.
- Extraer sangre y preparar suero.
- Anestesiar ratones por inhalación
- Abrir el abdomen y extraer el bazo.
- Localizar y extraer ganglios linfáticos.
- Abrir el tórax y extraer el timo.
- Disgregar los tejidos para obtener células viables.
3.- EQUIPAMIENTO
- Ratones Swiss o similares adultos, no importa el sexo.
- Material de disección: Guantes, tijeras, bisturí, pinzas, jeringuillas y agujas para insulina.
- Vaso de precipitado de 1000 cc o recipiente de vidrio con tapa.
- Tubo de 50 ml con tapa.
- Tubos de poliestireno de 5ml y gradilla.
- Placas de cultivo de 24 pocillos.
- Pipetas de 5-50 µl y 200-1000 µl y puntas.
- Contenedor para material cortante.
4.- REACTIVOS
- Etanol 70%
- Eter dietílico anestésico
- Tampón PBS pH 7.2
- Suero fisiológico
5.- MÉTODO
A.- Inyección intraperitoneal.
1.- Cargar una jeringuilla con la suspensión a inyectar (en nuestro caso 2.5 ml de suero fisiológico)
expulsar las burbujas de aire y dejar preparada.
2.- Sacar al ratón de la jaula asiéndolo con una mano por la base del rabo y situarlo sobre la tapa
para que se agarre a las barras.
3.- Con los dedos pulgar e índice de la otra mano agarrar por la piel de la nuca.
4.- Situar el rabo por detrás del dedo meñique para inmovilizar al ratón con una sola mano.
5.- Lavar el abdomen con etanol y dejar secar.
6.- Colocar al ratón ligeramente cabeza abajo.
7.- Introducir la aguja en el cuadrante inferior izquierdo (o derecho) del abdomen a un lado de la
línea media.
8.- Inyectar con presión moderada.
B.- Inyección subcutánea.
1.- Cargar la jeringuilla con el líquido a inyectar (2.5 ml de suero fisiológico) y expulsar el aire.
2.- Situar al ratón sobre sus patas encima de un secante.
3.- Sujetar por la piel del área interescapular con los dedos índice y pulgar.
4.- Introducir la aguja bajo la piel entre los dedos.
5.- Inyectar con presión moderada.
C.- Anestesiado por inhalación.
1.- Colocar un trozo grande de algodón en un vaso de precipitado y empapar ligeramente con éter
dietílico (Evitar su inhalación directa. Muy inflamable). Tapar y dejar evaporar dos minutos.
2.- Preparar un tubo de 50 ml con un algodón humedecido en éter y guardar tapado. Servirá para
suplementar anestesia si se requiere más tarde.
3.- Introducir al animal en el recipiente y tapar.
4.- Cuando se observe que el animal se tiende y su respiración es lenta y regular, puede extraerse.
5.- Si se requiriera aplicar un suplemento anestésico durante las manipulaciones siguientes, puede
colocarse unos segundos en la cabeza del animal el tubo de 50 ml con el algodón humedecido en
éter.
D.- Extracción de sangre del plexo axilar.
1.- Anestesiar al ratón.
2.- Colocar al animal tumbado de espaldas sobre un secante y sujetar una pata.
3.- Con un bisturí cortar la piel de la zona del tórax cercana a la región axilar.
4.- Retirar ligeramente la piel con unas pinzas y con el bisturí cortar los vasos.
5.- Recoger la sangre con una pipeta y dispensarla en un tubo.
6.- Dejar coagular, centrifugar a 600xg 10 minutos, recoger el suero con una pipeta y transferir a
un tubo eppendorf.
E.- Extracción de sangre por punción intracardiaca.
1.- Anestesiar al ratón y preparar una jeringa con aguja de insulina.
2.- Colocar al animal tumbado de espaldas.
3.- Introducir la aguja debajo y ligeramente a la derecha del cartílago xifoides (izquierda del
animal) con una inclinación de 15-20 grados.
4.- Introducir despacio la aguja al tiempo que se extrae ligeramente el émbolo.
5.- La sangre entrará en la jeringuilla cuando la aguja penetre en el corazón. Aspirar lentamente
hasta que el flujo de sangre pare. Mover la aguja hacia delante o atrás para extraer la máxima
cantidad posible de sangre.
6.- Depositar la sangre en un tubo, quitando previamente la aguja para evitar hemólisis.
7.- Dejar coagular, centrifugar a 600xg 10 minutos, recoger el suero con un pipeta y transferir a
un tubo eppendorf.
F.- Extracción de órganos linfoides (bazo, timo y ganglios)
1.- Sacrificar al animal por dislocación cervical: Colocar un mango de bisturí detrás de las orejas,
cruzando la nuca, tirar del rabo hacia atrás con la otra mano mientras se presiona hacia abajo en
la nuca.
2.- Colocarlo de espaldas sobre un papel secante.
3.- Esterilizar con alcohol la zona de la línea media.
4.- Cortar por la línea media con tijeras.
5.- Retirara la piel con los dedos.
Bazo:
6.- Girar al animal para exponer su flanco izquierdo.
7.- Abrir el peritoneo con una incisión de 2-3 cm mediante unas tijeras.
8.- Localizar el bazo y extraerlo con unas pinzas, cortando el tejido conectivo.
9.- Colocar el bazo en un pocillo con 1 ml de PBS.
Ganglios:
10.- Diseccionar la región axilar y localizar algún ganglio linfático.
11.- Extraer, depositar en un pocillo y limpiar de tejido graso y conectivo. Añadir 1ml de PBS.
Timo:
12.- Tumbar al ratón de espaldas.
13.- Abrir el tórax mediante una incisión, con tijeras, desde el xifoides hasta el cuello.
14.- Abrir las costillas con las pinzas.
15.- Extraer el timo con las pinzas y colocado en un pocillo con 1ml de PBS.
G.- Disgregación de tejidos linfoides (bazo, ganglios, timo).
1.- Depositar las piezas en pocillos o placas de petri pequeñas en las que previamente se ha
añadido PBS estéril.
2.- Limpiar de tejido graso y conectivo.
3.- Pinchar repetidas veces con una aguja.
4.- Presionar suavemente con el émbolo de una jeringuilla.
5.- Aspirar el líquido que baña la pieza y depositarlo en un tubo.
6.- Reemplazar con PBS limpio y repetir los pasos 4 a 6 hasta que solo quede la cápsula.
7.- Cuando todo el líquido esté en el tubo, dejar sedimentar los trozos de tejido no disgregado y
transferir el líquido claro a un tubo limpio.
8.- Centrifugar a 400xg 5 minutos, decantar y añadir 1ml de medio de cultivo.