CYTBT-I 2013-Cassanello.pdf

CONCEPTOS y TECNICAS de
BIOTECNOLOGIA
(FCEyN – UBA )
Biotecnología Industrial
Producción industrial de Metabolitos
Biorreactores
Miryan Cassanello
PINMATE – Dep. Industrias, FCEyN-UBA
E-mail: [email protected]
Productos biotecnológicos: están en todos los sectores de la
vida diaria:
•drogas (genéricas
y no-genéricas)
•productos de
belleza
•procesamiento de
alimentos para
humanos y
animales
•procesamiento
textil y artículos
de limpieza
•aplicaciones
industriales:
producción masiva
de alcohol
•suplementos
nutricionales
Relevancia económica de los
productos generados industrialmente
mediante procesos biotecnológicos
Estadística: año 2002
(Fuente: Kent y Riegel, 2007)
Crecimiento de compañías biotecnológicas establecidas (en EEUU,
Europa, Canadá y Australia), 2011-12 (en billones de US$)
2012
2011
% change
Ingresos
89.8
83.1
8%
Inversión en I&D
25.3
24.0
5%
Ganancias netas
5.2
3.8
37%
477.3
376.2
27%
165190
161560
2%
598
610
-2%
Datos informados
Capitalización
Número de empleados
Número de compañías
Fuente: página web de Ernst & Young Global Limited (http://www.ey.com)
“Beyond borders: biotechnology industry report 2013”
Ingeniería Química
Química
Biología
Bioquímica
Biotecnología AZUL:
Aplicación en
organismos marinos
Biotecnología ROJA:
Aplicación en medicina
Biotecnología
AZUL
Biotecnología
ROJA
BIOTECNOLOGIA
Biotecnología
VERDE
Biotecnología VERDE:
Aplicación en agroalimentos
Biotecnología
BLANCA
Biotecnología BLANCA (o industrial):
Aplicación en la industria en general,
productos químicos, nuevos materiales,
biocombustibles, etc.
BIOTECNOLOGIA
INDUSTRIAL
Biotecnología : actividad multidisciplinaria que comprende la
aplicación de los principios científicos y de la ingeniería al
procesamiento de materiales por agentes biológicos para proveer
bienes y servicios. (Definición de la OECD)
Agentes biológicos: células microbianas, animales, vegetales y
enzimas.
Bienes: cualquier producto industrial (alimentos, bebidas,
productos medicinales, etc.
Servicios: especialmente los relacionados con la purificación de
aguas y tratamiento de efluentes.
Bibliografía – libros de texto
Kent and Riegel’s Handbook of Industrial Chemistry and
Biotechnology, J.A. Kent (Ed.), Chapter 30: Industrial
Biotechnology: Discovery to Delivery, G. Chotani, T. Dodge, A.
Gaertner, M. Arbige, Springer, 11th Ed. 2007.
Bioprocess Engineering. Basic concepts, Michael L. Shuler, Fikret
Kargi, Prentice Hall Int. Series, 2nd Ed. 2002.
Principios de Ingeniería de los bioprocesos, Pauline M. Doran,
Editorial Acribia S.A, Zaragoza, España. 1995. (Traducido 1998)
•Bioreaction Engineering Principles, John Villadsen, Jens Nielsen,
Gunnar Lidén. Springer, 3ra. Ed. (2011). ISBN-10: ISBN 978-14419-9687-9 e-ISBN 978-1-4419-9688-6
•Biochemical Engineering Fundamentals, James E. Bailey, David. F.
Ollis, McGraw-Hill Int. Ed., 2nd. Ed. 1986.
•Biochemical engineering and biotechnology, Ghasem Najafpour,
Elsevier, (2007) ISBN-10: 0444528458; ISBN-13: 978-0444528452
Objetivo de la
producción
industrial de
células o de
microorganismos
Producir las mismas células o
microorganismos (biomasa) en
gran escala
Producir en gran escala
compuestos (intracelulares o
extracelulares) resultantes del
crecimiento celular
(metabolitos)
Metabolitos
Primarios
Metabolitos
Secundarios
Metabolitos primarios
-Moléculas generalmente sencillas, que participan de los caminos
metabólicos esenciales. Son casi idénticos en todos los organismos.
-Son más baratos y sencillos de producir, tienen bajo contenido de
“actividad biológica” y frecuentemente son “commodities”
1. Componentes esenciales de las células/microorganismos:
proteínas, ácidos nucléicos, polisacáridos (gelanos, xantanos) y
poliésteres, ácidos grasos (insaturados), esteroles.
2. Derivados del metabolismo intermedio: azúcares (fructosa,
ribosa, sorbosa), ácidos orgánicos (gluconato, ácido láctico,
cítrico, acético, propiónico, succínico, fumárico), alcoholes
(xilitol, etanol, glicerol, sorbitol, butanol), aminoácidos (Lys,
Thr, Glu, Trp, Phe), vitaminas (B2, B12), nucleótidos
saborizantes (ácidos inocínico y guanílico), polisacáridos y
poliésteres de reserva.
Microorganismos productores: bacterias, levaduras y hongos
Metabolitos secundarios
-Moléculas mas complejas, que participan de caminos metabólicos
no-esenciales, pero confieren capacidades de supervivencia en
situaciones de stress.
-Son muy variados y su estructura es fuertemente dependiente de la
especie y variedad utilizada para su producción. Se generan en
condiciones particulares y son más valiosos y complicados de
producir ⇒ alto contenido de “actividad biológica”
-Generalmente son productos especiales (alto precio). Funcionan
en los organismos que los producen como:
1. Armas contra otros microorganismos (antibióticos, toxinas,
inhibidores enzimáticos, pesticidas)
2. Factores de crecimiento (hormonas)
3. Ionóforos
4. Agentes de interacción microbiana
5. Efectores externos
PROCESOS BIOTECNOLOGICOS o
FERMENTACIONES
Procesos que se llevan a cabo en un “bio”-reactor mediante los cuales
se transforman los sustratos de un medio de cultivo (materias primas)
en metabolitos y/o en biomasa (productos) empleando para este fin
microorganismos, células o enzimas.
Biorreactor
o
Fermentador
Operaciones
unitarias
Operaciones
unitarias
Principales etapas de un proceso biotecnológico industrial:
Fermentación
Propagación
de los cultivos
Separación
Esterilización
Preparación de
medios
Purificación
Tratamiento
de efluentes
1) Propagación de cultivos: comienza en un tubo de ensayo o un tubo
congelado o liofilizado donde se conserva la cepa de interés, o de
una colonia del microorganismo previamente seleccionado. Se
propaga en el laboratorio progresivamente aumentando el volumen
del medio de cultivo.
2) Fermentación: Se prepara el medio de nutrientes y se esteriliza. Se
siembra un tanque de inóculos cuyo volumen depende de la escala
industrial. Vinoculos~50-1000L y Vfermentador industrial~10-1000 m3).
Principales etapas de un proceso biotecnológico industrial:
Fermentación
Propagación
de los cultivos
Separación
Esterilización
Preparación de
medios
Tratamiento
de efluentes
Purificación
3) Separación y purificación: operaciones mecánicas de ruptura de
células; separación de insolubles por filtración, centrifugación o
sedimentación; separaciones primarias por extracción, absorción,
adsorción, ultrafiltración; purificación por extracción líquidolíquido, extracción en dos fases acuosas o cromatografía de
afinidad; aislamiento y acondicionamiento del producto.
4) No tiene relación directa con el producto pero es una etapa
imprescindible por los volúmenes involucrados y para preservar el
medio.
Selección (screening)
En la selección del microorganismo/célula, se debe tener en cuenta:
1. La cepa a utilizar debe ser genéticamente estable.
2. La velocidad de crecimiento debe ser alta.
3. La cepa debe estar libre de contaminantes.
4. Sus requerimientos nutricionales deben cubrirse con medios de
cultivo de costo reducido.
5. Deben ser de fácil conservación por largos períodos de tiempo sin
pérdida de sus características.
6. Debe realizar el proceso fermentativo completo en tiempo corto.
7. Si el objetivo es un producto, este debe ser de alto rendimiento y
de fácil recuperación a partir del medio de cultivo.
Los nuevos métodos de “screening” incorporan técnicas de ingeniería
genética para crear diversidad.
Preparación de medios de cultivo – Esterilización
Los componentes de los medios de cultivo son los “efectores
externos” de naturaleza química que deben cumplir con los
requerimientos del crecimiento y de formación de productos y
suministrar energía para el mantenimiento celular.
Componentes de un medio de cultivo:
1. Macronutrientes, agregados en concentraciones de g/L, fuentes
de C, N, S, P, K y Mg
2. Micronutrientes o elementos trazas, representados por las sales
