Sandra clase 2 2010.pdf

APLICACIONES A LA SALUD HUMANA
Alimentación funcional
un alimento puede considerarse “funcional” si
se demuestra satisfactoriamente que, además
de sus efectos nutritivos, afecta
beneficiosamente a una o más funciones del
organismo de modo que mejora el
estado de salud o bienestar o reduce el riesgo
de enfermedad
Ingredientes funcionales de naturaleza proteica
TABLA: Productos farmacéuticos aplicados a la salud humana y
que provienen de organismos genéticamente modificados
Sistema de
producción
Indicación terapeutica
Factor VIII
Cultivo de células de
mamífero
Hemofilia A
Factor IX
Cultivo de células de
mamífero
Hemofilia B
Factor VIIa
Cultivo de células de
mamífero
Ciertas formas de hemofilia
Activador del
plasminógeno tisular
Cultivo de células de
mamífero
Infarto de miocardio
Activador del
plasminógeno tisular
E. coli
Infarto de miocardio
Hirudina
Levaduras
Trombocitopenia y prevención
de trombosis
Producto
Factores de coagulación
Anticoagulantes
Hormonas
Insulina
Levaduras
Diabetes mellitus
E. coli
Hormona de crecimiento
E. coli
Deficiencia de la hormona en niños,
acromegalia, síndrome de Turner
Folículo-estimulante
Cultivo de
células de
mamífero
Infertilidad, anovulación y
superovulación
Paratiróidea
E. coli
Osteoporosis
Gonadotrofina coriónica
Cultivo de
células de
mamífero
Reproducción asistida
Tirotrofina
Cultivo de
células de
mamífero
Detección /tratamiento de cáncer de
tiroides
Luteinizante
Cultivo de
células de
mamífero
Ciertas formas de infertilidad
Calcitonina
E. coli
Enfermedad de Paget
Glucagon
Levaduras
Hipoglucemia
Anticuerpos monoclonales
recombinantes
Fuente: Nature Biotechnology, 2003, vol. 21 Nº8
Anti-IgE (recombinante)
Cultivo de células de
mamífero
Asma
Anti-TNF (recombinante)
Cultivo de células de
mamífero
Arthritis reumatoidea
Anti-IL2
Cultivo de células de
mamífero
Prevención del rechazo agudo de
transplante de riñón
Proteína morfogénica del
hueso-2
Cultivo de células de
mamífero
Fractura de tibia
Galactosidasa
Cultivo de células de
mamífero
Enfermedad de Fabry (deficiencia en
alfa-galactosidasa)
Iaronidasa
Cultivo de células de
mamífero
Mucopolisacaridosis
Proteína C
Cultivo de células de
mamífero
Sepsis severa
Beta-glucocerebrosidasa
E. coli
Enfermedad de Gaucher
DNAsa
Cultivo de células de
mamífero
Fibrosis quística
Otros productos
recombinantes
Factores hematopoyéticos
Eritropoyetina (EPO)
Cultivo de
células de
mamífero
Anemia
Factor estimulante de colonias de
granulocitos/macrófagos (GM-CSF)
E. coli
Netropenia, transplante autólogo de
médula
Interferón alfa (IFN alfa)
E. coli
Hepatitis B y C, distintos tipos de
cáncer
Interferón beta (IFN beta)
Cultivo de
células de
mamífero
Esclerosis múltiple
Interferón gamma (IFN gamma 1b)
E. coli
Enfermedad granulomatosa crónica
Interleuquina 2 (IL-2)
E. coli
Cáncer de riñón
Interferón e interleuquinas
Vacunas
Anti-hepatitis B
Levaduras
Inmunización contra la hepatitis B
Anti-hepatitis A
Levaduras
Inmunización contra la hepatitis A
Anti-enfermedad de Lyme
E. coli
Inmunización contra la enfermedad de
Fuente: Nature Biotechnology, 2003, vol. 21
Lyme
• VACUNAS → origen siglo XVIII, exposición
voluntaria a agente infeccioso era beneficiosa.
Generaba Protección a reinfección
• Inmunidad: respuesta del sistema inmunológico
→ memoria inmunológica
Edward Jenner (médico británico) inventó
en 1796 la primera vacuna contra la
viruela.
