Protocolo Prácticas Cultivos Celulares Curso 0809

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Protocolo Prácticas Cultivos Celulares Curso 0809
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Condiciones Generales de Cultivo
Fibroblastos de hámster chino (AA8)
Las células se cultivan en frascos de plástico de fondo plano (NUNC). Se
mantienen cubiertas con el volumen de medio adecuado para una óptima difusión de
gases (5 ml para frascos pequeños y 10 ml para frascos medianos) y se dejan crecer en
un incubador a 37ºC con una atmósfera de CO2 del 5%.
El medio de cultivo es McCoy 5A suplementado con suero fetal bovino al 10%,
L-glutamina 2mM, y los antibióticos penicilina (50U/ml) y estreptomicina (50µg/ml).
Curva de Crecimiento
Tripsinizar frasco mediano confluente:
 Poner tripsina y medio a 37˚C en baño
 Tirar medio.
 Añadir 3 ml de tripsina , agitar brevemente y tirar.
 Añadir 5 ml de tripsina e incubar 5 minutos a 37˚C en estufa.
 Observar al microscopio invertido y comprobar que las células se han
despegado. También se comprueba mirando al trasluz.
 Añadir 10 ml de medio completo para neutralizar.
Recuento de células en hemocitómetro:
 Mezclar bien la suspensión celular
 Poner con micropipeta una gota de suspensión en hemocitómetro
 Contar al microscopio óptico : contar las células de cada 3 cuadrados (al
azar) grandes (que a su vez están divididos en 9 cuadrados pequeños),
obtener la media (M) ; calcular la concentración celular : nº células /ml =
M x 104.
 Calcular volumen adecuado para sembrar en cada placa de 5 ml 50.000
células; sembrar 4 placas (por pareja).
Tripsinizar placas para el recuento:
 Con 3 ml de tripsina y sin neutralizar con medio; agitar muy bien con
pipeta.
 Cargar hemocitómetro y contar todos los cuadrados grandes; hacer la
media y calcular el nº total de células de la placa.
Ensayo del Azul Tripan
Preparación del colorante:
Azul tripán 0,4% (peso/volumen) en PBS
Realización del ensayo:
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Mezclar 0,2 ml de suspensión celular con 0.2 ml de azul tripán.
Poner una gota de la mezcla en hemocitómetro .
Contar 100 células teñidas y no teñidas (empezar contando todas las
células de un cuadrado grande, si no se llega a 100 células contar otro
completo).
Calcular el porcentaje de viabilidad.
Congelación y Descongelación de Células
Congelación:
 Tripsinizar un frasco pequeño confluente con 3 ml de tripsina y 6 ml de
medio para neutralizar.
 Centrifugar 10 minutos a 1000 rpm.
 Preparar medio de congelación: medio completo con 10% de DMSO.
* Anotar los volúmenes necesarios para preparar 10 ml de medio de congelación (para todo el
grupo).
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Resuspender el pellet en 500 μl de medio de congelación y poner la suspensión
en vial de congelación (con capacidad para 0,5 ml).
Colocar el vial en contenedor con 2-propanol.
Congelar a -80˚ C 3h como mínimo.
Congelar en nitrógeno líquido (protocolo adecuado para congelar a largo plazo;
no se realizará en la práctica).
Descongelación:
 Sacar el vial de células del congelador y descongelarlo a temperatura
ambiente o a 37˚ C en el baño.
 Poner la suspensión celular (0,5 ml) en un frasco pequeño con 5 ml de
medio.
 Dejar 2 h en incubador para que se peguen las células vivas y cambiar el
medio para eliminar las muertas.
Obtención del Cariotipo en AA8
Obtención de metafases y fijación:
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Añadir colcemida a una concentración final de 0,4 g/ml durante las 2,5 últimas
horas de cultivo.
*Calcula el volumen que se debe añadir al frasco de cultivo si la concentración de la solución
stock de colcemida es 10g / ml.
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Recoger las células mediante agitación en tubos de centrífuga de 10 ml.
Centrifugar durante 6 min. a 900 rpm y decantar el sobrenadante. Resuspender
las células.
Tratamiento con solución hipotónica precalentada a 37˚C de KCl 0,075 M . El
hipotónico se añade gota a gota y resuspendiendo con suavidad para evitar la
disgregación de las placas metafásicas). Incubar durante 2 min. a 37 ºC.
Centrifugar 6 min a 800 rpm y tirar el sobrenadante.
Resuspender las células en solución fijadora de Carnoy (metanol 3:1 ácido
acético) recién preparada añadiendo el fijador gota a gota.
Centrifugar y repetir la fijación.
* Calcular los volúmenes necesarios para preparar:
- 200 ml de KCl 0,075 M a partir de una solución stock 1M.
- 200 ml de fijador.
Obtención de las preparaciones:
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Depositar una o dos gotas de la suspensión celular con pipeta Pasteur sobre un
porta (humedecido) para facilitar la expansión
Observar al microscopio para controlar la densidad .
Dejar secar las preparaciones sobre una placa calefactora a 37ºC durante al
menos 30 minutos antes de proceder a la tinción.
Tinción con Giemsa :
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Preparar una solución Giemsa al 3% en tampón Sörensen.
Sumergir las preparaciones durante 5 minutos en el colorante .
Enjuagar con agua y dejar secar.
Montaje con DPX:
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Realizar dos inmersiones de las preparaciones, secas y teñidas, en xilol, de 3 a 5
minutos cada una.
Colocar una gota de DPX en un cubre y poner la preparación sobre él, de manera
que quede pegado.
Eliminar las burbujas presionando con la punta de un lápiz.
Obtención de Binucleadas y Tratamiento con Rayos X
Irradiar uno de los frascos con 1 Gy o 2 Gy de rayos X. El otro servirá de control.
Tratamiento con Cyt B
Añadir a los frascos (control y tratamiento) Cyt B a una concentración final de 3 µg/ml.
* La concentración de la solución stock de Cyt B es 2 mg/ml (preparada en DMSO).
- Preparar 1 ml de solución 0,3 mg/ml en PBS.
- Calcular el volumen de la misma que hay que añadir a los frascos para obtener la
concentración final adecuada.
Obtención de las binucleadas
Tras el tratamiento con citocalasina, tripsinizar para recoger las binucleadas.
Tripsinización:
Poner el medio de cada frasco en tubos de centrífuga. Añadir 3 ml de tripsina a
los frascos, remover y tirar; añadir 2.5 ml de tripsina e incubar a 37º C durante 5 min;
neutralizar con el medio anterior (5 ml de los tubos centrífuga). Centrifugar a 800 rpm
durante 6 min y retirar el sobrenadante.
Fijación:
Las células serán fijadas (igual que para recoger metafases), pero sin añadir
antes el tratamiento hipotónico. Hacer la primera preparación del control y observar al
microscopio; si el citoplasma no se preserva bien, añadir una gota de metanol puro a la
suspensión de células. Realizar 2 preparaciones del control y 2 del tratamiento
comprobando al microscopio que se mantienen los citoplasmas.
Cuestiones
1. Realización de la gráfica de la curva de crecimiento (práctica nº 1).
 Anotar el nº total de células obtenido cada día en las placas.
Placa 1
Placa 2
Placa 3
Placa 4
nº células
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Representación gráfica: realizar una gráfica (usando papel milimetrado)
con número de células (eje Y) frente a días de cultivo (eje X).
Calcular a partir de la curva de crecimiento el tiempo necesario para
duplicar el número de células (PDT).
2. Calcular el porcentaje de viabilidad a partir del ensayo del azul tripán
(práctica nº 2).
3. Observación y recuento de MN en preparaciones de binucleadas
(preparaciones control y tratadas con rayos X, práctica nº 5)

