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Conceptos y Técnicas de Biotecnología I
Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Guía Trabajos Prácticos 2011
Docentes: Alvarez Heduán, Facundo; Morgenfeld, Mauro;
Perez Castro, Carolina, Wirth Sonia
Trabajo Práctico N°1:
PRODUCCIÓN DE AMILASAS FÚNGICAS
Objetivos:
1. Aislar cepas fúngicas capaces de producir amilasas.
2. Producir extractos enzimáticos con actividad amilasa.
3. Inmovilizar los extractos enzimáticos conservando su actividad.
4. Determinar la actividad hidrolítica del almidón en los extractos de cada cepa.
5. Evaluar el rendimiento del proceso de inmovilización
Introducción:
La molécula de almidón puede ser degradada por un conjunto de enzimas que incluyen: amilasa, -amilasa, glucoamilasa y enzimas desramificadoras. Cada una de dichas enzimas posee
una actividad característica, generando diferentes productos como se muestra en la figura.
Las amilasas, tanto de origen fúngico como bacteriano, son producidas a gran escala para
su utilización en la industria alimenticia y de la producción de combustibles. Sus usos más
importantes incluyen:
 Hidrólisis parcial del almidón para generar dextrinas utilizadas como espesantes;
 Obtención de jarabe de alta maltosa (Glu-Glu) utilizado en la fabricación de numerosas
confituras (dulces, helados y tortas entre otros);
 Obtención de jarabes de alta glucosa utilizados en la fabricación de cerveza, panes y
repostería, confituras y bebidas no alcohólicas;
 Remoción del almidón utilizado como apresto en la industria textil;
 Hidrólisis parcial del almidón en la industria panadera para la liberación de glucosa, sustrato
de fermentación de las levaduras para producir el leudamiento de la masa;
 Hidrólisis del almidón para ser utilizado como fuente de carbono en diversas fermentaciones, entre
ellas la producción de etanol para uso alimenticio y combustible.
Guía Trabajos Prácticos #1
Conceptos y Técnicas de Biotecnología 2011
Diseño Experimental
 Parte I: Aislamiento y Screening de los hongos productores de amilasas
Día 1: Aislamiento
Se colocan semillas en placas de Petri sconteniendo medio de agar sólido (YPD) conteniendo
5 % NaCl (para evitar el desarrollo de especies del grupo Mucorales) y 0.01 % tetraciclina (antibiótico
que inhibe el crecimiento bacteriano). Se colocan 4 semillas por caja de Petri. Se incuba a 28°C
durante 7 días.
Día 2: Screening de cepas productoras de amilasas
Las colonias de hongos (preferentemente las verdes sobre las negras o blancas) se repican
con un escarbadiente o ansa estéril en paralelo por un lado en cajas de Petri con agar YPD y por otro
en cajas de Petri con medio sólido de almidón 1 % y ágar 2%. Se incuba a 28°C durante 4-7 días.
Día 3: Screening de cepas productoras de amilasas (2ª parte)
Las cepas productoras de enzimas hidrolíticas del almidón se detectan observando el halo de
degradación del almidón (círculo claro alrededor de la colonia). Para facilitar la detección, se revela la
presencia de almidón en el medio por el agregado de solución de I2/KI (0.026 % I2 + 0.26 % KI) que se
acompleja con el polisacárido dando una coloración azul.
 Parte II: Producción de amilasas
Día 3: Producción de esporas
Las colonias con actividad amilásica se repican en tubos en pico de flauta conteniendo medio
de 5 % salvado triturado y agar 2 %. Se estría con ansa cada colonia en un pico de flauta. Se incuba a
28°C durante 5 días.
Día 4: Producción de enzimas por fermentación en sustrato sólido
Las esporas de cada pico de flauta se resuspenden en 5 mL de solución acuosa de Sarkosyl
0.05 %. Se inocula 1 mL de la suspensión de esporas en Erlenmeyers de 250 mL conteniendo 5 g de
salvado y 5 mL de agua destilada. Se incuba a 28°C durante 5 días.
Día 5: Extracción de las enzimas
La enzimas extracelulares producidas en la fermentación del salvado por el hongo se extraen
con 50 mL de NaCl 1 %. Agitar durante 30 min a temperatura ambiente. Filtrar por papel de filtro y
conservar el eluido.
