Células madre pluripotentes humanas

Células madre pluripotentes humanas.
Natalia López Moratalla. 2002. Rev. Med. De la U. de Navarra (en prensa).
1. Dinámica del desarrollo y maduración del organismo.
En los últimos años la biología celular y molecular del proceso de desarrollo embrionario y
maduración del organismo han alcanzado nuevos conceptos, que están permitiendo un avance
inesperado y rápido en las estrategias terapéuticas celulares. Suponen una visión dinámica de
la capacidad de autoorganización de un sistema complejo como es un ser vivo. En efecto, la
dinámica de la autoconstitución de los seres vivos, y de su funcionamiento unitario como
organismo, supone que la información genética se expresa, regulada y amplificada por las
interacciones con el medio intracelular y con las interacciones intercelulas; a su vez, en este
dinamismo, las condiciones del medio intra y extracelular cambian con el proceso mismo de
desarrollo y maduración. En la construcción, desarrollo y maduración de un organismo cada
una de sus células tiene información precisa, “sabe” a lo largo de la vida del viviente “quién
es”, la historia de dónde procede y a dónde se dirige. En unos pocos años hemos podido
conocer los mecanismos implicados en ese "saber celular” y con ello la posibilidad de poder
manipular células humanas, más o menos jóvenes o más o menos adultas, y cambiarles la
trayectoria para que sustituyan la función de células dañadas por la enfermedad.
Programación del desarrollo
El proceso vital de cada individuo tiene como punto de partida el patrimonio genético, los
cromosomas heredados de los progenitores. Un material biológico que tienen una peculiar
propiedad: poseer información genética. La información genética contenida en la secuencia de
nucleótidos del DNA condiciona el tipo de moléculas que pueden aparecer y con ello el
fenotipo celular y tipo de organismo. Ahora bien, en la dinámica del proceso vital cada gen
puede expresarse o no y, hacerlo o no, en un tiempo concreto y en un lugar concreto; incluso
algunos genes pueden procesarse de una forma o de otra, dependiendo del contexto celular, de
tal manera que la información contenida en el DNA no define necesariamente una sola
función. Esta compleja red de interacciones moleculares y celulares supone una ampliación de
la información genética con el proceso mismo de diferenciación celular, desarrollo
embrionario y maduración.
Podemos distinguir dos tipos o niveles de información genética. Un primer nivel es la
dotación informática de la célula en ella misma; la secuencia de nucleótidos del genoma
heredado de los progenitores es igual en todas las células del organismo aunque la expresión,
o represión, de cada gen, o grupos de genes, es autorregulada de forma diferente según el
estadio en que se encuentre la célula1. A su vez el estado del soporte material de la
información genética (el DNA) cambia en las diferentes células de las diversas líneas
celulares en el proceso espacio-temporal del desarrollo y maduración del organismo. Uno de
los cambios ocurre en la configuración y conformación espacial del DNA y el otro en el
número de bases (que ocupan un sitio concreto en la secuencia de DNA) que sufren
1
Cfr. entre otras revisiones: Beardsley T (1991) Genes inteligentes. Investigación y Ciencia, nº181, 7785; Grunstein M (1992) Las histonas, proteínas reguladores de genes. Investigación y Ciencia, diciembre
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Biología del desarrollo. Investigación y Ciencia 247, 34-36.
modificación química. La metilación y desmetilación reguladas de la base citosina da lugar al
establecimiento de patrones de metilación que son diferentes al inicio del desarrollo que a
medida que avanza; y es diferente de un tipo celular a otro según el sitio que han ido
ocupando y en un momento u otro del proceso2. Se da, de este modo, una retroalimentación de
la información; lo cual hace posible que, estando el código genético entero en todas y cada
una de las células de los tejidos y órganos, la información esté regulada espacial y
temporalmente de manera que las células en las diferentes líneas celulares se diferencian o
especializan, y forman los órganos y tejidos. El conocimiento de los mecanismos de esta
programación nos permiten abordar una “reprogramación artificial” de células inmaduras
(madre o progenitoras) hacia delante o “desprogramar” hacia atrás rejuveneciendo una célula
ya diferenciada. Y ambos procesos de manipulación pueden inducirse modificando la relación
entre los genes y los factores reguladores ( la relación nucleo-citoplasma de la célula) de su
expresión por un doble camino: cambio en el estado del genoma o cambio en las condiciones
del medio intracelular.
Irreversibilidad natural del programa de desarrollo de cada individuo
Un conjunto de células diferenciadas, y más o menos ordenado, no es un organismo ya que
no constituye una unidad funcional y vital. No basta el primer nivel de información (la
expresión de forma diferencial del mensaje genético contenido en cada una de las células)
para el desarrollo y maduración de un organismo. Requiere además la armonización unitaria,
y al mismo tiempo diferenciada, de la emisión de su mensaje genético. Es éste, por tanto, un
segundo nivel, o segundo tipo de información, que permite un programa de desarrollo: una
secuencia de mensajes ordenados en el tiempo y coordinados en el espacio orgánico. Este
segundo nivel de información, o programa de desarrollo, es el que permite entender por qué
cada ser vivo se va construyendo su propia vida, en diálogo molecular e interacción con su
medio, abierto, de modo individual, propio e irrepetible.
El conocimiento de la dinámica del desarrollo, de la maduración, del envejecimiento y de la
muerte programada nos permite intervenir en los procesos de reprogramación con un
conocimiento nítido de qué es una simple modificación de la genética y la diferenciación
celular y qué es por el contrario intervenir en el proceso mismo de producción de un nuevo
ser. Este conocimiento es imprescindible para abordar con rigor científico y ético la
prometedora área de las terapias de regenerativas con células madre. La expresión de
marcadores específicos de las primeras fases del programa de desarrollo permiten reconocer
con precisión si el conjunto celular que está creciendo, de forma armónica y unitaria, es un
individuo que inicia su vida o, se trata simplemente de un grupo de células vivas, que crecen y
se estructuran por interacciones entre ellas, con una apariencia que le asemeja a un embrión
de pocos días.