El experimento consistió en inyectar a un
niño de 8 años la vacuna procedente de
una pústula del brazo de una ordeñadora
(contagiada x VACA) a través de dos
cortes superficiales en el brazo,
consiguiendo inmunizar al niño ante la
viruela humana.
Cronograma de aparición de las principales vacunas
de uso humano:
- 1796: Vacunación contra la viruela
- 1885: Vacuna contra la rabia
- 1925: Toxoide diftérico, Toxoide tetánico y tos combulsa
- 1937: Vacuna contra la fiebre amarilla
- 1943: Vacuna contra influenza
- 1954: Vacuna inactivada contra virus de la polio
- 1956: Vacuna viva atenuada contra virus de la polio
- 1960: Vacuna contra el sarampión
- 1966: Vacuna contra la rubeóla
- 1975: Vacuna contra hepatitis B
- 1980: Viruela erradicada
- 1986: Primera vacuna recombinante (hepatitis B)
- 1988: Vacuna conjugada contra H. influenzae B
Inmunogénica: molécula capaz de
despertar una respuesta en el
sistema inmune y producir memoria
inmunológica
Inmunización: procedimiento para
generar inmunidad
Antígeno: molécula Inmunogénica, se aisla del
agente patógeno → identificar antígenos
responsables y eliminar componentes patogénicos
Objetivo: PREVENCIÓN
¿Que tipos de vacunas existen?
Clasificación de las vacunas: Preparados de antígenos que
introducidos en el organismos son capaces de estimular el sistema
inmunitario e inducir una respuesta protectora
•Atenuadas : Utilizan microorganismos relacionados a los
patógenos pero modificados para que no puedan generar la
enfermedad.
•Inactivadas: Utilizan los microorganismos patógenos pero
muertos.
•Subunidades: No utilizan los microorganismos patógenos
sino que sólo alguno de sus componentes.
•Recombinantes: Se utiliza la manipulación genética para
producir alguno de los componentes del patógeno en un
organismo inofensivo.
•ADN: El gen que codifica para el antígeno es introducido en
el organismo a ser vacunado y él mismo produce el antígeno
a partir de ese gen
Respuesta inmune en la vacunación contra polio
Clasificación de Vacunas, Criterios Microbiológicos:
VACUNAS Atenuadas o Vivas: Microorganismos vivos que multiplican
con reducida patogenicidad (infección leve, BCG, fiebre tifoidea oral,
colérica oral)
VACUNAS Inactivas o Muertas:
Microorganismos enteros muertos no multiplican tratados por medios
físicos o químicos para eliminar su infectividad, manteniendo su
capacidad inmunogénica pertussis, fiebre tifoidea parenteral
CONSTITUIDAS POR ANTÍGENOS PURIFICADOS
TOXOIDES: toxinas inactivadas (tetánica, difterica)
POLISACARIDOS DE LA CAPSULA (neumococo)
POLISACARIDOS CAPSULARES CONJUGADOS CON
PROTEÍNAS ANTIGÉNICAS (meningococo, neumococo)
FRACCIONES BACTERIANAS (tos ferina)
Los nuevos procedimientos de fermentación y
purificación que han permitido la producción de
vacunas a base de subunidades purificadas como
son, entre otras, las vacunas de:
· Pertusis acelular, subcomponentes proteicos
purificados,
· Salmonella typhi, polisacárido capsular Vi,
· N. meningitidis grupos A y C, polisacáridos
capsulares,
· Streptococcus pneumoniae (23-valente),
polisacáridos capsulares,
· Haemophilus influenzae tipo b conjugada,
· N. meningitidis grupos A y C conjugadas
Vacunas antitifoideas (Salmonella typhi y S. paratyphi)
provocan cuadros sépticos
Yersinia pestis
vector de la peste bubónica : la pulga
Pulex irritans
células enteras inactivadas de Y. pestis
(vacuna Greer)
personas que por su trabajo están en
contacto directo y continuado con
roedores infectados como son biólogos
No hay signos propagación de
la peste que mató a un
científico en EE.UU
Monovalentes: una única
especie un antigeno
Polivalentes: única especie de
distintos antígenos
Combinadas: varias especies
• Doble bacteriana (dT): difteria + tétanos.