de Fe, Mn, Mo, Ca, Zn y Co, agregados en conc. de mg o µg/L
3. Factores de crecimiento, constituidos por compuestos orgánicos
que no son sintetizados por las células y de función metabólica
específica; se suministran en baja concentración (vitaminas,
algunos aminoácidos, etc.)
Preparación de medios de cultivo – Esterilización
Los medios pueden clasificarse considerando la naturaleza
química de los componentes en:
1. Medios sintéticos o medios químicamente definidos
2. Medios complejos, en cuya composición intervienen
sustancias de origen animal o vegetal (ej.: extracto de
levadura, macerado de maíz, harina de soja, etc.) que aportan
las sustancias fundamentales pero son químicamente
indefinidas y de composición variable.
Cualquiera sea el medio de cultivo, se debe esterilizar previamente
a ponerse en contacto con el inóculo. Esterilizar significa eliminar
toda forma de vida de un medio o material. Generalmente se lleva
a cabo por filtración o calentamiento.
Separación y purificación (downstream):
(downstream) depende de la
eficiencia del proceso y del producto a obtener
Fermentaciones - fermentadores o biorreactores
Es el corazón del proceso y debe optimizarse para evitar posteriores
etapas de separación y purificación.
discontinuas o batch
semicontinuas (fed-batch)
Fermentaciones
continuas
Para el diseño de los biorreactores se debe considerar la cinética del
crecimiento de las células o microorganismos (“biomasa”) y la
velocidad de formación de los productos deseados.
Cinética de crecimiento de biomasa
Definiciones
Crecimiento en cultivos discontinuos o batch: Factores que afectan
Cuantificación de la velocidad de crecimiento: Modelos, Ecuación
de Monod
Crecimiento en cultivos continuos: Quimiostato, turbidistato
Cinética de crecimiento microbiano
Sustrato + biomasa →
∑S + X
→
productos
mayor cantidad
+
extracelulares
de biomasa
∑P
+
nX
El crecimiento microbiano es un ejemplo de reacción autocatalítica. La velocidad de crecimiento está relacionada con la
concentración de células.
Velocidad específica neta de
crecimiento (h-1):
X: concentración másica de células (g/L)
t: tiempo (h)
Crecimiento
1 dX
µ neta ≡
X dt
aumento en el número de células
aumento del tamaño de las células
La velocidad específica neta de crecimiento es la diferencia entre la
velocidad de crecimiento y la velocidad de desaparición de biomasa
por muerte celular o por metabolismo endógeno:
µ neta = µ g − k d
También se puede expresar la velocidad en función de la
concentración de número de células en lugar de la concentración
másica de las mismas. Si no se pueden medir las dos, se prefiere
la concentración másica.
Formas de medir la concentración de células
Se busca un método rápido, fácil de seguir en línea o de respuesta
rápida.
Directos
Métodos
Indirectos
Determinación de la concentración másica de células:
Métodos directos (en ausencia de otros sólidos en suspensión):
•Masa de células secas (centrifugado/filtrado/lavado/secado)
•Volumen de células centrifugadas en condiciones estándar
•Absorción de luz por células en suspensión
Métodos indirectos: se basan en un efecto que inducen, como ser la
velocidad de consumo de un sustrato o de formación de un producto.
•Productos: etanol, CO2
•Sustratos: consumo de O2 o de un sustrato base de C o N
•Propiedades físico-químicas: viscosidad, pH
Ejemplo: seguir la concentración de ATP, ≅ proporcional a la masa
de células.
luciferasa
luciferina + ATP + O 2 → LUZ
Sensible
> 10-12 gATP/L
Cinética de crecimiento de un cultivo en batch
Etapas:
1) de latencia o
inducción
2) de crecimiento
exponencial
3) de desaceleración
4) estacionario
5) de muerte o
declinación
celular
3)4)
Desaceleraci
ón: velocidad
por consumo
de un nutriente
esencial
o generación
de
Estacionario:
de
crecimiento
nula.
Las
células
aún
son
5)
Muerte:
el númerodeldeinóculo
células,multiplicación
definir
el límite
con la
1)
Latenciabaja
: adaptación
aldifícil
medio.
Depende
del
inóculo
2)
Crecimiento
exponencial:
rápida
de
células
subproductos
tóxicos
crecimiento
desbalanceado,
las
células
deben
activas
y
pueden
producir
metabolitos
secundarios
(ej.
antibióticos,
etapa
(edadanterior.
y tamaño)
y de los(composición
nutrientes.
Sedepuede
adaptar
ex-situ.
crecimiento
balanceado
células
constante).
readaptarse
a
las
condiciones
hostiles.
hormonas) productos de la desregulación celular
1) Latencia: adaptación del inóculo al medio. Depende del
inóculo (edad y tamaño) y de los nutrientes. Se puede adaptar
ex-situ.
2) Crecimiento exponencial: rápida multiplicación de células
crecimiento balanceado (composición de células constante).
3) Desaceleración: por consumo de un nutriente esencial o
generación de subproductos tóxicos
crecimiento
desbalanceado, las células deben readaptarse a las condiciones
hostiles.
4) Estacionario: velocidad neta de crecimiento nula. Las células
aún son activas y pueden producir metabolitos secundarios (ej.
antibióticos, hormonas) productos de la desregulación celular
5) Muerte: baja el número de células, difícil definir el límite con
la etapa anterior.
Crecimiento balanceado: todos los componentes de las células
crecen con la misma velocidad → la composición media de las
mismas permanece constante. Es válido para la etapa de crecimiento
exponencial.
exponencial
En este período, la velocidad de crecimiento es independiente de los
nutrientes y resulta en una cinética de primer orden porque el valor es
aproximadamente constante:
1 dX
dX
µ neta t
µ g ≅ µ neta =
⇒
= µ neta dt ⇒ X = X 0e
X dt
X
Tiempo necesario para duplicar la biomasa:
X = 2X 0
ln(2)
⇒ τd =
µ neta
Crecimiento no balanceado: los componentes de las células no
crecen con la misma velocidad → la composición media se modifica.
Esta situación caracteriza especialmente a la etapa estacionaria
El estrés producido por la falta de nutrientes o por la existencia de
subproductos o toxinas inhibidoras que generan un medio hostil
induce una reestructuración de las células para adaptarse a las nuevas
condiciones.
µ g ≠ µ neta = µ g − k d
Puede ocurrir:
•La concentración másica de células (X) es constante pero baja el
número de células viables.
•X baja por lisis de células. Puede aparecer un segundo período de
crecimiento, los productos de lisis o las células muertas constituyen
un sustrato alternativo (crecimiento críptico).
•X constante pero su metabolismo es activo; cambia la regulación
celular produciendo metabolitos secundarios.
Energía de mantenimiento: necesaria para mantener la membrana
celular activa y el transporte de nutrientes, y para funciones
metabólicas esenciales como la movilidad y la reparación de
estructuras dañadas.
1 dS 
m= 
X dt  m
Coeficiente de mantenimiento:
se emplea para definir la velocidad
específica de consumo de sustrato
para energía de mantenimiento.
Si no hay sustrato disponible, el mantenimiento inducirá pérdida de
masa celular (metabolismo endógeno para adaptarse al medio).
Coeficientes de rendimiento:
rendimiento se definen en base a la cantidad
consumida de otro componente.
Rendimiento de formación de células por masa
∆X
YX /S = −
de sustrato consumida (g células/g S)
∆S
YX/S es un valor constante y es máximo en la
etapa de crecimiento exponencial.
Luego de la etapa de crecimiento exponencial, YX/S deja de ser
constante, es un rendimiento aparente porque el sustrato se emplea
para otros fines:
∆ S = ∆ S formacion + ∆ S formacion
de biomasa
de productos
+ ∆ S energia + ∆ S energia
para cre cimiento
para man tenimiento
También se pueden definir rendimientos basados en otros componentes:
∆X
∆P
Y
=−
; YP/S = −
X / O2
∆DO
∆S
Ejemplo: Organismos creciendo en condiciones aeróbicas en glucosa;
para la mayoría de las bacterias y levaduras:
YX /S = 0,4 − 0,6 g / g ; YX/O = 0,9 −1,4 g/g
2
(en condiciones anaeróbicas suelen ser menores)
Los rendimientos
dependen del medio
y de la fuente de C.
Para la mayoría de
los casos:
YX /S = 1± 0,4 g/g