Reversibilidad accidental del programa de desarrollo en una célula
A su vez, va siendo conocido con mayor precisión cómo la determinación (o compromiso) y
la diferenciación celular depende de grupos de genes asociados, que controlan cada estadio
2
Cfr entre otros: Constancia M, Pickard B, Kelsey G, Reik W (1998) Imprinting mechanisms. Genome
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is crucial for early embryonic development. Mol. Cell. Biol. 21, 7601-7606.
particular. Genes que se expresan de forma integrada funcionalmente en grupos con diferente
nivel de jerarquía. De esta manera, la diferenciación de una célula hacia un estadio de alta
especialización se acompaña de una perdida de la capacidad de proliferación, a la vez que la
célula guarda memoria de su historia como parte de un organismo y su inherente carácter de
progenitora, o diferenciada, o a término. Ese equilibrado balance diferenciación/proliferación
se regula genéticamente, y cuando falla constituye la raíz misma de la aparición de un proceso
tumoral. Esto implica que las cascadas de expresión de genes que permiten y regulan los tres
procesos celulares clave para la vida de un organismo (control de la proliferación, control de
la apoptosis muerte celular programada y diferenciación) están estrechamente
interconectadas. Más aún, las tres cascadas de reacciones se pueden hacer reversibles en
algunos de sus nudos de conexión.
La existencia de genes interconectados con otro muchos en las redes, o que ocupan posiciones
clave en las cascadas de la jerarquía de expresión de grupos de genes, es un tercer aspecto
importante a tener en cuenta en relación con la intervención en el programa de obtención,
multiplicación y, diferenciación de células madre y su uso terapéutico potencial. La
combinación de las influencias del entorno y el cambio en los niveles de expresión de unos
pocos genes reguladores puede instar a células madre, más o menos comprometidas a un
linaje, hacia un rango mucho más amplio de potenciales de desarrollo. La combinación, por
tanto, de regulación génica y manipulación de las condiciones del medio puede permitir
inducir nuevas potencialidades a células madre y así aumentar, en el futuro, la todavía
incipiente eficacia de las terapias regenerativas con células madre. En este trabajo nos
proponemos analizar los mecanismos que dan la capacidad a las células madre de ser
pluripotentes.
2. Células madre embrionarias (ES) pluripotentes derivadas de embriones en fase
blastocisto. Células madre germinales fetales (EG).
Las células madre (o troncales) son células indiferenciadas con capacidad de proliferación
prolongada para dar células en el mismo estado de indiferenciación y potencial de formar
otros tipos diferenciados. En el embrión de pocos días existen células que tienen la capacidad
de dar origen a cualquier tipo celular embrionario o extra-embrionario3. Se denominan por
ello totipotentes, aunque en el embrión de dos células, tras la primera división del cigoto
ambas células contribuyen ya de modo específico al desarrollo posterior; una está
comprometida hacia los tejidos embrionarios (la que hereda la zona de entrada del espermio al
óvulo en la fecundación) dando lugar a la masa interna del blastocisto, y la otra a los tejidos
extraembrionarios a través de la conversión en trofoblasto4.
Las células de la masa celular interna (IMC) del blastocisto humano (embrión de 5-6 días)
tienen el potencial de contribuir a cualquier linaje pero no cualquier tipo, y por ello se les
denomina pluripotentes. Las células del trofoectodermo, por el contrario, sólo contribuyen a
3
Thomson JA, Odorico JS (2000) Human embryonic stem cell and embryonic germ cell lines. Trends in
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4
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dar la capa del trofoblasto de la placenta5. Antes de la anidación del embrión las células de la
masa celular interna se organizan en dos capas que darán origen al endodermo primitivo, al
endodermo extraembrionario, y al epiblasto (la capa de ectodermo primitivo) que dará origen
a los tejidos del embrión y a algunos tejidos extraembrionarios6. En el embrión en desarrollo
estas células son realmente sólo células progenitoras, o precursoras, es decir se multiplican
limitadamente antes de diferenciarse y contribuyen con ello a todos los tejidos adultos. Sin
embargo, cuando las células de la masa celular interna (MCI) se extraen del ambiente
embrionario natural y se cultivan in vitro, proliferan sin limitaciones al tiempo que mantienen
el potencial de generar células derivadas de cualquiera de los linajes del embrión. Las líneas
celulares pluripotentes (capaces de diferenciarse a las tres láminas embrionarias7, endodermo,
mesodermo y ectodermo, y la línea germinal8) derivadas in vitro de la MCI se denominan
células madre embrionarias (ES). Después de la anidación, cuando el embrión pasa al
estadio de gástrula, las células MCI se han ido diferenciando y comprometiéndose a linajes
específicos, de acuerdo con el tiempo transcurrido y el lugar que ocupan en el organismo
embrionario. Son células multipotentes.
Durante la etapa de gastrulación, un grupo de células procedentes del epiblasto forma las
células germinales primordiales, que emigran hasta las crestas genitales donde darán origen a
las gonadas y gametos9. Las células de ese grupo (primordiales germinales) también dan
origen a líneas celulares pluripotentes y, para distinguirlas de las ES, se denominan células
germinales embrionarias (EG). Tanto las ES como las EG se replican por un periodo de
tiempo prolongado, no muestran anormalidades cromosómicas, generan cultivos femininos
(XX) y masculinos (XY), expresan los marcadores típicos de células pluripotentes, y bajo
estímulos adecuados son capaces de diferenciarse en tipos celulares de cualquiera de las tres
capas germinales. Sin embargo no solo difieren en su tejido de origen sino que su
comportamiento in vitro es algo diferente. Las células aisladas del blastocisto (ES) son
capaces de proliferar
in vitro durante un periodo de dos años, lo que supone
aproximadamente entre 300 y 450 divisiones, mientras que las células fetales derivadas de la
capa germinal, proliferan durante un máximo de 80 divisiones. Además las células ES, son
capaces de inducir la formación de los tumores teratomas, cuando se inyectan en ratones
atímicos. Las ES difieren de las células llamadas del carcinoma embrionario (EC), presentes
también en el embrión temprano y que transferidas a animales se desarrollan in vivo para dar
teratomas tumorales10.
