CARACTERIZACIÓN CONDUCTUAL Y CELULAR EN RATAS

CARACTERIZACIÓN CONDUCTUAL Y CELULAR EN RATAS HEMBRAS Y
MACHOS LESIONADAS CON ACIDO KAINICO
Mendoza M.S a. y Giordano M.b
Departamento de Neurobiología Conductual y Cognitiva. Instituto de Neurobiología,
Universidad Nacional Autónoma de México, campus Juriquilla. Km. 15.5, carretera
Qro-SLP; Juriquilla. C.P. 76230, Querétaro, Qro. a [email protected],
b
[email protected]
RESUMEN
Las lesiones excitotóxicas estriatales con ácido kaínico (AK) inducen pérdida celular acompañada por
cambios neuroquímicos y alteraciones conductuales que asemejan la enfermedad de Huntington; en la
rata se observa un aumento en la locomoción durante la fase oscura del ciclo, así como, deterioro en
aprendizaje, memoria y disminución de peso. Una dosis de 5nmol induce cambios histológicos,
conductuales y cognitivos. Sin embargo el índice de mortandad es alto. El propósito de este experimento
fue evaluar la respuesta conductual e histológica a una dosis menor de AK (3nmol). Se usaran 13 ratas
macho y 16 ratas hembra de la cepa Sprague-Dawley, mantenidas en ciclo normal (12:12). Después de la
administración intraestriatal de AK se registró el peso durante una semana: al séptimo y trigésimo día se
evalúo la actividad locomotora y luego se perfundió a los animales y se hizo análisis histológico. Los
resultados indican un cambio significativo en la conducta locomotora a los 7 y 30 días y una recuperación
del peso durante los siguientes 7 días después de la lesión. El análisis histológico con tinción de Nissl y
citocromo oxidasa muestra el área de la lesión y la inmunohistoquímica revela un decremento en la
cantidad de neuronas y un aumento de células gliales. Estos resultados indican que esta dosis de AK es
suficiente para inducir cambios conductuales y pérdida neuronal, con bajo índice de mortandad.
INTRODUCCION
Los principales componentes de los ganglios basales son: el cuepo estriado, globo palido, la
sustancia nigra y el núcleo subtálamico (Albin et al.,1989; Parent and Hazrati, 1995).
Al estriado se le relaciona con diversas funciones motoras tales como la regulación de la postura,
la iniciación y el control del movimiento, la ejecución automática de movimientos motores aprendidos y a
un la transformación de una decisión o un movimiento. Por otra parte se ha retomado su participación en
diversas funciones cognitivas, tales como la memoria, aprendizaje y la elaboración de la estrategia de
aprendizaje, teniendo además la capacidad de realizar un alto nivel de integración (Divac & Oberg, 1979,
Divac, 1991, Graybiel, 1998).
La disfunción del núcleo estriado se presenta en la enfermedad de Huntington (EH) y en estudios
patológicos se puede observar como signo característico una importante atrofia de forma bilateral. La
atrofia del núcleo lleva consigo un aumento en el volumen de los ventrículos laterales. A nivel celular,
las neuronas medianas espinosas son las primeras en afectarse con una pérdida de dendritas inicialmente.
Esta pérdida celular es suplida por astrocitos fibrosos, tanto en estriado como en corteza cerebral (Harper,
1996).
Existen diversos modelos experimentales de la EH generados por el daño celular estriatal
mediante agentes excitotóxicos, tales como el ácido quinolínico, el ácido 3 nitropropiónico y el ácido
kaínico. Este último, cuyo receptor forma parte de la familia glutamatérgica, va a generar muerte celular
por excitotoxicidad mediante citolisis y liberación de deshidrogenada láctica, siendo un proceso
dependiente del calcio extracelular (Coyle et al., 1991).
Existen muchos trabajos en los cuales administran AK directamente en el estriado para producir
muerte celular intrínseca y aumento en el número de células gliales dejando las fibras de la cápsula
interna intacta. Los cambios tisulares ocurren con una latencia de 48 horas a 7 días los más tardíos
(Zaczek et al., 1978; Wuerthele et al.,1978).
En cuanto los efectos conductuales en la rata, existe un aumento en la locomoción muy bien
descrito que se observa durante la fase oscura del ciclo (Fibiger, 1978) , deterioro en aprendizaje y
memoria y cambios en el comportamiento de comer y beber con la consiguiente disminución de peso
(Giordano et al.,1988).