g biomasa


 g de C consumido 
Relación del crecimiento de biomasa con la formación de
productos:
∑S
+ X →
∑P
+ nX
1 dP
qP =
= YP / X µg
X dt
Definimos la velocidad específica de
formación de producto, qP
Se encuentran 3 situaciones:
(a) qP asociada al crecimiento celular,
ej: producción de una enzima constitutiva
de la biomasa (metabolito primario).
q P = α µ g ⇒ α = YP / X
(b) qP parcialmente asociada (etapa de
desaceleración y estacionaria), ej: fermentación de q = α µ + β
P
g
ácido láctico, xantanos y algunos metabolitos
secundarios.
(c)
q no-asociada al crecimiento
P
celular (etapa estacionaria, donde la
µg=0) ej.: metabolitos secundarios
como antibióticos.
q P = β = cons tan te;
µg = 0
Relación del crecimiento de biomasa con la formación de
productos:
1 dP
1 dX
= YP / X µ g = YP / X
qP =
X dt
X dt
Asociada
q P = α µg
Parcialmente asociada
q P = α µg +β
Metabolitos primarios
No asociada
qP =β
Metabolitos secundarios
Factores que influyen – Temperatura del medio
La velocidad de
crecimiento
disminuye por
encima de la Top
La velocidad de
crecimiento
aproximadamente
se duplica cada
∆T = 10°C
-psicrófilos (Top < 20°C)
-mesófilos (20<Top<50°C)
-termófilos (Top > 50°C)
•Por encima de Top ocurre muerte celular → disminuye el número
de células viables cuando la velocidad de muerte supera la de
crecimiento.
•Ambas velocidades siguen una ecuación tipo Arrhenius con
µ'g = A exp( −E a / RT )
Ea ≅ 10–20 kcal/mol
k d = A d exp( − E d / RT )
Ed ≅ 60–80 kcal/mol
La muerte celular es más sensible a T que el crecimiento
(importante para la esterilización)
•La T también afecta la velocidad de formación de producto pero
la Top y la Ea suelen ser distintas.
•También influye sobre el YX/S porque para T>Top, la energía de
mantenimiento es mayor
baja YX/S
•Para organismos inmovilizados puede cambiar el control.
Factores que influyen – pH del medio
Rango de
pH óptimo
Variación de la velocidad específica de crecimiento con el pH. Existe un
pH óptimo para cada tipo de célula, generalmente próximo a 7. Se puede
incrementar el rango adaptando las células por incrementos pequeños.
•El pH óptimo suele ser distinto para el crecimiento que para la
formación de producto.
•Los pH aceptables varían en ±1 o 2 unidades respecto del óptimo.
•El pH óptimo depende de la biomasa, el rango va de 3 a 8.
- levaduras: 3 – 6
- hongos: 3 – 7
- células vegetales: 5 – 6
- células animales: 6,5 – 7,5
•Algunos organismos pueden regular el pH empleando energía de
mantenimiento.
•El pH puede variar mucho por efecto del medio (fuente de N,
aminoácidos, CO2)
Factores que influyen – concentración de O2 disuelto (DO):
Es un sustrato importante para las fermentaciones aeróbicas.
•Debido a la baja solubilidad del O2 en agua, puede ser un limitante de
la velocidad de crecimiento.
•La solubilidad del oxígeno en agua depende de la presión, de la
temperatura y de las sales disueltas (a presión atmosférica es 7ppm).
•La concentración crítica de oxígeno
disuelto CO2,critica es aquella por debajo
de la cual comienza a controlar la
velocidad de crecimiento:
• 5–10% de la concentración de
saturación para bacterias y levaduras y
≅ 10–50% de la concentración
de saturación para hongos (según
el tamaño)
Transporte de oxígeno a las células
•El O2 se
introduce por
burbujeo y su
concentración
depende de la
agitación.
•Velocidad de consumo de
oxígeno (O2 uptake rate) OUR = q O 2 X =
µg X
YX / O
2
•Velocidad de transferencia
(O2 transfer rate)
OTR = k L a LG  C*O − C O b 
2 
 2
Factores que influyen – otros factores
•Potencial redox: afecta las reacciones de óxido-reducción. Esta relacionado
con la concentración de O2, el pH y las concentraciones de otros iones.
Potencial de reducción del medio:
( ( ) ( ))
E (mV )= E 0 + 0,06 log PO + log H +
2
Se puede reducir bajando la concentración de O2 (burbujeo de nitrógeno) o
por agregado de agentes reductores (cisteína, Na2S, HCl).
•Concentración de CO2 disuelta puede afectar. Puede ser tóxica para algunas
células y necesaria para otras.
Se regula modificando la concentración en la corriente de burbujeo.
•Fuerza iónica: afecta el transporte de ciertos nutrientes desde y hacia el
interior de las células. Depende de la concentración y de la carga de los iones
en el medio:
FI = 12 ∑ c i Zi2
i
Generación de calor por crecimiento microbiano
•40–50% de la energía suministrada por las fuentes de C se
convierten en ATP (forma en que las células acumulan energía)
→el resto se libera como calor.
•El calor liberado se puede calcular a partir de las entalpías de
combustión del sustrato y de la biomasa formada:
CO 2 + H 2 O
Crecimiento
microbiano y
respiración
1/YH (kJ/g célula)
+
Ciclo entálpico
para calcular el
calor generado
celulas
Combustión de
las células
∆Hc (kJ/g)
combustion del
sustrato, ∆H S ( kJ / g )
Sustrato + O 2    → CO 2 + H 2 O
∆H S
1
= ∆H c +
YX / S
YH
YX / S
⇒ YH =
∆H S − YX /S∆H c
•Algunos valores típicos:
∆Hc ~ 20 – 25 kJ/g células
YH ~0,42 g/kcal (glucosa); 0,30 g/kcal (malato); 0,18 g/kcal (etanol)
0,12 g/kcal (metanol); 0,061 g/kcal (metano)
•El grado de oxidación del sustrato afecta fuertemente la cantidad de
calor que evoluciona por el metabolismo de las células.
•Para células en crecimiento activo, el requerimiento para
mantenimiento es bajo →la evolución de calor está directamente
relacionada con el crecimiento.
•Velocidad total de generación de calor en una fermentación batch se
calcula considerando la velocidad de crecimiento.
1
Q generado = µ neta X
V
YH
•En una fermentación aeróbica, se correlaciona con la velocidad de
consumo de oxígeno, dado que es el aceptor final de electrones.
Q generado = 0,12 Q O
2
Configuraciones de refrigerantes en biorreactores: (a) camisa externa
(b) serpentín externo (c) serpentín interno helicoidal (d) serpentín
interno tipo deflector (e) intercambiador de calor externo
Reactor batch de
escala industrial
Reactor batch de
escala laboratorio
Estequiometría del crecimiento microbiano y formación de
productos Procesos complejos →reflejan el transcurso de miles
de reacciones intracelulares.
Es importante poder comparar el rendimiento y la generación de calor
que se obtiene empleando distintos sustratos → la estequiometría de
conversión de sustratos a biomasa y a productos extracelulares se
suele representar por ecuaciones pseudoquímicas simples.
CH m O n + a O 2 + b NH 3 → c CH α Oβ N δ + d H 2O + e CO 2
CHmOn representa un mol del carbohidrato empleado como sustrato
CHαOβNδ representa un mol del material celular