Ambos tipos celulares, ES y EG, se han obtenido de ratón, se han caracterizado y se han
usado como modelo para una serie de enfoques experimentales para el estudio del desarrollo
en mamíferos, análisis de la expresión y función de genes durante la diferenciación y
desarrollo, y en experimentos encaminados a la obtención de poblaciones celulares para
5
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9
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10
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6
diseño de terapias de transplante11. Más recientemente, se han obtenido células ES
embrionarias humanas a partir de blastocistos donados de clínicas de reproducción asistida12
(y también se han producido a partir de embriones producidos para ello fecundando in vitro
gametos de donantes fértiles13), y células troncales germinales, EG, a partir de células
germinales primordiales de fetos abortados14.
Células madre del blastocisto murino y humano
Del blastocisto murino se ha aislado otro tipo diferente de células madre, las del trofoblasto
(TS). Usan diferentes vías de señalización que las ES para mantener la proliferación de su
estadio indiferenciado, requieren diferentes factores de diferenciación específicos del estado
y contribuyen de forma también diferente al desarrollo de la quimera cuando se inyectan a
otro blastocisto. Sin embargo, las células ES pueden transformarse en cultivo en TS15
precisamente por cambio de la expresión del gen Oct4, que es un factor clave en la
determinación de la pluripotencialidad.
El gen Oct-4 es importante en el desarrollo temprano; es un factor de transcripción
relacionado con el mantenimiento de totipotencia en las células embrionarias y germinales 16 y
existe una estrecha relación entre la expresión del gen Oct-4 y el grado de indiferenciación de
las células. En embriones humanos, Oct-4 está presente en todos los estadios desde el oocito
no fecundado hasta blastocisto17; la expresión de Oct-4 en las células totipotentes de la masa
celular interna es muy superior a la detectada en las células diferenciadas del trofectodermo 18.
A medida que comienzan a aparecer tipos celulares diferenciados en el embrión, los niveles
de expresión descienden hasta no ser detectable y sólo continúa expresado en las células
germinales primordiales cuando migran hacia las crestas genitales. Este factor se expresa
únicamente en las células que darán origen a las células germinales primordiales y más
adelante, la proteína se observa solo en oocitos, y no en la línea germinal masculina destinada
11
Rathjen J, Rathjen PD, (2001) Mouse ES cells: experimental exploitation of pluripotent differentiation
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12
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14
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15
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a la producción de espermatozoides19. Oct-4 también está presente en células madre
embrionarias (ES) humanas20.
Así pues, la expresión de Oct-4 tiene relación con el mantenimiento de la totipotencia de las
células de los primeros estadios del desarrollo embrionario regulando la determinación
temprana del embrión preimplantatorio. Estos datos tienen una importancia capital en el tema
que nos ocupa: si los diferentes niveles de expresión de Oct-4 permiten predecir el desarrollo
hacia masa celular interna (niveles elevados de Oct-4) o hacia trofectodermo (niveles bajos de
Oct-4) en embriones humanos21, se puede identificar si un conjunto de blastómeros posee
organización embriogénica (es decir, son un embrión), o un simple amasijo de células. Los
embriones mutantes en Oct4 inicialmente se asemejan a un blastocisto pero no expresan los
marcadores de las células de la masa interna e in vitro sólo generan células del trofoblasto22;
por tanto, esto indica que Oct4 se requiere para el desarrollo de la masa interna del
blastocisto.
Mecanismos de diferenciación de las células ES y de las TS
In vivo, la presencia de células ES pluripotentes con capacidad de autorenovación es
transitoria; si las ES se agregan a un embrión de ocho células o a un blastocisto se genera una
quimera. Esto indica que las células ES son pluripotentes pero no totipotentes: a pesar de que
contribuyen a todos los tejidos fetales no participan en la formación del trofoectodermo ni al
endodermo primitivo23. Sin embargo, se obtienen líneas celulares inmortalizadas manteniendo
las propiedades de células madre por cultivo in vitro de las células de la masa interna del
blastocisto en presencia de la citoquina denominada factor inhibidor de leucemia (LIF)24;
estas células ES se mantienen de forma indefinida en presencia de LIF, y expresan marcadores
del estado indiferenciado pluripotente como el Oct4. En ausencia de LIF se reprime
rápidamente Oct4 y se pierde la capacidad de regeneración y diferenciación a múltiples tipos
celulares. La vía por la que actúa el LIF para promover la regeneración de las células ES es a
través de la formación de un heterodimero entre el receptor de citoquinas de tipo I con baja
afinidad por LIF y una subunidad común, la gp13025. Debido a que el homodimero de esta
19
Yeom YI, Fuhrmann G, Ovitt CE, Brehm A, Ohbo K, Gross M, Hubner K, Scholer HR (1996)
Germline regulatory element of Oct-4 specific for the totipotent cycle of embryonal cells. Development
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20
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21
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subunidad es suficiente para promover la proliferación de las ES26, se han podido establecer
las vías de señalización intracelulares que siguen a la gp130 en la regeneración de las ES:
a) gp130 JAK(quinasa)  STAT327
b) gp130 MAP quinasa ERK1 y ERK228
c) gp130 SHP2 RAS ERK29
la inhibición de esta última no bloquea la proliferación de las ES, como tampoco la presencia
de un inhibidor específico de las MAP quinasas. Así pues, en la embriogénesis, la
fosforilación de tirosinas del receptor del factor LIF es crítica para la diferenciación y
morfogénesis en la gastrulación; y el bloqueo de la activación de la MAP quinasa puede
bloquear la vía de diferenciación promovida por MAP quinasas e indirectamente el
mantenimiento de las células madre.