• Triple bacteriana celular y acelular (DTP/Pa): difteria + tétanos
+pertussis.
• Cuádruple celular y acelular (DTP/Pa + Hib): difteria + tétanos +
pertussis + Haemophilus influenzae b.
• Quíntuple celular y acelular (cuádruple + IPV): DTP/Pa + Hib +
poliomelitis inactivada.
• Quíntuple celular (cuádruple + HB): DTP + Hib + hepatitis B.
1. Investigación pre-clínica se prueban la pureza y su seguridad en
animales
2. Estudios clínicos en humanos:
• Fase I: pequeño grupo de voluntarios que habitan fuera del área
endémica. evalua la seguridad y potencia de la vacuna.
• Fase II: análisis de la respuesta inmune de los voluntarios.
• Fase III: son pruebas “de campo”, se realizan con comunidades que
habitan en áreas endémicas. Seguimiento clínico de los individuos
vacunados.
3. Período de licencia procedimientos legales y administrativos apartir
de los resultados obtenidos en las etapas anteriores para la aprobación
(licencia) y registro de la vacuna.
4. Relevamiento post-licencia evalua la vacuna durante algunos años.
Se estudian los cambios en la incidencia de la enfermedad y en la
transmisión y se registran los casos de reacciones indeseables. Sólo
después de esta etapa se considera o no la inclusión de la vacuna en
los planes de vacunación de la región.
Bondades de una vacuna ideal
•
•
•
•
Precio competitivo.
Inocuidad.
Estabilidad física y genética.
Posible inmunización simultánea contra múltiples
componentes protectores de diversos patógenos.
• Protección de larga duración con 1 sola dosis VO.
• Inducción de inmunidad mucosal en máximo 2
semanas.
• Estimulación de respuesta inmune humoral y
celular a nivel sistémico.
El papel de la biotecnología en el desarrollo de vacunas
Problemas
i) no todos los agentes infecciosos son fáciles de crecer
en las condiciones normales de cultivo
ii) el trabajar con los agentes infecciosos requiere de
medidas de seguridad muy elevadas
iii) no todas las enfermedades infecciosas son prevenibles
por este tipo de vacunas;
iv) los agentes infecciosos usados en la producción de la
vacuna pueden estar insuficientemente atenuados o
muertos y por lo tanto pueden introducir la virulencia a la
vacuna;
v) componentes tóxicos de los agentes pueden no estar
completamente inactivados y mantener la toxicidad en la
vacuna final
El papel de la biotecnología en el desarrollo de vacunas
Soluciones
a) identificar genes de virulencia y por lo tanto facilitar su
deleción en los agentes infecciosos creando clones
avirulentos pero que mantienen su habilidad de estimular
la respuesta inmune;
b) crear sistemas vivos no-patogénicos que acarreen los
determinantes antigénicos de un patógeno específico o de
varios;
c) para aquellos agentes de difícil crecimiento, se pueden
aislar los genes de las proteínas que contienen los
determinantes antigénicos críticos para la inmunidad y
expresarlos en otro huésped de mas fácil crecimiento
(bacteria)
VACUNAS COMERCIALIZADAS
Las vacunas recombinantes de tipo I
(subunidad) producto del gen expresado en
bacteria, es cosechado, purificado y administrado
como una vacuna
Ej: lipoproteína superficie externa OspA de Borrelia
burgdorferi para enfermedad de Lyme (fiebre
recurrente) transmitida por la picadura de una
garrapata
Recombitek® Lyme-Merial , LYMErix®, de
GlaxoSmithKline; ImuLyme®, de Aventis Pasteur
Las vacunas recombinantes de tipo II (de gen
deletado) vacunas con genes deletados asociados
con la virulencia o patogenicidad de una bacteria
patógeno;
Ej: ensayos clínicos vacuna de cepas estables del
agente del cólera (Vibrio cholerae).
Las vacunas recombinantes de tipo III
(vectoriales) consisten de organismos no
patogénicos o de gen deletado en el que se
inserta un material genético específico de otro
patógeno
Ej: Salmonella, Mycobacterium
– La Salmonella viva entérica atenuada es útil
como portadora de antígenos heterólogos
para la vacunación , la eficacia de estas fue
demostrada con experimentos de vacunación
usando antígenos protectores de Lysteria
Monocytogenes.