La composición del material celular depende del tipo de
organismo. Un mol de material biológico es aquel que
contiene un átomogramo de C
Por que una fórmula mínima escrita como: CHaObNd ?
Composición elemental de la bacteria Escherichia coli
Elemento
% en masa seca
C
50
O
20
N
14
H
8
P
3
S
1
K
1
Na
1
Ca
0.5
Mg
0.5
Cl
0.5
Fe
0.2
Otros
0.3
92% de la masa seca
total esta formado por
C, O, N, H
Componentes minoritarios
no se tienen en cuenta en la
fórmula mínima
Los coeficientes estequiométricos y la fórmula mínima se calculan
planteando balances elementales, la información del cociente
respiratorio y un balance de electrones disponibles.
CH m O n + a O 2 + b NH 3 → c CH α Oβ N δ + d H 2O + e CO 2
Balances
elementales:
C:
H:
O:
N:
1= c + e
m + 3b = cα + 2d
n + 2a = cβ + d + 2e
3b = cδ
Los balances para H y O pueden no dar información correcta por la
gran masa de agua que tienen las células →se requiere información
adicional.
●Cociente respiratorio (RQ): moles de CO2 producidos por mol de
O2 consumido provee una indicación del estado metabólico y puede
emplearse para controlar el proceso.
moles CO 2 generados e
RQ =
=
moles O 2 consumidos a
●Balance de electrones disponibles:
Para las reacciones mas complejas, con formación de productos
extracelulares, se agregan componentes hay un coeficiente
estequiométrico más y se requiere mayor información.
Además, los balances elementales no se relacionan con los
cambios de energía involucrados en la reacción.
se desarrolló el concepto de grado de reducción, γ, para poder
plantear balances de electrones y protones en bioreacciones.
Grado de reducción: número de equivalentes de electrones
disponibles por átomo-gramo de C. Los electrones disponibles son
aquellos que se transfieren al O2 al formarse CO2 o H2O.
∑i,sustratos νi γ i = ∑i,productos νi γ i
ν i :coef .estequiometri cos ; γ i :grados de reduccion
Cinética de crecimiento microbiano: Modelos
Sustrato + biomasa →
∑S + X
productos
mayor cantidad
+
extracelulares
de biomasa
→
(
∑P
+
nX
)
1 dX
µ neta ≡ µ g − k d ≡
X dt
µneta: Velocidad específica neta de crecimiento (h-1)
µg: Velocidad específica de crecimiento de biomasa (h-1)
kd: constante de muerte celular o disminución de masa celular por
metabolismo endógeno (h-1)
X: concentración másica de células (g/L)
t: tiempo (h)
Cuantificación de la cinética de crecimiento: modelos cinéticos
Modelos Estructurados Tienden a representar la estructura de las
células. Pueden dividir la célula en sus componentes y considerar las
reacciones y cambio de metabolismo que tienen lugar en cada zona
de la célula, como respuesta a cambios en el medio.
Modelos Segregados Tienen en cuenta que el medio no es
homogéneo, permiten variaciones de concentraciones de biomasa y
de nutrientes y diferencias en las propiedades fisicoquímicas del
medio (viscosidad, densidad, pH, T, etc.). También permiten
considerar la posibilidad de agregación de células.
Descripción detallada debería involucrar diferenciaciones en la
estructura de la célula y la segregación del medio de cultivo en
unidades que pueden tener diferentes concentraciones y propiedades
físico-químicas modelos estructurados-segregados
MAYOR COMPLEJIDAD
No estructurados
Estructurados
Segregados
Segregados
No estructurados
Estructurados
No segregados
No segregados
Son más
realistas, pero
son complejos y
demandantes de
tiempo de
cálculo.
MAYOR CAPACIDAD DE REPRESENTAR LA REALIDAD
El grado de realismo y complejidad de un modelo depende del
objetivo se debe elegir el modelo más simple capaz de
representar en forma adecuada al sistema que nos interesa.
Nos restringimos a los modelos No-estructurados/No-segregados
Modelos No-Estructurados Suponen una composición fija de
la célula (equivalente a suponer crecimiento balanceado).
-Son estrictamente válidos para la etapa de crecimiento
exponencial en batch
-No andan bien para transientes, salvo que la respuesta de la
célula sea rápida y/o las perturbaciones sean leves.
Modelos No-Segregados
Consideran un medio homogéneo.
-Representan adecuadamente muchos casos.
Modelos cinéticos de crecimiento: controlados por sustrato
Suponen que la cinética depende solamente de un único sustrato
esencial (por ej., glucosa). Los cambios en los otros sustratos no
afectan. Más difundido Modelo de Monod
µ g(h-1)
µg =
µm S
Ks + S
S (µM)
Supone que un único sistema
enzimático controla el consumo de
sustrato y que dicho sistema
determina la velocidad de
crecimiento de biomasa.
biomasa
La premisa es generalmente falsa,
pero la ecuación de Monod ajusta
una amplia gama de resultados
experimentales y es la expresión
más empleada para el diseño de
fermentadores.
µm: máxima velocidad específica
µ g(h-1)
µg =
de crecimiento de biomasa
µg = µm cuando S >> K s
µm S
Ks: constante de saturación o de
velocidad media
Ks + S
µg = 12 µ m
cuando S = K s
S (µM)
Monod da buenos resultados para cultivos con baja velocidad de
crecimiento y baja densidad de células.
Para cultivos concentrados se usan expresiones similares,
modificando Ks:
µg =
µm S
K S S0 + S
0
o
µg =
µm S
K s + K s S0 + S
1
0
Nociones de diseño de fermentadores o biorreactores
•La elección del tipo de reactor y de la estrategia de operación define
la producción a obtener y la pureza del producto (número y tipo de
impurezas, reactivos sin convertir). También determina si se puede
lograr un producto de calidad constante y una operación confiable.
•En bioprocesos los reactores representan un gran % del capital.
Tipos de reactores comúnmente empleados
Discontinuos o batch: una vez que se carga, el proceso
ocurre sin ingreso de sustrato ni salida de productos.
Continuos (quimiostato): hay alimentacion
continua de sustrato y retiro continuo de productos
Semicontinuos (Fed-batch): hay ingreso
continuo o intermitente de sustratos, sin
retiro de productos.
Reactores discontinuos o batch
Producción de biomasa o de un producto asociado a crecimiento
(metabolito primario):
En un batch se observan 4 etapas:
1) Preparación para la nueva operación (limpieza, esterilización,
llenado del reactor)
2) Sembrado y período de inducción
3) Período de crecimiento exponencial
4) Recuperación del producto del reactor
La suma del tiempo involucrado en las etapas 1+2 y 4 es un tiempo
muerto, tm, a considerar en el diseño del reactor
varía con el tamaño del reactor y con el tipo de fermentación pero
generalmente es del orden de las horas (3–10 hs)
tiempo total de operación para llegar a una concentración final de
biomasa Xf :
 Xf 
1