Las células TS sólo contribuyen a los linajes del trofoblasto de la placenta y por ello están
restringidas a la diferentiación de esta línea y son incapaces de producir, en las condiciones en
que se han estudiado, otros tipos celulares. No se conocen bien los factores clave en la
determinación hacia la línea trofoectodermo; hay varios factores de transcripción (tales como
bHLH del gen Mash230, el tipo caudal del gen Cdx231, y el T-box del gen Eomes32), cuyo
patrón de expresión en las primeras fases del desarrollo es inverso al Oct4: se expresan en el
embrión temprano y posteriormente quedan restringidos al trofoectodermo en el estado de
blastocisto; pero, la mutación de estos genes individualmente no impide la diferenciación del
trofoectodermo. Mash2 está implicado posteriormente en el desarrollo de la placenta33,
mientras que Cdx2 y Eomes se requieren al inicio34; ninguno de los tres solos es necesario
para la diferenciación inicial del trofoectodermo. Su proliferación requiere la activación de la
vía de las MAP quinasas tras la interacción del factor FGF con su receptor; esta interacción es
compleja y varía según el espacio y el tiempo. Un paso clave es la fosforilación del receptor
que acopla la proteína FRS-2 en la vía de señalización RFGF MAP quinasa35.
26
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La vía de señalización de los FGF es clave en el desarrollo del trofoblasto tanto in vivo como
in vitro. Los genes inducidos a través de esta vía parecen depender de dos factores de
transcripción: Cdx2 y Eomes. Y así, los componentes del medio de cultivo, que activan
diferentes vías de señalización, permiten aislar y mantener las dos diferentes poblaciones de
células madre del blastocisto murino: la activación de la vía JAK-STAT y la inhibición de la
vía promovida por la MAP quinasa inducen la propia regeneración la célula madre
pluripotente y expresa el factor regulador Oct4; por el contrario la activación de la vía de la
MAP kinasa por el receptor de FGF promueve la proliferación de la célula del linaje del
trofoblasto que expresa como factores de transcripción los Cdx2 y Eomes.
Curiosamente, aunque las ES y las TS proceden ambas del embrión temprano, no es fácil
interconvertirlas entre sí sin cambio de la expresión del Oct4. El cultivo de líneas celulares ES
en las que Oct4 está reprimido no permanecen como células ES, incluso en presencia de LIF,
sino que se diferencian para dar células semejantes a las gigantes del trofoblasto36. Y si las
condiciones de cultivo pasan de ser las propias de ES a las propias de TS, se reprime Oct4 y el
resultado es la aparición de células con propiedades de las TS. Es decir, la represión de Oct4
es necesaria para el desarrollo del trofoblasto in vitro, y probablemente in vivo, en el
blastocisto37. Las ES tienen la maquinaria para diferenciarse a trofoblasto y sólo necesitan la
inactivación de Oct4, y los factores de estimulación apropiados, para desarrollarse a diferentes
tipos celulares.
Aunque se supuso que los elementos que regulan la diferenciación del embrión de ratón están
plenamente conservados en los mamíferos, hay algunas diferencias en las ES de primates. Las
ES humanas son independientes de LIF y puede usarse FGF en el medio de cultivo en que
crecen38; son pues diferentes a las ES de ratón y tienen algo en común con las TS. Las células
ES humanas se pueden diferenciar a muchos tipos diferentes in vitro, que incluyen las del
trofoblasto, puesto que expresan el marcador de la placenta, hCG39. Ahora bien, en todos los
casos, la expresión jerarquizada de una cascada de factores de transcripción gobierna el
fenotipo celular que adquiere la célula.
Así pues, parece importante el concepto de que la apertura o el cierre de un gen clave puede
ser la llave para comprometer el desarrollo hacia diferentes linajes. Por tanto cambiando las
condiciones del medio de cultivo en que proliferan las células madre se produce un efecto
enorme en sus posibilidades de diferenciación. Por otra parte cuando una célula madre está
comprometida hacia un tipo de tejido tiene ya expresados los factores reguladores que
inactivan secuencias de genes y entonces las señales extracelulares solas no son suficientes
para reactivar otros linajes. Una vez conocido el regulador clave intrínseco (el Oct4 en el caso
de la determinación en el blastocisto de los dos tejidos diferenciados, la masa interna y el
trofoblasto) se podría manipular su expresión y así aumentar la potencialidad de plasticidad
celular.
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3. Control de la diferenciación de las células ES en cultivo in vitro
Un prerequisito para las terapias celulares que vayan a usar células madre
pluripotentes es conseguir su diferenciación controlada. Cuando las células ES se aíslan del
blatocisto humano y se cultivan en un estrato de fibroblastos de ratón irradiados, se
multiplican y confluyen hasta la formación de dos tipos de agregados según las condiciones
En un medio que permite el crecimiento de células neuronales, se forman ‘neuroesferas’
(agregados flotantes que contienen progenitores neuronales). Y en otras, las células de la masa
interna de blastocistos forman los llamados "cuerpos embrioides”; son agregados con
apariencia de “quistes”, con las tres capas germinales40 y en alguno de los cuales se observó la
presencia de cardiomiocitos contráctiles. Las células mantienen la telomerasa 41, por lo que se
replican de forma indefinida.
Se han conseguido líneas celulares a partir de las del embrión temprano que retienen
las propiedades de las de éste incluidas la capacidad de proliferar, generar teratomas in vivo, y
diferenciarse a células que derivan de las tres capas germinales42. Y a partir de las líneas
inmortalizadas de las células ES es posible generar linajes específicos de tejido 43. Los cuerpos
embrioides ofrecen a las células ES el nicho apropiado para su compromiso a dar los linajes
específicos de las tres capas embrionarias; células del tipo extraembrionario cooperan en la
determinación de los linajes44.