• Cumplir normativa sobre ecotoxicidad (Directiva
2001/82/CE y 2001/18/EC -Annex II- ):
– Estudio de virulencia en situaciones de riesgo en
diferentes especies (tanto diana como no diana).
– Estudio de posible transmisión horizontal y
recombinación potencial del vector vacunal o de parte
de él.
– Estudio de especificidad de especie diana.
– Estudio de la posible instalación en el ambiente.
– Método validado para poder distinguir entre vacuna y
microorganismo “salvaje”, especialmente en
situaciones de planes de control y erradicación de la
enfermedad.
– Utilización de datos obtenidos de ensayos realizados
con el mismo vector pero acompañado de otras
secuencias.
Lo que viene…
inyectado directamente en las células, in vivo, donde luego
es traducido y expresado induciendo la respuesta inmune
Gene-gun para
Vacunas a ADN
Inmunización
transcutánea
• Existen riesgos asociados:
– Integración potencial del plásmido en el genoma de las
células hospedadoras.
– Inducción potencial de anticuerpos contra ADN del
plásmido inyectado.
– Problema de conformación no nativa de proteinas
bacterianas en vacunas con ADN inoculadas en
animales.
– Liberación accidental de las construcciones de ADN
desnudo pueden favorecer transferencia horizontal de
genes
• Existen beneficios asociados:
– Efectivas en modelos animales sin necesidad de
adyuvantes o sistemas de administración.
– Solo expresan genes que inducen inmunidad.
– Las produce el mismo animal, siguiendo las
instrucciones del gen insertado en el plásmido de
expresión.
– Menor dependencia de la cadena de frío que las
vacunas con proteínas.
VACUNAS COMESTIBLES
Vacunas orales
Vehículos: células enteras LAB
o esporas Bacillus
sobrevivir aparato gastrointestinal
•retención de 2 a 3 días
•Vehículo de baja inmunogenicidad
Protección contra efecto
•propiedades adyuvantes
mortal de toxina del tétanos
con cepas produciendo
•Sistemas genéticos (Food-Grade)
dosis más alta del antígeno
•No necesita aislamiento y purificación
del vivas
antígeno
y con bacterias
recombinantes de
•producción IgA
Lactobacillus plantarum Infect
2001 Mar;69(3):1547-53
•administración fácil, evita usoImmun.
agujas
DIAGNOSTICO
Enfermedades infecciosas:
Técnicas basadas en ADN
PCR, microarray
No requiere aislar el patógeno
Evaluación de la transcripción en la escala genómica con microarrays de DNA
que son placas de vidrio o membranas que contienen un mosaico ordenado del
genoma entero como colección de oligonucleotidos (oligonucleotide microarrays) o
productos de PCR de genes individuales (referidos comúnmente como microarrays
del cDNA).
DIAGNOSTICO
PHAGE TYPING
Tipificación a nivel de especie de patógenos Salmonella y
Staphylococcus aureus, Shiga toxin-producing E. coli, Listeria
monocytogenes
Formulaciones de bacterias lácticas en iniciadores o straters para
industria lactea y ensilados
Diagnóstico
APLICACIONES
Fagos en biocontrol: Ventajas del empleo
Historia segura: distribuidos en la naturaleza en múltiples ecosistemas
Comensales naturales de humanos y animales
Extensamente usados clínicamente en Europa oriental
Genética simple: versátiles
Altamente activos y específicos: No presentan efectos secundarios en la
microbiota intestinal. Inocuos para células de mamíferos.
Autoreplicativos.
Activos contra biofilms.