tc = tm +
ln
µneta  X 0 
La concentración final de biomasa, Xf , depende de la cantidad de
sustrato limitante del crecimiento y del rendimiento:
kg
X f − X 0 = YX / S S0 −S
m3
(
)
La mayoría de las fermentaciones operan con una relación Xf/X0 de
aproximadamente 10–20. La velocidad de producción de biomasa
por operación del reactor batch, rb , se calcula dividiendo la masa
total que podemos formar por el tiempo que lleva la operación:
rb =
YX / SS0
(1/ µneta )ln(X f
)
X0 + t m
kg
m 3s
Una operación continua en condiciones óptimas conduce a una
producción significativamente superior porque no hay tiempos
muertos. De todos modos, la mayoría de las fermentaciones son
procesos discontinuos.
Por qué?
• En muchos casos no interesa el producto asociado a crecimiento;
el crecimiento de las células puede incluso inhibir la producción
del producto deseado. En esos casos el producto deseado se genera
solo con velocidades de dilución muy bajas, muy por debajo de la
que lleva a la óptima productividad de biomasa.
Para producción de metabolitos secundarios, la productividad
en un batch puede superar significativamente a la de un reactor
continuo.
• Otra razón importante para que se prefiera la operación
discontinua es la inestabilidad genética. Los microorganismos que
se emplean suelen ser especies que han sido manipuladas y tienen
menor velocidad de crecimiento que las originales.
Una operación continua impone una selección severa cuando
hay mezclas de cultivo, conduciendo a la cepa de mayor
velocidad de crecimiento.
Por qué?
•Otro factor a tener en cuenta es la operabilidad y la confiabilidad
de la operación. Los reactores batch conducen a productos con
mucha variabilidad genera problemas en las etapas de
purificación. Sin embargo en los sistemas continuos una falla
mecánica o de control de alguna variable de operación o de la
esterilización del proceso puede conducir a problemas severos.
Las consecuencias de una falla de operación son mas graves
en un sistema continuo y las pérdidas mayores.
•La economía de mercado influye en la selección del reactor. Un
sistema continuo es un sistema dedicado a un dado proceso un
único producto.
Muchos productos de fermentaciones se requieren en pequeñas
cantidades y su demanda es difícil de proyectar. Los sistemas
batch son más versátiles, el mismo reactor puede emplearse
para distintos productos.
Cultivos continuos se agrega un medio con nutrientes frescos en
forma continua, a un volumen de control que contiene las células.
Se retiran continuamente productos y parte de las células.
-Cuando se alcanza el estado estacionario, X, S y P permanecen
constantes en un dado punto del reactor.
-Los cultivos continuos proveen un medio de cultivo constante para
el crecimiento de las células y para la formación de productos
calidad uniforme de los productos
-Pueden ser una herramienta importante para determinar como un
microorganismo responde al medio, y para generar un producto en
condiciones óptimas.
Sistemas con mezclado
Quimiostato
perfecto:
perfecto Tanques
Sistemas para
continuos idealmente
Turbidistato
lograr cultivos
agitados (TCIA)
continuos
Flujo Pistón Ideal (FPI): mezclado radial
perfecto y mezclado axial nulo;
nulo poco
empleado, salvo para inmovilizados
Quimiostato: el crecimiento de biomasa suele estar controlado
por un nutriente esencial y el resto se agrega en exceso. Las
condiciones químicas del medio son constantes.
Reactores tanque agitado de
laboratorio
Turbidistato: la concentración de células en el reactor se mantiene
constante. La alimentación se regula mediante el monitoreo de la
densidad óptica del cultivo. Se alimenta medio fresco cuando la
turbidez supera un límite prefijado. El volumen se mantiene constante
retirando una cantidad de fluido equivalente a la que se agrega.
•Se usa menos que el quimiostato porque es más elaborado y porque el
medio cambia.
•Puede ser muy útil
para seleccionar
subpoblaciones que
puedan soportar
condiciones de
stress, porque la
concentración de
células se mantiene
constante.
FPI (Flujo Pistón Ideal):
como no hay retromezclado,
los elementos de fluido con
células activas no pueden
inocular elementos de fluido
nuevos aguas arriba
se requiere el reciclo
continuo de células para
inoculación continua del
medio fresco alimentado.
L(+G,S)
L(+G,S)
•Un FPI es equivalente a un batch, en el cual la posición en el
reactor equivale a un dado tiempo en el reactor batch.
•Equipos con células inmovilizadas (trickling filters) se asemejan
a un FPI y no necesitan el reciclo, se usan extensamente en
tratamiento de efluentes.
Reactores tubulares de biofilm en columna de burbujeo y rellenas (a) reactor de arrastre para
producción biotecnológica de etano, Delft (The Netherlands); (b) reactores de producción de
cerveza en Brasil. Fuente: Nicolella C, van Loosdrecht MCM, Heijnen SJ: Particle-based biofilm reactor technology. Trends in
Biotechnology 2000
Producción
de algas en
fotobiorreactores
tubulares
(flujo tipo
FPI)
Producción de algas en fotobiorreactores
tubulares (flujo tipo FPI)
Fotobiorreactor tubular helicoidal de
1000 L (Murdoch University, Australia)
Recuperación de microalgas a partir
del medio de cultivo por filtración
Cyanotech Corporation
(www.cyanotech.com), Hawaii, USA.
Cultivos continuos: Quimiostato ideal
Es un tanque agitado que se opera con circulación continua (TCIA)
del medio de cultivo. La mayoría requiere control (pH, T y CO2).
•Se alimenta medio estéril (X0= 0) a un tanque perfectamente
agitado (y aireado si es fermentación aeróbica). Se deja salir la
suspensión de células para mantener las concentraciones y el
volumen de líquido constante.
Fv
S0, X0, P0
Burbujeo
de gas
Fv
S, X, P
Las concentraciones a la
salida del reactor son
iguales a las del interior
por la hipótesis de
mezclado perfecto
Volumen de líquido =
volumen de reactor = V
Balances de masa Ecuaciones de diseño
Planteando balances de masa para los distintos componentes, se
obtienen las ecuaciones de diseño.
 Masa que   Masa que   Masa
 
 

 entra al VC  −  sale del VC  +  generada
 con los   con los   dentro del
 

 
reactivos
productos
  V.C.

 
  Masa   Masa 

 
 
 −  consumida  =  acumulada 
  dentro del   dentro del 

 
 
V.C.
V.C.
 

 
Si el volumen de control V.C. es un QUIMIOSTATO
Un quimiostato opera en estado estacionario
de acumulación de masa:
se cancela el término
 Masa que sale  Masa consumida  Masa que entra  Masa generada
 =  al V.C. con  + 

 del V.C. con  + 



 los productos   dentro del V.C.   los reactivos   dentro del V.C. 




Quimiostato - ecuaciones de diseño
 Masa que sale  Masa consumida  Masa que entra  Masa generada

 =  al V.C. con  + 
 del V.C. con  + 



 los productos   dentro del V.C.   los reactivos   dentro del V.C. 




Fv
S0, X0, P0
Fv
S, X, P
Balance de masa de células:
FV X = FV X 0 + Vµ neta X
(
)
⇒ FV X = FV X 0 + V µ g − k d X
V
FV: caudal volumétrico de medio
de cultivo agregado (L/h)
Gas
Definiendo el factor de dilución como caudal/volumen: D = FV/V
(
)
⇒ DX = DX 0 + µ g − k d X
(
)
Si se alimenta medio estéril (X0= 0) y
el mecanismo endógeno es despreciable
⇒ DX = DX 0 + µ g − k d X
⇒ D =µg
Importancia de este resultado: En un quimiostato en
alimentado con medio estéril y en condiciones
D= g EE,
en las que el metabolismo endógeno es despreciable,
la velocidad o factor de dilución, D, iguala a la
velocidad de crecimiento de células
se puede manipular la velocidad de crecimiento como un parámetro
independiente modificando las variables de operación
el quimiostato es una herramienta experimental poderosa
µ
Si la velocidad de crecimiento sigue la expresión de Monod
D =µg =
µm S
Ks + S
S: concentración de sustrato limitante
del crecimiento de biomasa en EE
Si se impone un factor de dilución D > µm , las células no se podrán
reproducir lo suficientemente rápido para mantenerse se lavan, o
se vacía el quimiostato (“washout”)
BM sustrato en estas condiciones (EE y sin metabolismo endógeno):
 Masa que sale  Masa consumida  Masa que entra  Masa generada
 =  al V.C. con  + 

 del V.C. con  + 



 los productos   dentro del V.C.   los reactivos   dentro del V.C. 