La amalgama celular “cuerpo embrioide” no es un embrión temprano
Aunque los “cuerpos embrioides” forman agregados de varias capas de células
diferenciadas45 , presentan una cierta organización tridimensional, y pueden dar origen a todos
los tejidos de un organismo, esta organización de células pluripotentes ES no es un embrión;
carece de información para generar el diseño corporal. Han perdido la memoria de la historia
previa y de los lugares que han ido ocupando en el proceso de desarrollo del embrión del que
proceden y no son capaces de dar lugar a la formación de los ejes del embrión temprano.
Uso potencial de las células ES y EG humanas
A partir de ES de ratón se han derivado múltiples tipos celulares, que incluyen neuronas,
células de la glía, células madre neuronales, células de los islotes pancreáticos, hepatocitos,
osteoblastos, y adipocitos46, etc. Con la adición de factores adecuados expresan genes
40
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restringidos de las células madre de las tres capas germinales47. Se ha planteado que las
células pluripotentes ES (y tal vez las EG) pueden ser de utilidad en el futuro para generar
tejidos de reemplazo48, puesto que las ES derivadas de blastocistos y las EG de las gonadas
de fetos humanos tienen propiedades similares49. Podrían servir para producir neuronas que
sustituyeran las destruidas en pacientes con enfermedades degenerativas o daño medular, o
para producir células de la sangre en pacientes con anemias, o productoras de insulina en
pacientes con diabetes juvenil.
Este tipo de terapia ya ha sido eficaz en ratones50 en experimentos en los que las células ES se
cultivaron en condiciones tales que se diferenciaron hacia células troncales de la glía; estas
células fueron transplantadas a ratones con una deficiencia genética en la función de la glía y
se curaron51; y también células madre neuronales derivadas de las ES fueron capaces de
dividirse y diferenciarse en neuronas funcionales cuando se inyectaron a ratones que tenían
dañado el sistema nervioso52. Se ha descrito además la corrección de la diabetes en ratón con
células productoras de insulina derivadas de ES53.
Ahora bien estos experimentos fueron posibles porque se usaron cepas de ratón que no
experimentan rechazos de injertos. Su aplicación potencial a seres humanos deberá resolver
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el 26 de abril de 2001,10,1126 la obtención de islotes pancreaticos funcionales, aunque con escasa
producción de insulina a partir de ES de ratón.
previamente el problema del rechazo del injerto para no mantener necesariamente al paciente
de por vida sometido a una inmunosupresión; las terapias inmunosupresoras tienen el peligro
de no poder hacer frente a infecciones o combatir posibles tumores en una situación de bajas
defensas del organismo. Se trabajan diferentes vías para manipular las células antes de su
posible transferencia, como eliminar los antígenos MHC extraños, o reemplazarlos54.
Las células madre que más se han investigado han sido las neuronas; los ensayos con ratas
han demostrado que si se insertan células pluripotenciales, tratadas previamente para que
produzcan niveles altos de dopamina, se consigue una reducción en los síntomas de dicha
lesión neurológica55. No obstante, la necesidad de aumentar el control de esos injertos para su
uso en humanos es patente tras la comprobación del escaso efecto beneficioso que han tenido
las células madre fetales inyectadas en el cerebro de pacientes con Parkinson y los graves
efectos negativos56. Dos problemas limitan actualmente la utilización de la EG fetales; uno es
la purificación de dichas células del feto abortado, que hace que existan otras células con gran
capacidad transformante y otro la supervivencia de las células derivadas (también de las
derivadas de las ES) productoras de la dopamina57.
Merece la pena considerar que, además del problema ético que supone destruir embriones
humanos, aunque sea para usarlos en las terapias de este tipo, los embriones congelados
almacenados en clínicas de reproducción asistida provienen de parejas con problemas de
fertilidad. Las causas de esta infertilidad pueden ser variadas, pero en algunos casos son
causas genéticas, que heredan los hijos. También se sabe que presentan, por efecto de la
misma manipulación de su fecundación, alteraciones y taras muy frecuentes. Por lo tanto,
cabe preguntarse no sólo si los conocimientos que han de obtenerse investigando con estos
embriones son de aplicación generalizada, sino que además, si llega a autorizarse el uso de
estos embriones para la obtención de células madre, queda por evaluar la posible presencia de
alteraciones hereditarias en el genoma de dichas células y las consecuencias derivadas de su
empleo.
Debe destacarse, además que las células ES, en su estado indiferenciado, si se inyectan
como parte de una terapia, o bien se incluyen como contaminantes de células previamente
sometidas a un proceso de diferenciación, pueden dar origen a teratocarcinomas in vivo. Por
ello será necesario garantizar la seguridad del procedimiento de transplante de células ES
diferenciadas y la identificación de cualquier posibilidad de incluir células ES no
diferenciadas.
Células madre derivadas de embriones clónicos
Otra propuesta para evitar el rechazo inmunológico que presentará el paciente hacia las
células, derivadas de las ES de un blatocisco ajeno, es usar la clonación (la llamada
54
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"clonación terapéutica”). Mediante transplante del núcleo de una células del paciente a un
óvulo humano, y el desarrollo a blastocisto se podría obtener células madre, para conseguir
así un linaje de células madre del embrión clonado compatible inmunológicamente con el
paciente de cuya célula se tomó el material genético nuclear58. Se plantea que la
transferencia de núcleos de células somáticas del mismo paciente evitar el inconveniente del
rechazo inmunológico.
No obstante, la técnica de transferencia de núcleos en mamíferos está aún en sus primeras
etapas y la eficacia es muy baja. Antes de realizar la transferencia de núcleos, es necesario
llevar las células a un estado aquiescente (la fase G0, o de parada del ciclo celular) para
conseguir la reprogramación genética del núcleo de una célula que ya estaba programada
como adulta59. Un primer experimento de transferencia de núcleos procedentes de
fibroblastos de la piel o de células del cumulus oophorus a oocitos humanos60 ha tenido una
eficiencia técnica muy baja y ninguna de las células mostró capacidad de desarrollo
embrionario. De hecho el resultado de la transferencia no fue la aparición de verdaderos
embriones precoces sino un simple conjunto de células resultado de divisiones celulares
degenerativas.