Herramientas útiles para biopreservación y phage therapy
Fuente de potentes antimicrobianos: Endolisisnas y otras enzimas que
hidrolizan Peptidoglicano
Phage Therapy (bacteriófagos)
(i) Efectivo contra multidrug-resistant pathogenic bacteria;
(ii) sustitución de la microflora normal no ocurre pues fago mata solo su
blanco específico
(iii) Menores costos de desarrollo y producción
(iv) Sin efectos secundarios
En Agosto 2006, la Food and Drug Administration (FDA) aprobo el uso de fagos
para el tratamiento de ready-to-eat meat: una combinación de seis viruses
diseñados como spray para erradicar cepas de Listeria monocytogenes
DIAGNOSTICO
Biosensores
dispositivo de análisis que utiliza un ser vivo o un producto derivado de éste
modificar específicamente una sustancia contenida en una mezcla aparición de
color o fluorescencia, luz, generación de calor o por producción de algún
compuesto fácil de analizar
Biosensor glucosa para diabéticos basado en glucosa oxidasa (hongos)
membrana selectiva
señal electrónica que
puede ser procesada
por el detector.
Ensayos para detectar presencia de contaminantes
Ensayos para detectar presencia de contaminantes
Polycyclic aromatic
hydrocarbons (PAH)
Control
con Naftaleno
Control
con Naftaleno
Monitoreo con Bacterias sustancias genotóxicas son mutágenos,
correlación positiva entre agentes genotóxicos y carcinogénicos
Mutaciones (daño a DNA) fácil detección (cambio en requerimiento nutricional,
activación transcripcional)
• Detección de sustancias genotóxicas
• Biosensores de toxicidad aguda y presencia de contaminantes
Ventajas Empleo de Bacterias:
ensayos a corto plazo, ciclos de vida cortos
fácil mantenimiento con bajo costo económico
cada ensayo expone un número grande de células
poblaciones muy homogéneas
Desventajas:
problema de la extrapolación de los resultados a eucarióticos
pluricelulares.
Aplicación:
No deben ser empleados de forma aislada, sino varios conjuntamente,
evaluación más fiable de la capacidad tóxica de compuestos o muestras
ambientales.
Ensayos para detectar toxicidad aguda
Ensayos basados en la reducción de la intensidad luminosa:
El principal ensayo de este tipo es el ensayo Microtox
Sustancia tóxica que reduzca respiración producirá un decremento de
la luminiscencia. Porcentaje de perdida de intensidad luminosa
respecto al control indica grado de toxicidad. Base de datos de
valores Microtox EC50 (en mg/l)
Vibrio fischeri NRRL B-11177
1979 "The Use of Luminescent Bacteria for Determining Toxicity in Aquatic Environments"
Ensayos para detectar toxicidad aguda
Ensayos basados en la inhibición del crecimiento y de la viabilidad
de las bacterias.
Criterios de determinación de un efecto tóxico son variados:
• El más empleado es la inhibición del crecimiento bacteriano que se
puede valorar mediante técnicas de recuento en placa
[Liu, Tox. Assess., 2: 463 (1987)]
• La medida de la turbidez de un cultivo
[Dutka y Kwan, Environ. Pollut. Ser A, 29: 125 (1982)].
• También son muy empleados los ensayos respirométricos basados en
la determinación del consumo de oxígeno por parte de un cultivo
bacteriano o en la reducción de colorantes de tetrazolio asociada a la
cadena respiratoria microbiana
[Pérez-García y cols., Bull. Environ. Contam. Toxicol., 50: 703 (1993)].
.
Ensayos para detectar toxicidad aguda
REVERTANTES
Ensayos bacterianos para la detección de sustancias genotóxicas
Ensayos de reversión o retromutación
Test de Ames
Salmonella typhimurium auxotrofas para histidina son expuestas a
sustancias mutagénicas, se producirá una reversión a la prototrofia de las
mismas, que puede ser evaluada mediante recuento en un medio mínimo
deficiente en histidina.
Con un mutágeno químico la tasa de reversión a His + estará altamente
aumentada. Número limitado de divisiones celulares, necesario para la
mutagénesis.
Dado que la reversión es desde la mutación a la prototrofía que presenta
un fenotipo fácilmente observable por crecimiento en medio mínimo, es
posible distinguir los revertantes directamente sin necesidad de realizar un
rastreo de mutaciones por replica plating.