FVS
1
1
+ Vµg X M + Vq P X
YP / S
YX / S
Formación de biomasa
=
FVS0
Formación de producto
FV: caudal volumétrico de medio de cultivo agregado (L/h)
S: concentración de sustrato limitante del crecimiento (g/L)
V: volumen del reactor (L)
µg: velocidad especifica de crecimiento de biomasa (1/h)
X: concentración de biomasa (g/L)
qP (gP/gcélulas/h): velocidad específica de productos extracelulares
YMX/S (g células/gS) : máximo rendimiento de biomasa a partir de S
YP/S (gP/gS) : rendimiento de producto extracelular a partir de S
Concentración másica de células en estas condiciones (EE y sin
metabolismo endógeno):
(
D S0 − S
)
= X
µg
YXM/S
+ X
qP
YP / S
Como además µg = D , si la formación de
M
X
=
Y
S −S
X /S 0
productos extracelulares es despreciable:
(
M
)
Estrictamente, YX / S depende de la concentración de sustrato y de la
velocidad de crecimiento, no es exactamente igual para cualquier S0
La productividad en un fermentador continuo se
obtiene como el producto del factor de dilución por la
concentración de células, DX (g/Lh)
Productividad en un quimiostato, suponiendo válida Monod (EE sin
metabolismo endógeno ni formación de productos extracelulares): se obtiene del
producto del factor de dilución por la concentración de células, DX (g/Lh):
(
X = YXM/S S0 −S
D = µg =
µ mS
Ks +S
)
⇒ S=
DK s
µm − D
2

D
Ks 
M 

⇒ DX = YX /S DS0 −


−
µ
D
m


La velocidad de dilución que maximiza la producción de biomasa se obtiene
de derivar DX con respecto a D e igualar a cero:

Ks

D op ( X ) = µ m 1−

K s + S0





Normalmente Ks<< S0 ⇒Dop(X) →
D = µm , o sea al punto de lavado
Es muy difícil lograr una operación estable para D ≅ µm. Generalmente, se
usa un valor de D algo menor que Dop(X) como solución de compromiso
para mejorar la estabilidad con buena productividad.
Reemplazando la expresión de Dop en la ecuación que da la productividad
de biomasa DX:

D op K s 

DX )op = YXM/ SD op  S0 −


µ
−
D
m
op 

Se obtiene la máxima productividad de biomasa que se puede alcanzar en
un quimiostato en EE, sin metabolismo endógeno y sin formación de
productos extracelulares:

Ks
M

DX )op = YX / Sµ m 1−

K s + S0


 S + K − K K +S
s
s
s
0
 0

(
(
Normalmente Ks<< S0 ⇒DX)op →YX / Sµ mS0
M
))
Efecto del factor de dilución sobre la concentración de células,
D (1/h) S (kg/m )
concentración de sustrato y la productividad.
0.06
0.006
3
0.5
1
3
0.4
0.12
0.24
0.31
0.43
0.53
0.6
0.66
0.69
0.71
0.73
S0
0.8
X (kg/m )
0.3
0.6
0.2
0.4
0.013
0.033
0.04
0.064
0.102
0.122
0.153
0.17
0.221
0.21
X (kg/m3)
0.427
0.434
0.417
0.438
0.422
0.427
0.434
0.422
0.43
0.39
0.352
DX
3
0.1
0.2
3
(kg/h.m
0.3)
S (kg/m )
0
0
0
0.2
0.4
0.6
0.8
-1
D (h )
µm
0.2
0.1
0
0
0.2
0.4
-1
0.6 D (h0.8
)
Algunas aplicaciones de los sistemas continuos:
- producción de algunas proteínas
- tratamiento de efluentes, en particular cuando se emplean
microorganismos o enzimas inmovilizadas.
- producción de etanol
- producción de productos asociados a crecimiento,
especialmente en gran escala (por ejemplo, ácido
láctico)
Modificaciones de los sistemas continuos para emplearse en
bioprocesos
Quimiostato con reciclo
La generación de biomasa es “autocatalitica” mayor
concentracion de biomasa lleva a mayor velocidad de
crecimiento.
Para lograr en un quimiostato una concentración de biomasa
mayor, se pueden reingresar al reactor las células que salen.
Quimiostato con reciclo: el reciclo de células incrementa la
productividad y también la estabilidad en algunos sistemas, dado
que minimiza las perturbaciones (ej.: en tratamiento de efluentes,
muy sujeto generalmente a las variaciones en la alimentación).
Fv
S0,X0,P0
αFv
S1,cX1,P1
V
Gas
α: relación de reciclo
basada en caudales
volumétricos.
Fv(1+α)
c: factor de concentración
S1,X1,P1
relación de la
concentración de
células en la corriente
Fv
de reciclo sobre la que
S1,X2,P1
sale del reactor
Separador de células: puede ser
por filtración, centrifugación o
sedimentación
Balances de biomasa :
 Masa que   Masa que   Masa   Masa   Masa 
 sale del VC   entra al VC   consumida   generada   acumulada 
 con los  −  con los  +  dentro del  −  dentro del  =  dentro del 
 productos   reactivos   V.C.   V.C.   V.C. 

 
 
 
 

(1+ α) FV X1 −
(FV X0 + αFVcX1 )
fresca
− Vµ neta X1 = 0
reciclo
En EE: dX1/dt = 0
y si se alimenta medio
estéril X0=0 ⇒
(
αFv
S1,cX1,P1
Vµ neta X1 = (1+ α ) FV X1 − αFV cX1
µneta = D(1+ α − cα)
)
V
Gas
Fv
S0,X0,P0
Fv(1+α)
S1,X1,P1
Fv
S1,X2,P1
αFv
S1,cX1,P1
Fv
S0,X0,P0
V
µ neta = D[1+ α(1− c)]
Fv(1+α)
S1,X1,P1
Fv
S1,X2,P1
Gas
Como c > 1 ⇒ α(1-c) < 0
µneta < D
Cuando hay reciclo, el
quimiostato puede operar con
una velocidad de dilución
mayor que la de crecimiento
BM sustrato limitante (en EE):
 Masa que sale  Masa consumida  Masa que entra  Masa generada
 =  al V.C. con  + 

 del V.C. con  + 



 los productos   dentro del V.C.   los reactivos   dentro del V.C. 




