2. Control

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Aislamiento y control de Streptomyces spp.
Ing. Liliam Gutarra
Centro Internacional de la Papa (CIP), Lima, Perú
1. Descripción del agente causal
Streptomyces spp. están clasificados como bacterias atípicas, debido a que carecen de núcleo,
son gram positivos. Su similitud con los hongos reside en su morfología filamentosa, pero se
diferencian notablemente por el reducido diámetro de su filamento vegetativo
(aproximadamente una micra) y carencia de núcleo. Existen tres especies que afectan al cultivo
de la papa. S. scabies, S. acidiscabies y S. turgidiscabies. los cuales producen un substrato de
micelio vegetativo que desarrolla filamentos aéreos. Las esporas provienen de la fragmentación
del micelio.
Las tres especies producen taxotominas, las cuales parecen jugar un rol importante en el
desarrollo de la enfermedad. Estas toxinas inducen los síntomas de la enfermedad, incluyendo
hipertrofia del tejido afectado y muerte de células. Las taxotominas A y otras se producen en el
tejido del huésped y en agar avena.
Las tres especies patógenas se distinguen una de otra por la producción de pigmento, color de
micelio, forma de filamento y habilidad de usar los azucares D- glucosa, L-arabinosa, sucrosa,
D-xilosa, I-inositol, D-manitol, D-fructuosa, rafinosa, celulosa, acido galacturonico.
S.scabies. Ocurre a nivel mundial. En medio extracto de levadura y malta (YME) forma colonias
pequeñas de color gris ratón. Forma cadenas de esporas en espiral. En medio agar hierro
extracto de levadura-peptona ( PYI) produce pigmento de color marrón. Utiliza todos los
azucares. El pH mínimo para crecer en medio de cultivo es 5.0
S. acidiscabies. Ha sido detectado solamente en el Nor-este de USA. En medio YME forma
colonias pequeñas de color durazno (crema) en cadenas flexuosas (onduladas) y produce un
pigmento rojo en medio agar almidón con sales modificado (MSSA). Utiliza todos los azúcares
excepto la rafinosa. El pH mínimo para crecer en medio de cultivo es 4.0
S.turgidiscabies. Ha sido reportado solamente en el Japón. En medio YME forma colonias
pequeñas de color gris más claro (azul / verdoso) que S. Scabies. Forma cadenas de esporas
rectiflexuosas y no produce pigmento.
2. Control
Varios tipos de síntomas pueden ser observados:
-
lesiones reticulares o superficiales,
-
lesiones profundas o cóncavas o protuberantes.
Diferentes especies de Streptomyces pueden provocar estas variaciones de lesiones.
En general la sarna no afecta el rendimiento, solo la calidad del tubérculo, pero hay cepas que
pueden ocasionar necrosis de las raíces lo que puede disminuir el rendimiento.
Los suelos alcalinos , livianos (arenosos) y secos favorecen la sarna.
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1. Evitar el uso de semilla con sarna. Los variantes de Streptomyces difieren en virulencia y al
sembrar tubérculos con sarna se puede reinfectar el campo con otro variante más agresivo.
2. Tratamientos de la semilla con captan y mancozeb reducen el nivel de inoculo en la semilla.
3. Prolongar el tiempo entre siembras sucesivas de papa (3 a 4 años de rotación) reduce la
incidencia de sarna a un nivel más o menos constante, pero rara vez elimina completamente
la población de patógeno en el suelo.
4. No sembrar otros hospedantes en rotación como betarraga, nabo, rabanito, zanahoria y
perejil.
5. La siembra de alfalfa u otras leguminosas y cereales en abonos verdes reduce el inoculo del
suelo.
6. La resistencia o susceptibilidad de las variedades determinan la incidencia de la enfermedad
y el tipo de lesión. Las variedades de papa varían considerablemente en su resistencia a la
sarna, pero ninguno es inmune. Comparar sensibilidad de las variedades y sembrar un cv.
menos susceptible.
7. Mantener altos niveles de humedad en el suelo por unas 4 a 9 semanas desde el inicio de la
tuberización. Sin embargo este puede en unos casos favorecer la sarna que provoca el
síntoma reticulado.
8. Mantener el pH del suelo a 5-5.2 mediante fertilizantes ácidos o sulfuros.
9. Evitar la aplicación de enmiendas como cal que incrementen el pH del suelo, o usar cal
dolomítica.
10. La aplicación de sulfato de manganeso en suelo ha sido reportada efectiva pero a niveles no
prácticos.
3. Aislamiento de Streptomyces spp, a partir de lesiones de sarna en tubérculos
de papa
1) Lavar los tubérculos de papa con agua corriente
2) Desinfectar los tubérculos con una solución de hipoclorito de sodio al 1% durante un minuto
3) Enjuagar con agua destilada estéril
4) Extraer el tejido color pajizo translucido que se encuentra inmediatamente debajo de la
lesión y macerar en agua destilada estéril (1g/10m) en un mortero esterilizado
5) Mezclar un 1 ml del macerado con 9 ml de una solución fenol-agua (1:140)
6) Hacer cuatro diluciones de la mezcla
7) Sembrar 50 µl de cada dilución en medio agar agua o en medio agar agua con antibióticos
con una espátula de Drigalski e incubar a 28 oC durante 7a10 días
8) Purificar los cultivos a partir de una sola colonia en medio YME e incubar a 28°C durante 14
días, al cabo de los cuales se pueden observar el color de las colonias y las características
morfológicas del patógeno
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9) Observar la producción de melanina de color marrón en PYI o pigmento rojo en MSSA, para
lo cual sembrar por estriado una suspensión del patógeno en PYI y MSSA e incubar a 28°C.