Una dosis de 5nmol induce cambios histológicos, conductuales y cognitivos. Sin embargo el
índice de mortandad es alto. El propósito de este experimento fue evaluar la respuesta conductual e
histológica a una dosis menor de AK (3nmol) y evitar el alto índice de mortandad.
MATERIAL Y MÉTODOS
Se utilizaron ratas de la cepa Sprague-Dawley 13 machos y 16 hembras, de 250 a 300gr. de peso
corporal. Fueron mantenidas en cajas individuales con agua y alimentación ad libitum, en un ciclo normal
(12:12). Se utilizaron dos grupos los animales lesionados y controles, estos grupos a su vez se dividieron
en hembras y machos. Los lesionados recibieron una administración bilateral de ácido kaínico (3nm/0.5ul
de solución salina en amortiguador de fosfatos PBS) (Ocean Produce) en el cuerpo estriado las
coordenadas con respecto a Bregma de acuerdo a Paxinos y Watson (1986) fueron: Anterior-posterior
+1.5mm; medial-lateral + 2.5mm y dorsal-ventral -4.5mm. El grupo control sólo recibió el vehículo. La
microinyección se realizó de manera bilateral a una velocidad de 0.1ul/min e inyectando un volumen
total. Al termino de cada microinyección, durante dos minutos se mantuvo dentro la aguja para permitir la
difusión de la solución. Después de la cirugía los animales se dejaron 7 días en recuperación y al séptimo
día se registró su actividad locomotora espontánea y se dejaron descansar. Se les volvió a registrar en el
día treinta. Para la realización del análisis inmunohistoquímico de los grupos experimentales, las ratas se
anestesiaron con una sobredosis de pentobarbital sódico y se prefundieron por vía intracardiaca primero
con PBS (0.1M, pH 7.4) seguido por paraformaldehído 4% en PBS. Se obtuvo el cerebro completo y se
mantuvo en solución postfijadora (paraformaldehído 4%) durante 24 horas y después se almacenó en
sacarosa al 30% a 40C. Se realizaron posteriormente cortes del cuerpo estriado de 50um en el micrótomo.
Los cuales se procesaron para realizar tinción de Nissl, reacción de la citocromo oxidasa,
inmunohistoquímica para NeuN e inmunohistoquímica para GFAP.
RESULTADOS
Registro de actividad locomotora espontánea en machos y hembras a los diferentes tiempos. En
las siguientes gráficas se muestra la distancia total recorrida en centímetros durante veinticuatro horas en
los diferentes tiempos a los 7 y 30 días (Figura 1 y 2). En las tablas 1 y 2, se muestra las diferencias
significativas entre los grupos controles y experimentales, tanto machos como hembras, a diferentes
tiempos después de la lesión.
Actividad locomotora espontánea:
ACTIVIDAD LOCOMOTORA A 7 DIAS
ACTIVIDAD LOCOMOTORA A 30 DIAS
7000
7000
4000
PBS MACHOS
KA MACHOS
PBS HEMBRAS
KA HEMBRAS
3000
2000
1000
6000
5000
4000
3000
2000
1000
23
21
19
17
15
13
9
11
7
5
3
0
DISTANCIA TOTAL + EEM
5000
1
DISTANCIA TOTAL + EEM
6000
0
-1000
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
-2000
HORAS
Fig.1. Promedio (+ EEM) de la distancia recorrida
(cm). Cada hora durante 25hrs de registro a los 7
HORAS
HORAS
días. Cada línea representa un grupo diferente.
Nótese el incremento en la fase de oscuridad.
Fig. 2. Promedio (+ EEM) de la distancia recorrida
(cm). Cada hora durante 25hrs de registro a los 30
GRUPO
PBS M
días después de la lesión con AK 3nmoles/0.5ul. Cada
línea representa un grupo diferente. Nótese el
incremento en la fase de oscuridad.
KA M
PBS H
KA H
PBS M
0.76139
0.00130
0.00015
KA M
0.64512
0.00130
0.02539
PBS H
0.76139
0.02539
0.00072
KA H
0.64512
0.00015
0.00072
Tabla 1. Diferencias significativas entre los grupos control y experimentales en hembras y machos a los 7
días. (PBSM: Grupo control de machos; KAM: Grupo lesionado de machos; PBS.: Grupo control de
hembras; KAH: Grupo experimental de hembras).