1
1
(1+ α)FVS1 + Vµg X1 M + Vq P X1
= FVS0 + αFVS1
YX / S
YP /S
Formación de biomasa
Formación de producto
BM sustrato limitante
(en EE y en ausencia de productos extracelulares):
1
1
(1+ α)FVS1 + Vµg X1 M + Vq P X1
= FVS0 + αFVS1
YP /S
YX / S
(
)
D
YXM/S S0 −S1
1
⇒ Vµg X1 M = FV S0 + αS1 − (1+ α )FVS1
YX /S
⇒
X1 =
µg
(
Si k d = 0 ⇒ µ g = µ neta = D[1+ α(1− c)] ⇒
)
X1 =
(
YXM/S S0 −S1
1+ α(1- c )
)
La concentración de células en un quimiostato en EE con reciclo se
incrementa por el factor 1/[1+α(1-c)]
Si es válida Monod
y para kd=0
⇒ S=
K s [1+ α(1-c )]D
µ m −[1+ α(1- c )]D
X1,cr
X1,sr
µg =
µ mS
K s +S
=
µ neta = D[1+ α(1− c)]
⇒

K s [1+ α(1- c)]D 
S −

X1 =
0
[1+ α(1- c)]
µm − [1+ α(1- c )]D 
YXM/S
Velocidad de
generación de
biomasa
Fv
S0,X0,P0
αFv
S1,cX1,P1
Fv(1+α)
S1,X1,P1
c = 2 ; α = 0.5
V
con reciclo
sin reciclo
Gas
Fv
S1,X2,P1
Quimiostatos múltiples en cascada: en algunas fermentaciones,
particularmente para la producción de metabolitos secundarios (ej.:
un antibiótico), conviene separar las etapas de crecimiento de
biomasa y de formación del producto deseado pues las condiciones
óptimas son diferentes
con múltiples quimiostatos, se pueden fijar condiciones
distintas en cada uno: pH, temperatura, conc. de nutrientes
por ejemplo, se pueden ajustar las condiciones para tener:
-Un primer tanque donde se promueva el crecimiento de biomasa
-Un segundo tanque donde se promueva la formación de producto(*)
(*) el crecimiento será desbalanceado y un modelo no-estructurado
no es el más apropiado. Los resultados serán aproximados.
Fv’,S0’,X0’
Quimiostatos múltiples en cascada:
Fv,S0,X0
Primer quimiostato
S1 =
Fv,X2,S2
Fv,X1,S1
K s D1
µm − D1
(
X1 = YXM/S S0 − S1
X1
S1
)
X2
S2
V2
V1
en EE, válido Monod y con metabolismo endógeno despreciable
Segundo quimiostato
BM de biomasa FV X1 − FV X 2 + V2µ neta , 2 X 2 = V2
dX 2
dt
= 0 en EE
 X1 