La baja tasa de éxitos logrados en animales con la transferencia de núcleo es el resultado de
pérdidas que se producen en todos los estadios de desarrollo61. La principal razón, tanto de
la baja eficiencia en el desarrollo temprano como de la presencia de anormalidades, es la
expresión alterada de una serie de genes por fallo del proceso de metilación del DNA 62. Las
modificaciones en el grado y patrón de metilación dan lugar a una incompleta
reprogramación del DNA del núcleo donante de forma que las células muestran incluso
inestabilidad en el control de la expresión de los genes. Esto significa que la transferencia de
un núcleo a un oocito y la estimulación de la célula (nuclóvulo) resultante no logra en
muchos casos alcanzar el fenotipo cigoto, capaz de iniciar un programa de desarrollo. Por
otra parte los individuos clónicos presentan modificaciones en uno de los sistemas del
control del tiempo de vida: la presencia de la enzima telomerasa, que mantiene sin recortar
58
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59
los telomeros de los cromosomas, “rejuvenece” las células y prolonga su capacidad de
multiplicarse en cultivo celular63.
Ambos factores, la dificultad de conseguir que un nuclóvulo se reprograme a cigoto, y dé
inicio al desarrollo de un blastocito, y la posible perdida del control de la proliferación de las
células del individuo clónico, suponen actualmente una falta seria de eficacia potencial de la
clonación terapéutica. Hoy por hoy, se precisaría la donación de cientos de óvulos para
garantizar la consecución de un experimento de transplante de células derivadas de un
embrión clónico del paciente64.
No obstante, la experimentación llevada a cabo con ratones sugiere que es posible de hecho
la obtención de células troncales embrionarias a partir de embriones obtenidos por las
técnicas de transferencia de núcleo, aunque esos embriones no hubieran alcanzado la
capacidad de desarrollarse. Ha sido posible obtener 35 líneas de células madre embrionarias
a partir de embriones producidos por transferencia de núcleos provenientes de células
adultas (fibroblastos y células del cumulus oophorus) de varias cepas de ratones. Las células
ES proliferaron en cultivo y se logró su diferenciación in vitro hacia una variedad de tejidos
derivados de las tres capas germinales; una de las líneas se pudo diferenciar hacia neuronas
dopaminérgicas65.
Células madre “humanizadas” de especies animales
Una alternativa a la obtención de células troncales humanas mediante obtención de un
embrión clónico es realizar la transferencia del núcleo de otras especies (por ejemplo,
cerdos) unida a la modificación genética de estos clones para que el hombre pueda aceptar
los tejidos de estos animales. Se sabe que la alpha-1,3-galactosiltransferasa es el
xenoantígeno principal que causa rechazo hiperagudo en el xenotransplante de cerdos a
humanos; y se realizan esfuerzos con el objeto de lograr una disfunción de este gen. Los
resultados sugieren que puede ser posible emplear esta estrategia66.
3. Reprogramación celular hacia el tipo ES
Células madre pluripotentes por clonación de células con dotación genética del paciente
Se ha descrito que la mayor parte de los embriones clónicos de raton el gen Oct4 (tiene
relación con el mantenimiento de la totipotencia de las células de los primeros estadios del
desarrollo embrionario regulando la determinación temprana del embrión preimplantatorio)
63
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se expresa erróneamente, bien respecto al tiempo, o bien respecto al sitio que ocupa la
célula, no permitiendo un desarrollo embrionario67 . Estos datos tienen gran importancia: la
expresión de Oct-4 determina si las células obtenidas por multiplicación de un nuclóvulo
produce un embrión clónico o un simple amasijo de células. La proteína codificada por el
gen Oct4 es un factor de diferenciación que dirige la expresión de los genes programando así
el establecimiento de la estructura celular del embrión preimplantatorio. Así pues una
controlada reprogramación “perfectamente errónea”, que no reprograme correctamente
Oct4, no transforma el ovonúcleo en cigoto y las células derivadas de su multiplicación no
constituyen un embrión. Cabe pensar por tanto en tomar las células del tipo ES de esa
organización celular que no es un embrión, clonarlas (multiplicarlas) y derivar de ellas
células para transplante. Se podrían obtener por tanto células madre del tipo embrionario
(mediante la transferencia de un núcleo de célula somática de un paciente a un óvulo) sin
que ello signifique clonar al paciente, ya que la reprogramación no se realiza hacia la
obtención de un embrión blastocisto clónico.
Células madre ES por reprogramación partenogenética de un óvulo
La activación química adecuada de un óvulo maduro da lugar a una multiplicación de esta
célula sin que expulse el segundo corpúsculo polar. Las células así obtenidas tienen la
información genética duplicada de sólo el pronúcleo materno. Aunque al conjunto celular
que se obtiene en forma de bola hueca se le ha denominado embrión partenogenético, en
realidad no es un verdadero embrión ya que carece de la contribución paterna. No obstante
se pueden desarrollar hasta estructuras del tipo blastocisto68 en los que se ha visto la
presencia de células tipo ES. En estudios realizados en ratones69 y en primates no humanos70
han conseguido células madre partir de dichos embriones partenogenéticos, lo que plantea la
posibilidad de que esta estrategia puede ser aplicable a los seres humanos.
De hecho se ha logrado activación partenogénica de oocitos humanos 71 con un pronúcleo
haploide o con duplicación del pronúcleo. Estos resultados abren posibilidades interesantes
de obtener células troncales sin producir un embrión, aunque deberá examinarse si las
células troncales que se derivan de este proceso tienen un potencial de desarrollo y
funcionalidad similar a las derivadas de embriones generados mediante fecundación o
transferencia de núcleo; es posible que surjan anormalidades en el desarrollo y
diferenciación de las células, por los efectos de la ausencia de la impronta de un genoma
paterno.