4. Pruebas de patogenicidad
Existen muchos métodos para probar la patogenicidad de las tres especies de Streptomyces
que afectan el cultivo de la papa. Para todos los métodos se tiene que producir esporas en
medio agar YME y contar con tubérculos semilla libre de patógenos. Para favorecer la infección
es necesario mantener la humedad del suelo lo más bajo posible durante la tuberización.
Temperaturas de suelo sobre los 22oC favorecen el desarrollo de la enfermedad.
Método de Labruyere
1) Agregar esporas del patógeno desarrolladas en medio agar YME durante 14 días, en una
placa conteniendo perlita estéril saturada con una solución nutriente (Por litro: 20 g de
sucrosa, 1.2 g L-asparagiana, 0.6 g K2HP04, 10g de extracto de levadura)
2) Incubar las placas a 28oC durante 10 a 14 días, luego mezclar una placa de perlita (con
abundante esporas y micelio) con un kilo (aproximadamente) de una mezcla suelo ( arena,
musgo y compost ) esterilizado al vapor o con arena sola.
3) Poner la mezcla de suelo o arena infestada en una bolsa de plástico (un kilo de capacidad),
a la cual previamente se le han hecho algunos huecos en la parte inferior para permitir el
drenaje, luego colocar esta bolsa dentro de una maceta de arcilla de 12.5 cm de diámetro
por 15 cm de alto. Las bolsas se deben llenar parcialmente con la mezcla de suelo o de
arena. Ajustar las bolsas dejando que sobresalgan 10 cm del nivel de las macetas para
evitar la contaminación durante el riego.
4) Desinfectar los tubérculos semilla de papa sanos con hipoclorito de sodio al 0.5% durante
10 minutos, luego sembrar a 5 cm debajo de la superficie de la mezcla de suelo o de arena.
5) Regar las plantas crecidas en la mezcla de suelo con agua corriente y las plantas crecidas
en arena con solución Hoaggland’s.
6) Reducir el riego al mínimo, cuando el diámetro de los tubérculos sea 2 veces mayor que el
diámetro del estolón para favorecer la infección.
7) Los tubérculos pueden verse a través de la bolsa y el desarrollo de la enfermedad puede ser
monitoreado durante la prueba.
8) Cosechar los tubérculos a las 10 semanas después de la siembra y evaluar la presencia de
lesiones de sarna.
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Tabla 1. Características fisiológicas, morfológicas y condiciones de desarrollo
para la diferenciación de Streptomyces spp. que afectan el cultivo de la papa
Especie
Forma de
cadena de
esporas
Color
Producción Utilización Temperatura
de
de
de
de
micelio pigmento
azucares
crecimiento
y medio
S.scabies
En espiral
(YME)
Gris
(YME)
S.acidiscabies
Crema
Rectiflexuosas (YME)
(YME)
S.turgidiscabies
Azul /
Rectiflexuosas verdoso
(YME)
(YME)
Marrón (PYI)
Todos los
azúcares
28-30oC
(YME)
Rojo (MSSA)
Todos
excepto la
rafinosa
Todos los
azúcares
28-30oC
(YME)
No produce
28-30oC
(YME)
YME = Agar extracto de levadura y malta, PYI = Agar hierro extracto de levadura-peptona,
MSSA= Agar almidón con sales modificado.
Azúcares: D- glucosa, L-arabinosa, sucrosa, D-xilosa, I-inositol, D-manitol, D-fructuosa,
rafinosa, celulosa, acido galacturonico.
5. Medios de cultivo para aislamiento
Agar agua
Agar
Agua destilada
20.0 g
1000 ml
Esterilizar en autoclave a 15 libras de presión por 15 minutos.
La mayoría de las especies patogénicas desarrollan y esporulan en agar agua
Medio semiselectivo
Solución stock de antibióticos
Agar
Agua destilada
10.0 ml
20.0 g
1000 ml
Agregar el agar en el agua destilada y esterilizar en autoclave a 15 libras de presión por 15
minutos. Agregar la solución de antibióticos al medio agar antes del plaqueado.
Solución stock de antibióticos
Agua destilada
Nystatina
Sulfato de polymixina B
100 ml
500.0 mg
50.0 mg
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Penicilina sodica (Sodium penicillin G)
Cycloheximida
10.0 mg
500.0 mg
La solución puede ser esterilizada por filtración y almacenada a 5oC o a –20oC durante 4
semanas.
6. Medios de cultivo para producción de esporas y micelio
Agar extracto de levadura y malta (YME)
Extracto de levadura
Extracto de malta
Dextrosa
Agar
Agua destilada
4.0 g
10.0 g
4.0 g
20.0 g
1000 ml
Ajustar el pH a 7.0-7.2 con hidróxido de sodio antes de agregar el agar y esterilizar en autoclave
a 15 libras de presión por 15 minutos
7. Medios de cultivo para producción de pigmento
Agar hierro extracto de levadura-peptona (PYI)
Agar hierro peptona
Extracto de levadura
Agua destilada
36.0 g
1.0 g
1000 ml
Mezclar los ingredientes y ajustar el pH a 7.0-7.2 con hidróxido de sodio o ácido clorhídrico.
Esterilizar en autoclave a 15 libras de presión por 15 minutos
Agar almidón con sales modificado (MSSA)
Almidón soluble
NaN03
MgCO3
K2HP04
NaCl
Agar
Agua destilada
10.0 g
1.0 g
1.0 g
0.3 g
0.5 g
15.0 g
1000 ml
Mezclar los ingredientes y esterilizar en autoclave a 15 libras de presión por 15 minutos