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Conceptos y Técnicas de Biotecnología 2011
 Parte III: Inmovilización Enzimática
Día 5: Inmovilización enzimática
El extracto enzimático se inmoviliza con alginato de sodio. El alginato es un polisacárido soluble
en agua producido por algas. En una solución con iones divalentes, como el Ca2+, el alginato
polimeriza ya que los iones producen entrecruzamiento de los polisacáridos. Al polimerizar una
solución de alginato conteniendo enzimas estas quedan atrapadas dentro de las esferas que se
generan.
Para la inmovilización se colocan 10 mL del extracto enzimático en un vaso de precipitado. se
agregan 100 mg de alginato de sodio (1.0 % final) y se homogeiniza. Con pipeta automática de 1ml se
hace gotear la solución en un vaso de precipitado conteniendo solución de CaCl2 200 mM contando las
gotas de forma de poder estimar el número de gotas equivalente a 1ml. Se producen esferas de 3-5
mm de diámetro que polimerizan al entrar en contacto con la solución de CaCl2. Las esferas se
estabilizan durante 1 h en la solución de CaCl2 a temperatura ambiente. Las esferas se lavan con
buffer acetato 0.1 M, pH: 5.
 Parte IV: Medición de la actividad enzimática
Día 5: Medición de la actividad enzimática
La actividad amilásica se determinará utilizando almidón como sustrato. Se cuantificará la
desaparición del sustrato a partir de un test colorimétrico basado en la reacción del Yodo con el
almidón mediante espectrofotometría.
La solución de sustrato consiste en una solución de almidón tamponada (0,1 % almidón, 0.15
M NaCl, 0,1 M acetato de sodio pH 5.0).
Cada grupo dispondrá de dos tubos falcon con 25ml de sustrato rotulados con el número de cepa y el
tipo de extracto a evaluar (soluble o inmovilizado). Los tubos se colocarán en un baño térmico a 28ºC
al menos 5´ antes de largar la reacción. Se tomará 0,5ml
La reacción enzimática se detiene por el agregado de un revelador (0.006 % I2 + 0.06 % KI en
HCl 0.02 M) del almidón remanente en la solución de incubación. El iodo de la solución de I2/IK se
acompleja con la amilosa nativa, con su estructura tridimensional intacta. El complejo iodo-amilosa se
cuantifica midiendo la absorbancia a 640 nm con un espectrofotómetro.
La reacción consiste en incubar 0,5mL de extracto enzimático (soluble o su equivalente s
inmovilizado en esferas) con 25 mL de solución de sustrato. La incubación se realiza a 37°C y se
detiene por el agregado de 1 V de solución revelador. El protocolo se detalla a continuación:
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Conceptos y Técnicas de Biotecnología 2011
Para cada cepa seleccionada:
1)
Disponer falcon con 25ml de Sustrato en baño termostático a 28ºC
2)
Disponer 5 tubos eppendorf con 0,5ml de Revelador rotulados: 0, 5, 10, 20 y 40
3)
Trasvasar 0,5ml de Sustrato al tubo 0
4) Agregar 0,5 ml de extracto enzimático (o su equivalente en extracto inmovilizado) al
falcon con sustrato, mezclar por inversión y prender cronómetro (t0)
5)
Repetir paso 4) a los 5, 10, 20, y 40´ con los tubos eppendorf respectivos (5, 10, 20 y 40).
6)
Leer absorvancia 640nmCentrifugar
 Paralelamente se realizará una curva de calibración con diluciones de almidón en el
rango 0,1%-0%. Para cada punto se agregará 1V de Revelador y se determinará la
absorvancia a 640nm.
 Unidad Amilolítica: es la cantidad de enzima capaz de degradar 1mg de almidón en 1
minuto en las condiciones de reacción dadas (28ºC, almidón 0,1% , pH, etc, )
Curva Patrón Almidón:
%
Almidón mg/ml
mg
1
Abs.
2
640 nm
prom.
0,1
1
25
0,08 0,06 0,04 0,02
0,8
0,6
0,4
0,2
20
15
10
5
0
0
0
A partir de estos datos se determinará la constante que vincula Abs con [Almidón]
Datos Extractos:
Abs 640nm
Cepa
#
Tipo extracto
0´
5´
10´ 20´ 40´
mg Almidón
0´
5´
10´ 20´ 40´
SOLUBLE
promedio
INMOVILIZADO
promedio
A partir de estos datos se determinará la cantidad de UA obtenidas en extracto así como su aactividad
específica (UA/ ml) así como el rendimiento obtenido en el proceso de inmovilización (%)
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