Reprogramación celular por factores del medio intracelular
Recientemente se han reprogramado células de adulto por transdiferenciación, sin acudir a la
clonación terapéutica, ni usar células madre embrionarias. Han convertido una célula de la
67
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Regenerative Medicine 2, 25-32.
piel en linfocitos T necesarios para tratar al paciente72. A los fibroblastos le hicieron una serie
de poros microscópicos en las membranas y los sumergieron durante una a dos horas en un
extracto de linfocitos T y después cerraron los poros con calcio. Proteínas de las células T
capaces de activar específicamente los genes de los linfocitos emigran a las células de la piel
y activan en ellas estos genes específicos, mientras que los propios de la piel quedan
inactivados. Así los fibroblastos expresan los receptores característicos de los linfocitos al
cabo de unas semanas. Este experimento muestra que no es necesario revertirlas al estado
embrionario sino que se transforman o transdiferencian. Esto hace pensar que tal vez su vida
media no sea tan larga como si se reprograman al estado embrionario, pero tampoco tendrán
el peligro de transformarse en células tumorales.
Reprogramación celular por incorporación de genes
Parece posible combinar el uso de las células madre con la terapia génica para corregir
defectos genéticos73. Se han utilizado ratones con una deficiencia en un gen importante para la
formación de varios tipos de células del sistema inmunitario. Empleando células somáticas de
los ratones se han producido clones y obtenido células troncales. Utilizaron a continuación
terapia génica para introducir una copia funcional del gen defectuoso en las células troncales,
además de un gen que inducía a las células troncales a transformarse en precursoras de células
inmunes. Estas últimas fueron capaces de restaurar parcialmente el sistema inmune dañado de
los ratones.
4. Células madre multipotenciales y pluripotentes del organismo adulto
En 199974 se demostró que las células madre no tienen que proceder necesariamente de
embriones para que sean capaces de diferenciarse y dar células especializadas. En efecto, en
los tejidos de organismos adultos también existen células madre, llamadas células madre de
adulto (células AS)75. Las células AS son responsables de mantener los tejidos en condiciones
fisiológicas y además de repararlos en caso de alteración o daño. Existe una amplia evidencia
de la presencia de células madre en los tejidos de animales y humanos; hasta la fecha se
conoce su presencia en médula ósea, sangre periférica, sangre del cordón umbilical, cerebro,
médula espinal, pulpa dentaria, vasos sanguíneos, músculo esquelético, epitelio de la piel y
tejido conjuntivo, córnea, retina, hígado y los conductos del páncreas; por tanto en tejidos que
derivan de las tres capas germinales. La definición de estas células AS incluye, como en el
caso de las ES o EG, la capacidad de autorenovación, unida a la capacidad de generar varios
tipos de progenie diferenciada76.
Hasta hace pocos años, estas células troncales se consideraban específicas de tejido, es decir,
capaces de generar solo los tipos de células presentes en el tejido en el que residían, pero
estudios recientes demuestran una plasticidad inesperada de las células adultas, con la
72
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capacidad de generar tipos celulares adicionales. Sustituido su entorno natural por otro,
ejecutan el programa de diferenciación intrínseco de la célula de acuerdo con las nuevas
señales de diferenciación que recibe. Así el paradigma de que las células madre de adulto
tienen restringida su potencialidad ha cedido ya ante la evidencia creciente de que células
AS contribuyen a otros tipos celulares cuando están expuestas a las influencias del entorno
apropiadas77. En algunos casos, parece que algunas células troncales de adultos tienen mayor
potencial de diferenciación que algunas células troncales embrionarias. Esto podría deberse a
que a medida que el organismo crece y madura existe una disminución en la necesidad de
restringir el potencial de diferenciación. Como hemos señalado, durante el desarrollo
temprano, las células que residen en estrecha proximidad (antes de alcanzar el estadio de
blastocisto) se ven expuestas a grupos superpuestos de señales extracelulares. Esto requiere el
uso de mecanismos autónomos de la célula (niveles de expresión del gen Oct 4, en este caso)
para restringir el potencial de seguir determinados destinos. Pero a medida que el organismo
crece, y especialmente en adultos, las células troncales en diferentes tejidos pueden estar
espacialmente aisladas en nichos donde no están expuestas a señales inductivas presentes en
otros tejidos. Por ejemplo, se ha descrito un extraño cambio de la dirección de diferenciación:
el compromiso hematopoyético de células madre neurales dependiente de las condiciones78.
Dado que el mantenimiento de la restricción del potencial de desarrollo es un proceso
activo79, es posible que esa restricción se elimine a medida que el organismo crece ya que, por
razones espaciales, las células troncales no encontrarán señales que inducen diferenciación
hacia otros linajes80.
Algunos trabajos recientes han mostrado que en algunos casos en el cultivo de diferenciación
de células madre de adulto ocurre una fusión espontánea entre estas células y el lecho de
células ES sobre el que crecen81; estos datos plantean la duda de que alguna de las
trandiferenciaciones se deba a este fenómeno más que a una verdadera plasticidad intrínseca
de las células madre; las células híbridas expresan marcadores específicos de células
embrionarias y el factor de transcripción Oct4 específico de células pluripotentes. En todo
caso estos experimentos avalan los ya descritos acerca de que la hibridación por electrofusión
de una célula ES con un timocito da lugar a una reprogramación a una célula rejuvenecida y
con características de célula madre embrionaria82. Una alternativa a los problemas que
77
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presentan la aplicación de las células ES a la terapia humana sería precisamente la posibilidad
de inducir la expresión del gen Oct4 en células de adulto rejuveneciéndolas a células madre
pluripotentes.
