Miguel Barberà Solà
Rubén D. Artero
PROYECTO DE COLABORACIÓN: Implicación de la adhesión
celular al sustrato en la ruta de patogénesis de DM
Introducción
Se ha demostrado que los transcritos portadores de expansiones del trinucleótido CUG
(plegadas en horquillas; ds(CUG)n) son suficientes para desencadenar Distrofia Miotónica (DM) en
ratones. Estas horquillas unen las proteínas humanas MBNL1, MBNL2 y MBNL3 (referidas genéricamente
como Muscleblind, su ortólogo en Drosophila) tanto in vitro como in vivo, secuestrándolas de su función
normal. El knock-out de Mbnl1, así como el fenotipo de moscas mutantes muscleblind, apoya que la falta
de función de MBNL en humanos es el desencadenante principal de la DM. Sin embargo, experimentos
en cultivo celular y un modelo de DM en Drosophila que expresa 162 CUG indican que el secuestro de
MBNL es una etapa necesaria para desencadenar DM, pero no suficiente para provocar defectos
moleculares característicos de DM. Nuestra hipótesis es que el secuestro de proteínas Muscleblind en las
horquillas ds(CUG) reduce la concentración efectiva de estas proteínas y sensibiliza la célula a
alteraciones moleculares adicionales con un efecto sobre la función muscleblind. Para demostrar esta
hipótesis proponemos identificar nuevos componentes en el mecanismo de patogénesis utilizando un
modelo de DM en Drosophila, desarrollado en nuestro laboratorio, por expresión de 480 CTGs bajo el
control del sistema Gal4/UAS. Utilizando estos datos previos, y otras hipótesis, planteamos como
objetivos de este proyecto analizar la implicación en la ruta de patogénesis de la DM en la adhesión
celular al sustrato. Para comprobar la posible alteración en las propiedades adhesivas de las células que
expresan repeticiones, estudiaremos la integridad de las membranas basales del epitelio del disco
imaginal de ojo, la polaridad apico-basal de los fotoreceptores y la activación de la apoptosis en discos
que expresan CUGs.
Objetivos y plan de trabajo
Nuestros resultados previos con el modelo de DM en Drosophila sugieren que la adhesión de las
células del disco de ojo, un epitelio, puede estar alterada. En concreto, reducir a la mitad la dosis de
Viking, el gen codificante para la cadena 2α del colágeno tipo IV (el componente estructural mayoritario
de las membranas basales de los epitelios), potencia fuertemente el fenotipo rugoso de las moscas
modelo. Aunque existen otras alternativas, nuestra hipótesis de trabajo es que la falta de función de
muscleblind, inducida por las repeticiones CUG, interfiere con la función de las integrinas las cuales son
un componente esencial para el anclaje de las células a los epitelios.También implicadas en adhesión
celular están las proteínas Fear of intimacy (migración) y Coro (implicada en el citoesqueleto de actina).
La primera actividad dentro de este objetivo persigue obtener evidencia directa de alteraciones en
proteínas implicadas en adhesión en las moscas modelo. La segunda intenta avanzar en la implicación de
las integrinas en este fenotipo.
A.Detección de alteraciones en distintas moléculas de adhesión celular, y marcadores de
polaridad celular, en ojos rugosos por expresión de repeticiones CUG
Para la consecución de este objetivo compararemos primero un panel de marcadores de
adhesión celular en moscas normales y que expresan las repeticiones CTG en el disco imaginal de ojo.
Las tinciones se realizarán utilizando discos de larvas de tercer estadío y siguiendo técnicas estándar en
inmunohistoquímica. Comprobaremos la integridad de la membrana basal de los discos imaginales de ojo
que expresan repeticiones CUG. Se utilizarán anticuerpos específicos contra proteínas constituyentes de
las membranas basales tales como colágeno IV, laminina, tenascina, nidogenina y fibronectina, entre
otras. Esperamos encontrar alteraciones en el nivel de expresión de alguno de estos componentes o,
alternativamente, alguna alteración morfológica en la membrana basal del epitelio del disco. En caso de
encontrar alguna alteración, comprobaremos si esta falta de adhesión se traduce en una sensibilización
en las células del epitelio a apoptosis, probablemente contribuyendo al fenotipo rugoso observado
externamente. Estos experimentos se realizarán mediante tinciones con un anticuerpo anti-caspasa 3
comercial y con métodos que detectan fragmentación en el DNA genómico in situ. Que la pérdida de
adhesión es la responsable de la inducción de apoptosis, si se detecta, lo demostraremos rescatando el
fenotipo apoptótico con sobreexpresión de moléculas adhesivas, tales como el colágeno IV. En estos
experimentos se detectará la apoptosis de la manera descrita anteriormente con las moscas
correspondientes. Exploraremos la posibilidad de que esté alterada la polaridad apico-basal que
presentan las neuronas fotoreceptoras. Una alteración en esta polaridad celular es probable pues los
clones mitóticos mutantes muscleblind presentan alteraciones en la diferenciación de los rabdómeros), los
cuales se extienden de la porción apical de los fotoreceptores hacia la parte basal durante su
diferenciación. Para estos estudios utilizaremos marcadores de polaridad apico-basal tales como
anticuerpos para detectar las proteínas Crumbs, Discs lost y Armadillo (marcador de uniones adherentes).