Resultados en 48hs
[Maron y Ames, Mutat. Res., 113, 173 (1983)].
his His- no sintetiza histidina,
ΔuvrB UvrB- no posee sistema de excisión-reparación de ADN,
Δbio Bio- requiere biotina,
rfa LPS- perdida de lipopolisacarido y aumento permeabilidad,
factor R (pKM101) porta mucA,mucB
Tipos de mutaciones: transiciones/transversiones (crosslinking Mitomicina C);
cambio marco lectura (intercalantes Acridina, Bromuro Etidio); sustitución de par
de bases (alquilantes o analogos de base)
Dos variantes del método son posibles.
1) Una versión simple es el Spot Test para reversiones que sirve como
método previo de rastreo de potenciales mutágenos. Un resultado positivo
en el spot test requerirá un análisis más profundo con la determinación de
curvas de dosis-respuesta (concentración vs. revertantes) por el método de
incorporación en placa.
El ensayo de incorporación en placa permite realizar pruebas a distintas
concentraciones de compuesto que se encuentra incluido en el agar.
Ensayos bacterianos para la detección de sustancias genotóxicas
Test de Ames.
Muchos compuestos químicos no son carcinogénicos (o
mutagénicos) a menos que sean metabolizados a sustancias
activas.
En las personas o animales estas conversiones metabólicas a
carcinógenos activos ocurren principalmente en el hígado. Es
por eso, que para aumentar la conversión de potenciales
mutágenos o carcinógenos químicos a sus formas activas, los
agentes que se testan en el test de Ames son tratados con un
homogenato de hígado de rata (fracción microsomal S9)
antes de su adición al medio de cultivo
Ensayos bacterianos para la detección de sustancias genotóxicas
Ensayos bacterianos para la detección de sustancias genotóxicas
Ensayos bacterianos para la detección de sustancias genotóxicas
Ensayos de mutagenicidad basados en inducción
transcripcional de gen reporter
•Ensayos de genotoxicidad basados en el sistema SOS de
reparación de daños genéticos.
La expresión de un gen del sistema SOS (dinD, recA, sfi) puede ser
medida directamente por medio de su fusión con el gen lacZ, el gen
estructural de la ß-galactosidasa en Escherichia coli.
Mutaciones adicionales:
uvrA: no repara por excision y prolonga la respuesta SOS
rfa: LPS defectivo aumenta permeabilidad de moléculas
Resultados en 2 horas
[Llagostera et al., Environ. Mutag. 8, 571 (1986)].
Sistema SOS
RecA
coproteolisis
LexA-LexA
Olex
LexA
⊕ ss DNA
Olex
RecA
Olex
UvrA
Olex UmuDC
OTROS GENES RecF
RecBCD, Sfib, CI(λ )
RECOMBINACION
Ensayos bacterianos para la detección de sustancias genotóxicas
Ensayo SOS Chromotest, las cepas de E. coli se mezclan
con las sustancias a ensayar, determinándose tras un
periodo de incubación de 2 horas los niveles de ßgalactosidasa.
Enzima se mide con sustrato cromogénico
Color amarillo Abs 420 nm
sustancias son genotóxicas ocasionan un aumento en los
niveles de ß-galactosidasa respecto a los controles, pues
se inducen los genes de mecanismo SOS
Ensayos bacterianos para la detección de sustancias genotóxicas
Ensayos de mutagenicidad basados en inducción
transcripcional de gen reporter
•Ensayos de genotoxicidad basados en el sistema SOS de
reparación de daños genéticos.
La expresión de un gen del sistema SOS (recA, uvrA) puede ser
medida directamente por medio de su fusión con luxCDABE, operon de
la luciferasa bacteriana.
Mutaciones adicionales:
uvrB: no repara por excision y prolonga la respuesta SOS
rfa: LPS defectivo aumenta permeabilidad de moléculas
tolC: previene efflux de químicos
[Van Dyk et al., Appl Environ Microbiol. 60:1414-20 (1994);63:2566-71(1997)].
Ensayos bacterianos para la detección de sustancias genotóxicas
Ensayo Vitotox Salmonella typhimurium TA104
Ventaja respecto a Ames
DNA entero es blanco del
genotóxico en contraste con la
mutación de un único gen del
test original Ames (his).
Resulta mucho más sensible (1000 veces) requiriendo concentraciones
significativamente menores de tóxico para verificar respuesta