Observación:
o Enfocar con el objetivo de 10 y después con el de 40.
o Colocar entonces 1 gota de aceite de inmersión , colocar el objetivo
de 100 y enfocar. No pasar el objetivo de 40 por el aceite.
o Observar la forma de las células, núcleo y citoplasma.
o Distinguir células mononucleadas y células binucleadas (BN).
o Buscar células que presenten micronúcleos (MN): se ven como un
núcleo pequeño y del mismo color o más claro que el núcleo o los
núcleos principales EN EL CITOPLASMA.

Contar los MN en unas 500 binucleadas para el control y para el
tratamiento. Anota el número de células binucleadas contadas en cada
caso, el nº de MN y calcula en el ‰ de MN.
nº BN
analizadas
nº MN
‰ MN
Control
Tratamiento
o Para realizar estas preparaciones, ¿hará falta añadir colcemida
a los cultivos? ¿habrá que recoger las células mediante
agitación? Explica por qué.
4. Preparación del cariotipo de AA8 (práctica nº 4)
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Observar la morfología de los cromosomas, y ver cómo son en
función de la posición del centrómero.
Contar y anotar el número de cromosomas de 10 metafases. ¿Hay
metafases con distinto número de cromosomas? Explica por qué.
5. Preparación de metafases obtenida a partir de un cultivo tratado con
compuestos químicos.
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Tratamiento con inhibidor de topoisomerasa. Observar metafases
normales y endorreduplicadas. En estas últimas cada cromosoma es
un diplocromosoma formado por 4 cromátidas.
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Tratamiento con agente clastogénico. Observar metafases con
cromosomas que presenten aberraciones cromosómicas: roturas de
cromátidas, intercambios entre cromátidas (roturas y reunión de
cromátidas de 2 cromosomas distintos), y dicéntricos (cromosomas
con dos centrómeros).
Rotura de cromátida
Intercambio cromatídico
Dicéntrico
6. Observación de colonias sembradas en placas y teñidas con giemsa.