En caso de encontrar una alteración en la polaridad apico-basal, esta alteración podría contribuir a
explicar la rugosidad del fenotipo. También detectaremos en cortes tangenciales de ojos que expresan las
repeticiones la presencia o ausencia de rabdómeros en los fotoreceptores, como un marcador
morfológico más de diferenciación celular correcta.
B. Implicación de distintas isoformas de Muscleblind en la localización de mensajeros
codificantes para integrinas
Aunque esperamos que los datos generados en la actividad A sean congruentes con una
implicación de las integrinas en la ruta de patogénesis de la DM, ya existen evidencias indirectas que lo
sugieren. Las más claras son la participación de la proteína humana MBNL2 en la localización subcelular
de los transcritos codificantes para la integrina α3, por unión a una secuencia específica en 3´UTR
denominada zipcode, y que Muscleblind regula el splicing alternativo de la alfa-actinina, una proteína
adaptadora para las integrinas por su porción intracelular. Nuestra hipótesis es que esta función está
conservada en Drosophila y que alguna de las isoformas Muscleblind debe participar en la localización de
transcritos de integrinas, y con ello participar en la localización concreta de las mismas. Esto, a su vez,
puede tener importantes consecuencias en cuanto a la polaridad celular, su adhesión al sustrato e incluso
entrada en apoptosis por falta de esta adhesión, que pueden explicar fenotipos descritos en la actividad A
y otros. Para la consecución de este objetivo silenciaremos mediante interferencia de dsRNA la expresión
del gen muscleblind completamente, o cada una de las isoformas generadas por splicing alternativo, y
estudiaremos específicamente la localización de las integrinas en estos mutantes de falta de función.
Para generar las construcciones interferentes (según Giordano et al. 2002), emplearemos una región
específica en 3´ de cada transcrito alternativo de muscleblind, o una porción común en 5´. Se clonará un
fragmento de aproximadamente 200 pb en sentidos opuestos en un vector Sym-pUAST que transcribe
cadenas de RNA complementarias las cuales forman un dsRNA en la célula que se procesará para dar
lugar a la forma que interferirá con su RNA diana específico. Se obtendrán moscas transgénicas. Al
cruzar estas líneas por una línea Gal4 de expresión ubicua en el embrión (o un patrón específico de
interés, por ejemplo en el SNC o en el disco imaginal de ojo) expresarán el RNA interferente lo que
provocará un fenotipo de falta de función para cada isoforma concreta o el gen muscleblind completo.
Reservaremos una pequeña región de los transcritos muscleblind, que no estará incluida en la
construcción interferente, para obtener una sonda específica que nos permita comprobar in vivo el
silenciamiento del gen. En especial estudiaremos la localización citoplasmática de los transcritos de la
integrina α1 (ortólogo en Drosophila de la integrina humana α3) y de la proteína, para la que ya se ha
descrito una distribución localizada en las células embrionarias (en los extremos de los músculos en
desarrollo). También detectaremos la proteína alfa-actinina, por su participación en la función adhesiva de
las integrinas. Una vez detectado un fenotipo de localización citoplasmática aberrante al interferir con una
isofoma Mbl concreta, comprobaremos que dicha isoforma se une específicamente al transcrito en
estudio. Para análisis de colocalización in vivo utilizaremos la línea UAS-MblC:GFP ya disponible en
nuestro laboratorio y/o un antisuero contra la proteína Muscleblind. La detección de la unión de proteína
Muscleblind con los transcritos candidatos en el citoplasma de células de embrión o disco imaginal de ojo
de Drosophila la llevaremos a cabo combinando técnicas de hibridación in situ fluorescente para detectar
los transcritos, y técnicas de detección inmunohistoquímica utilizando anticuerpos específicos contra GFP
o Muscleblind. Mediante visualización en microscopía confocal se determinará si ambas señales
colocalizan o no en el citoplasma.
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