Uso de células madre de adulto en terapia celular
Los hallazgos relacionados con la plasticidad en el desarrollo de las células troncales adultas
plantea con claridad que su existencia puede reemplazar el uso de células ES, y no sólo
porque sean de suyo autólogas y no produzcan rechazo:
a) A una célula AS se le puede, de hecho, reprogramar para que su diferenciación se dirija
hacia otros tipos celulares y salte, o se transdiferencie, a células de capas embrionarias
diversas. Así por ejemplo células AS de médula ósea pueden dar origen a músculo83 o a
células hepáticas84, y células musculares que pueden regenerar el sistema
hematopoyético85. Y muy recientemente se ha conseguido transformar células madre
hepáticas de ratón en células pancreáticas productoras de insulina86. Se han publicado
numerosas revisiones87 de la presencia y diferenciación hacia otros tipos celulares de las
AS.
b) Más aún, se ha identificado una célula madre en la médula ósea que es pluripotente y por
tanto equivalente a una célula ES en cuanto a potencialidad. Tras un extenso crecimiento
in vitro, algunas células de la médula ósea humana pueden dar lugar a líneas de diferentes
tejidos88. Las células mesenquimales CD34 negativas, similares a fibroblastos, han
podido aislarse de la medula ósea y de la sangre periférica, y datos preliminares muestran
que pueden obtenerse de forma muy eficiente de la sangre del cordón umbilical89. Son
también capaces de generar las específicas de otros tejidos tales como endotelio y
83
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cardiomiocitos90; pueden usarse en terapia génica91 y en la reconstrucción de miembros92.
Un primer ensayo clínico se ha efectuado usando las células madre del mesénquima de la
médula ósea para el tratamiento de niños con una osteogénesis imperfecta93.
c) Además, las células madre procedentes de la médula ósea y que están en circulación
tienen la misma plasticidad que las de la médula ósea94. Se ha podido demostrar en ratón
que la inyección de células madre hematopoyeticas (definidas funcionalmente por su
capacidad de repoblar la medula ósea después de un transplante) produjeron células de la
sangre, de los conductos biliares, pulmón, del tracto intestinal y piel95.
Se ha demostrado que las células troncales de la medula ósea de adulto pueden inyectarse
en sangre y de allí emigran al cerebro, se incorporan al tejido cerebral y se diferencian a
neuronas con expresión de proteínas propias de estas células; esta enorme plasticidad supone
un potencial de aplicaciones clínicas como fuente alternativa de neuronas para pacientes con
enfermedad neurodegenerativa del sistema nervioso96 . Las células madre de tejidos adultos
pueden inyectarse en distintos órganos, como corazón, músculos, hígado, pulmón o intestino,
transformándose in situ en células de esos tejidos. Así se ha comprobado97que células madre
de médula ósea no sólo se pueden transformar en células hepáticas, sino que en experimentos
realizadas en ratones98 pueden transformarse en células hepáticas, que en principio podrían ser
útiles para tratamiento de enfermedades hepáticas degenerativas. También se ha conseguido
regenerar células cardiacas en el miocardio lesionado de ratones trasplantándoles células
madre de médula ósea99; inyectadas directamente al corazón, o sencillamente a la circulación,
no sólo se convierten en músculo cardiaco sino que se integran lentamente y llegan a ser
indistinguibles y funcionales. Posteriormente se ha mostrado que las células estaminales
adultas de la médula ósea son eficaces en transplantes de corazón ( incluso entre especies
diferentes ya que no provocan rechazo), y una vez inyectadas parecen ir directamente a las
90
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áreas dañadas y se convierten en tejido muscular del corazón, vasos sanguíneos y tejidos
fibrosos100.
d) puede existir una regulación negativa activa de la diferenciación de tejidos hacia linajes no
deseados
Esta inesperada plasticidad de las células humanas después del transplante abre nuevas
perspectivas a la terapia con células madre de adulto. Si bien se pensó que el aislamiento y el
cultivo de células madre de tejidos adultos tendrían serias limitaciones técnicas en el ser
humano (con excepción de las células troncales cutáneas, de la grasa y mesenquimales), y
que el uso terapéutico estaría ligado estrechamente a la posibilidad práctica de multiplicarlas
in vitro en un modo eficiente, los trabajos citados muestran que tales dificultades son
superables; y sobre todo que, al menos de momento, ninguno de los experimentos de
transplante han producido tumores en el organismo receptor, a diferencia de las células ES.
Rejuvenecimiento de las células de adulto in vivo
Quizá el futuro se dirija más directamente hacia la restauración directa de las células en el
organismo. Varios trabajos se han encaminado a restaurar zonas del cerebro, haciendo
proliferar y diferenciarse in situ las células madre neurales. La simple adición de un factor de
crecimiento las estimula101; de esta forma los investigadores esperan aportar los componentes
colinérgicos de las neuronas perdidas en los enfermos de Alzheimer. La infusión del factor
denominado factor de crecimiento transformante (alfa-TGF) a ratas con la enfermedad similar
a Parkinson induce una proliferación rápida de células madre neurales, seguida de su
migración y diferenciación a neuronas, y las ratas tratadas mostraron un descenso de los
síntomas102.
Otro hallazgo de gran interés es el hecho de que un transplante “anima” a que crezcan y se
diferencien nuevas células a partir de las células madre del organismo receptor. En contra del
paradigma imperante de que el corazón no puede ser reparado, se han encontrado nuevas
células desarrolladas tras el transplante103. Una respuesta regeneradora que nose esperaba.
En resumen, podemos afirmar104que las células madre de adulto son autoregenerativas,
pluripotentes y capaces de repoblar los tejidos en que residen y tienen capacidad después del
transplante de injertarse en tejidos de diferente origen. Las células de la médula ósea se
diferencian a múltiples líneas; las condiciones de cultivo y moléculas inductoras pueden
alterar el comportamiento de las células estromales de la médula ósea y el microambiente es
100
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crítico para alcanzar propiedades in vivo. Las células “reparadoras” localizadas en la médula
ósea, extraídas de un donante (o del propio paciente) pueden trasladarse al flujo sanguíneo y
ayudar a regenerar cualquier tejido. El mantenimiento de las propiedades de células madre y
la posibilidad de reprogramación y compromiso es esencial para su uso en medicina
regenerativa.