GRUPO
PBS M
KA M
PBS H
KA H
PBS M
0.07565
0.00073
0.00250
KA M
0.38551
0.97949
0.00073
PBS H
0.07565
0.38551
0.62542
KA H
0.97949
0.62542
0.00250
Tabla 2. Diferencias significativas entre los grupos control y experimentales en hembras y machos a los
30 días. (PBSM: Grupo control de machos; KAM: Grupo lesionado de machos; PBS.: Grupo control de
hembras; KAH: Grupo experimental de hembras).
El ANDEVA concluye que hay diferencias significativas entre grupos de hembras y machos a
diferentes tiempos después de la lesión. (F(3,92) =11.19 p<0.01 y F(3,92) =7.85 p<0.01).
V E N_CE R vs. DIS TOT30 (Casewise MD deletion)
E S T_CE R vs. DIS TOT30 (Casewise MD deletion)
DIS TOT30 = 23399. + 9082E 2 * V E N_CE R
DIS TOT30 = 1838E 2 - 773E 3 * E S T_CE R
Correlation: r = -.5573
1e5
1e5
90000
90000
80000
80000
70000
70000
DISTOT30
DISTOT30
Correlation: r = .85223
60000
50000
60000
50000
40000
40000
30000
30000
20000
10000
-0.01
20000
0.01
0.03
0.05
0.07
0.09
Regression
95% confid.
V E N_CE R
Fig. 3. Correlación entre el área de los
ventrículos laterales/ el área del hemisferio
cerebral y la distancia total recorrida a los 30
días después dela lesión. Esta es una correlación
estadísticamente significativa (p<0.05).
10000
0.135
0.145
0.155
0.165
0.175
0.185
0.195
0.205
E S T_CE R
Fig. 4: Correlación entre el área del estriado/ el
área del hemisferio cerebral y la distancia total
recorrida a los 30 días después dela lesión. Esta
es una correlación estadísticamente significativa
(p<0.05).
Histología:
Los cortes son de 50um, los cuales se procesaron para realizar reacción de la citocromo
oxidasa (Fig. 5A y 6A), tinción de Nissl (Fig. 5B y 6B ), inmunohistoquímica para NeuN (Fig. 5C
y 6C) e inmunohistoquímica para GFAP (Fig. 5D y 6D).
Regression
95% confid.
A
B
C
D
Figura 5. Cortes coronales del estriado de un animal macho representativo del grupo control. A) Reacción
de la citocromo oxidasa 1X. B) Tinción de Nissl 4X, donde se observa la citoarquitectura del estriado. C)
Inmunohistoquímica contra NeuN 4X, donde se puede observar los cuerpos neuronales. D)
Inmunohistoquímica contra GFAP 4X, donde se puede observar los cuerpos gliales.
A
B
C
D
Figura 6. Cortes coronales del estriado de un animal macho representativo del grupo con ácido kaínico a
3nmol. A) Reacción de la citocromo oxidasa 1X, donde se puede observar el halo de la lesión B) Tinción
de Nissl 4X, donde se observa la pérdida de citoarquitectura del estriado. C) Inmunohistoquímica contra
NeuN 4X, donde se puede observar la disminución de los cuerpos neuronales. D) Inmunohistoquímica
contra GFAP 4X, donde se puede observar el aumento de los cuerpos gliales.
CONCLUSIONES:






La lesión bilateral con ácido kaínico 3 nmoles induce un incremento significativo en la conducta
locomotora, tanto en machos como en hembras, en términos de distancia recorrida (cm) y número de
movimientos. El efecto es evidente durante la fase de oscuridad.
La lesión con ácido kaínico induce pérdida celular evaluada con la tinción de Nissl y con la
reducción en la actividad de la enzima citocromo oxidasa.
Hay una reducción significativa de neuronas en el estriado lesionado y un aumento en las células
gliales según la inmunotinción para NeuN y GFAP respectivamente.
Se encontró una correlación positiva significativa entre los niveles de actividad y el aumento en el
área de los ventrículos laterales.
Se encontró una correlación negativa significativa entre los niveles de actividad y el área del estriado.
Esta dosis entonces es útil para inducir los cambios en el estriado y la conducta que se han asociado
con este modelo de la enfermedad de Huntington y produce una mortandad mínima.
BIBLIOGRAFIA
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