X 2 − X1 = µ neta , 2 X 2 ⇒ µ neta , 2 = D 2 1 −
 X 
V2

2 
FV
(
)
Como X1 < X2 ⇒
µneta,2 < D2
Ejemplo de aplicación de un sistema multietapa con agregado de una
corriente: cultivo de células modificadas por ingeniería genética
•En general se agregan promotores a los sistemas con células que
contienen ADN recombinante para inducir la producción de la
proteína de interés.
•La presencia del promotor favorece la producción de la proteína
pero reduce la velocidad de crecimiento de las células que contienen
plásmidos, respecto de las que lo han perdido.
un quimiostato de una única etapa tendrá problemas de
inestabilidad genética.
empleando un sistema de 2 etapas:
Primer quimiostato para producción de células (sin promotor)
Segundo quimiostato para producción de la proteína (c/promotor):
Se logra mantener la estabilidad genética por el continuo agregado
de células frescas.
Operación con alimentación semi-continua “Fed-batch”:
En este tipo de sistemas se agregan nutrientes frescos al fermentador
en forma continua o intermitente. Muy apropiado para mitigar
problemas de inhibición por sustrato
Xf,Sf,Pf
S0,X0,P0
Fv,S0 (X0)
V0
X0,S0,P0
1)Carga
Vf
V
Xf,Sf,Pf
3)Recuperación
del producto
X,S,P
2)Realimentación
1) Desde la carga hasta el momento de la realimentación periódica,
el sistema se comporta como un batch: X = X + Y M S − S
0
X /S
(0 )
Xm es la máxima X a alcanzar con S0 , que se da
⇒ X m = YXM/SS0
cuando S << S0 y para la cual también X0 << Xm
Operación con alimentación semi-continua “Fed-batch”:
Cuando X ≅ Xm , se agrega una corriente de
Fv,S0 (X0)
nutrientes frescos con un caudal volumétrico
Fv y de una concentración S0. La variación de
volumen es:
dV
= Fv ⇒ V = V0 + (Fv ) t
dt
V
Durante la realimentación, el BM de biomasa
X,S,P
es:
d(VX )
dX
dV
FV X 0 + Vµneta X =
=V
+X
2)Realimentación
dt
dt
dt
entra + se genera = se acumula
(
)
(
dX FV
X dV
dX
= X 0 + µ neta X −
= DX 0 + X µ neta − D ⇒
≅ X µ neta − D
dt V
V dt
dt
Como el sustrato se consume casi todo ⇒ dX/dt ≅ 0
µ neta ≅ D
(condición de estado cuasi-estacionario). Luego:
Como D ↓ porque ↑ V, µneta va disminuyendo continuamente.
)
Operación con alimentación semi-continua “Fed-batch”:
BM para el sustrato:
Vµ g X Vq X d(VS)
Fv,S0 (X0)
FVS0 −
− P =
dt
YXM/ S YP / S
entra − se consume = se acumula
Si no consideramos la formación de
V
productos y dado que la masa de sustrato
se mantiene siempre
µg (XV )
X,S,P
baja y ≅ constante: FVS0 =
2)Realimentación
YXM/ S
d (XV )
= µneta (XV ) ≅ FVS0 YXM/ S ⇒ (XV ) = X 0 V0 + FVS0 YXM/S t
dt
(es igual en ausencia de metabolismo endógeno)
⇒
Es decir, la masa de células generadas es linealmente proporcional
al tiempo, lo cual se observa experimentalmente en un fed-batch.
Operación con alimentación semi-continua “Fed-batch”:
Variación de las
concentraciones de
biomasa, sustrato y
producto, y de la
velocidad de
crecimiento y volumen
del cultivo en función
del tiempo, para el
primer ciclo de un
reactor alimentado
(fed-batch):
µ (h-1)
V (mL)
1000
X (g/L)
P (g/L)
0.6
V (mL)
800
600
0.4
µ (h )
-1
400
0.2
200
P (g/L)
X (g/L)
0
0
0
0.5
1
1.5
t 2(h)
Sistemas con microorganismos inmovilizados: la inmovilización
de microorganismos tiene aplicación si los productos son
extracelulares
Ventajas sobre los cultivos con células en solución:
•Proveen una alta concentración de células
•Las células se usan en forma continua y se eliminan costosos
procesos de recuperación y reciclo de células
•Se eliminan el problema del “washout” a altas velocidades de
dilución
•Se pueden lograr altas productividades
•Se puede lograr un medio local favorable que conduce a mayores
rendimientos y una mejor performance del biocatalizador
•En algunos casos mejora la estabilidad genética
•En algunos casos disminuye el daño por abrasión de las células
Sistemas con microorganismos inmovilizados
Desventajas respecto de los cultivos en solución:
•El problema más grave es que no se pueden emplear para
productos que no sean excretados de las células
•La inmovilización generalmente conduce a problemas de
limitaciones por transferencia de masa
•El sistema se torna muy heterogéneo por las limitaciones de
transporte y es difícil de controlar
•Si las células están vivas, el crecimiento y la evolución de gases
ocasiona problemas y puede conducir a ruptura del soporte.
Los métodos de inmovilización son similares a los que se utilizan
para enzimas. Se complica con las células vivas.
Activa: captura o unión de células por
Inmovilización
métodos físicos o químicos
Pasiva: formación de biofilms, crecimiento
de múltiples capas de células sobre un
soporte sólido
•También se pueden emplear reactores de membrana, generalmente
tubulares (la estructura se asemeja a un intercambiador de calor de
carcasa y tubos). Los tubos son de una membrana semipermeable.
Las células se inoculan en la carcasa y el sustrato se bombea por los
tubos, a los cuales difunde el producto.
•Un buen soporte debe ser rígido y químicamente inerte; debe
contener a las células firmemente y tener alta capacidad.
Fermentadores: Equipos comúnmente empleados
•Tanques agitados
•Columnas de burbujeo
•Air-lift o reactor de arrastre
•Lechos rellenos
H/D~3–6
Esquema de un tanque agitado
Esquema de una
columna de burbujeo
H/D~1–2
Tanques agitados de escala
laboratorio
Tanques agitados de escala
laboratorio con células
inmobilizadas
Fermentadores comerciales de escala laboratorio (V ~ 2-20 litros)
Global Medical Instrumentation – http://www.gmi-inc.com
Fermentadores de escala banco-piloto (V ~ 15-75 litros)
Fermentadores de
escala piloto
V ~ 100-1000 litros
Biorreactor de
escala piloto
Planta piloto de bioprocesos
Esquema de un tanque
agitado de mayor escala
Variables que se controlan en un biorreactor industrial
Esquema de un fermentador
tipo tanque agitado de escala
industrial (100m3).
H ~ 15 m de alto
D ~ 4,2 m de diámetro
Tiene líneas de vapor
para realizar la
esterilización in situ de
las válvulas, cañerías y
sellos. Se debe esterilizar
también el aire que
ingresa por filtración o
por calentamiento.
Biorreactor de
escala industrial
Reactor tanque industrial
-generalmente de acero inoxidable 316L SS, puede operar presurizado.
-debe minimizar zonas muertas y permitir la inserción de sensores
-relación de aspecto H/D=2.5–3.0 para crecimiento de bacterias porque
mejora la transferencia de oxígeno. Para células animales se usan tanques
de baja relación de aspecto H/D=1.5 para facilitar el mezclado
-se debe poder vaciar
totalmente
-si tiene menos de
500L pueden ser de
vidrio
Reactor tanque agitado: tipos de turbinas empleadas y efectos en la
agitación que inducen
Agitación inducida por turbinas
radiales del tipo Rushton
Agitación inducida por turbinas
axiales
Interior de un
tanque agitado
Reactor tanque agitado: efecto de los baffles
Los baffles mejoran notablemente la turbulencia, rompen los vórtices
que se forman por la agitación. Se los ubica levemente desplazados
de la pared para disminuir la formación de zonas estancas.
Reactor tanque agitado: efecto de los baffles en un reactor de 2L
400rpm – sin baffles
vórtice
400rpm – con baffles
Agitación y distribución de gas en reactores agitados
•La determinación de la velocidad de transferencia de oxígeno y el
calor liberado son claves para el diseño de los fermentadores.
•La velocidad de transferencia de O2 depende de la dispersión de gas,
que es función del tipo de reactor; ej: en tanques agitados, aumenta al
aumentar la velocidad de agitación.
> RPM
Influencia de la velocidad de agitación sobre la turbulencia y la
dispersión de gas inducida por agitación mecánica en un reactor
de laboratorio de 2L.
300 rpm
450 rpm
750 rpm
Fracción gaseosa (adimensional)
Tomografía de una sección del
reactor agitado.
Jets gaseosos de los inyectores de gas
Perfil de velocidades (cm/s) del líquido
en un reactor gas-líquido agitado. Se
observa la formación del vórtice
característico de las turbinas radiales.
Reactor agitado en
suspensión de escala
banco: 20cm de
diámetro y de alto
(volumen ~ 8L)
Reactor tanque agitado:
Problemas ocasionados por
la evolución de espuma:
-peligro de contaminación
-complica la circulación de
gases
vórtice
-complica el mezclado
-cambian las velocidades
de transferencia masa y de
calor
Configuraciones comunes de fermentadores: columnas de burbujeo
Columna de burbujeo de escala banco: V~10L
Columnas de burbujeo
Regímenes de flujo en columnas de
burbujeo: depende del caudal de gas y del
distribuidor que se emplee
Columnas de burbujeo para el
cultivo de algas
Configuraciones comunes de fermentadores
Configuraciones de recirculación interna inducida por el flujo de
aire “Air-lift”
Air-lift con
inserción de
aire en el
tubo central
Air-lift con inserción
de aire en el anillo y
mezclado en el tubo
central
Air-lift con inserción de aire en
el tubo central y recirculación
inducida
Reactor air-lift de
laboratorio con entrada de
aire en el anillo circular
Zona donde se produce la
separación entre el gas que se
libera hacia el exterior del
reactor y el líquido que recircula
Riser: zona donde se hace la
inyección de aire, el flujo es
ascendente y contiene burbujas
Downcomer: zona donde el líquido
desciende, a lo sumo tiene pequeñas
burbujas disueltas
Air-lift vertical con mezclado en el tubo central: perfiles
de velocidades, energía cinética y tensión de deformación
Escala
banco
(0,2 x 2)m
Shear Stress
Kinetic Energy
Reactor de tipo air-lift circulante
Airlifts de forma
triangular para el
cultivo de algas
(planta piloto de
cogeneración de
energía del MIT)
Configuraciones comunes de fermentadores
Reactores de lecho fijo – uso frecuente en tratamiento de efluentes y
en producciones dedicadas
Reactores trickle-beds o de lecho a goteo
Cocorriente
Contracorriente
Columnas de burbujeo
rellenas
Inmovilización pasiva (biofilms):
Los biofilms son grupos de células que crecen en multicapas
sobre soportes sólidos.
•El soporte puede ser inerte o biológicamente activo.
•La formación de biofilms es común en equipos de fermentación
industriales (ej: tratamiento de efluentes y fermentaciones de hongos).
• La interacción entre las células y el soporte puede ser muy compleja.
•Los biofilms presentan ventajas y desventajas similares a las de los
sistemas de microorganismos inmovilizados en forma activa.
•Las condiciones dentro de un biofilm grueso varían con la posición y
afectan la fisiología de las células porque los nutrientes difunden
hacia el interior del film y los productos hacia fuera.
•El espesor del biofilm afecta la performance: biofilms muy finos van
a dar baja velocidad de crecimiento por la baja concentración de
biomasa y los muy gruesos tienen problemas difusionales, que pueden
ser o no un inconveniente, dependiendo de lo que se quiera lograr.
Normalmente existe un espesor de film optimo para el crecimiento de
biomasa y otro para la formación de productos.
Soportes de
biofilms
Soportes de biofilms
Crecimiento del biofilm sobre el
soporte
Estrategias de escalado:
-Multiplicación
-Reglas de uso
-Análisis del régimen
y escalado hacia menor
tamaño
La multiplicación implica
replicar muchas veces el
resultado que se obtiene
en un reactor de escala
relativamente pequeña, en
lugar de llevar a cabo el
proceso en un reactor de
mayor tamaño.
Producción de ácido glucónico
Producción de gluconato de sodio con A. niger
Producción de antibiótico
Producción de lisina (10000 ton/año)
en 20 fermentadores de 250 m3
Producción de vacunas para cólera (Suecia)
Drogas medicinales
Reglas de uso : basadas en análisis dimensional y criterios de
similaridad de algunos parámetros
% de uso en la industria
Criterio de escalado
30
Potencia/Volumen
30
kLaLG
20
Velocidad en la punta del agitador
20
Concentración de oxígeno
Otras: velocidad (rpm) del agitador o impeler; diámetro del
agitador; caudal desplazado por el impeler; caudal desplazado
por el impeler, por unidad de volumen; numero de Reynolds
Análisis del régimen y escalado hacia menor tamaño
Consideraciones a tener en cuenta en el escalado
Factores que
influyen en
el cambio de
escala
Fluidodinámicos
Transporte
régimen de flujo, ∆P/∆Z
mezclado, fracción de gas
kL, aLG, h
Se debe trabajar en el mismo régimen de flujo en las distintas
escalas para que las comparaciones tengan sentido.
Para caracterizar el mezclado, se pueden hacer experiencias de DTR
(Distribución de Tiempos de Residencia)
Se plantean modelos que consideran los distintos factores: fluidodinámica, transporte de masa y calor, cinética simulación del
reactor para predecir el comportamiento en distintas condiciones de
operación.
Se pueden realizar medidas específicas incluso en el reactor en
operación (OTR o coeficientes de transferencia).
Análisis del régimen
y escalado hacia
menor tamaño
La concentración de
oxígeno es diferente en
distintas zonas del
reactor. Se puede simular
considerando varios
reactores con distinta
alimentación de oxígeno
Modelo del sistema que supone
dos compartimientos con distinta
concentración de oxígeno