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Fitopatología Molecular
Guía de Trabajos Prácticos 2014
Docentes responsables e invitados:
Adrián Vojnov (F. Pablo Cassará)
Alejandro Mentaberry (FCEN)
Ana Julia Distéfano (INTA, FCEN)
Andrea Puebla (INTA)
Andrea Venturuzzi (INTA)
Carolina Martínez (INTA, FCEN)
Daniela Tosto (INTA, FCEN)
Federico Ehrenbolger (INTA)
Fernando Carrari (FAUBA, INTA)
Gabriela Conti (INTA)
Gustavo Gudesblatt (F. P. Cassará)
Lorena Ingala (INTA)
María José Diéguez (INTA)
Marisa López Bilbao (INTA)
Marta Rivera (FAUBA, INTA)
Natalia Almasia (INTA)
Paula Fernández (INTA)
Sebastián Asurmendi (INTA)
Sebastián Moschen (INTA)
Silvia López (FCEN)
Verónica Lía (FCEN, INTA)
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Fitopatología Molecular
Julioo-Agosto 2014
Referente a la permanencia y desarrollo del curso:
 El uso de guardapolvo es obligatorio en las áreas de laboratorio y prohibido en las áreas de comedor y administrativa. Los
alumnos deberán traer sus propios guardapolvos.
 El uso de guantes descartables (serán provistos) es obligatorio al momento de realizar los experimentos pero deberán
descartarlos al salir del laboratorio y/o al operar las computadoras afectadas a los equipos.
 No está permitido ingresar con alimentos o bebidas a los
laboratorios ni a la sala de teóricos ni a la de computadoras.
 Está prohibido fumar en todas las áreas del instituto.
 Los alumnos deberán usar calzado cerrado adecuado.
 En las guías de cada trabajo práctico se detallan cuales
reactivos serán manipulados solamente por los docentes y
ayudantes a cargo. Prestar especial atención a estas notas.
 El uso del equipamiento de laboratorio se realizará solamente con supervisión de los docentes y ayudantes a cargo.
 Todos los solventes se manipularán solamente bajo campana.
 Los tips y tubos epps usados se descartan en botellas de
plástico rotuladas para tal fin.
 Todos los elementos personales (por ejemplo: abrigos,
mochilas, carteras, etc.) no deben ser ingresados a los laboratorios.
 Es fundamental lavarse las manos antes de ingresar y al
salir de los laboratorios.
 Si bien es potable, se recomienda no beber agua de las
canillas de los laboratorios. Usar los dispensadores que están
en los pasillos.
 Los alumnos podrán traer sus propias computadoras (notebooks) para los trabajos prácticos que lo requieran.
 A fin de una mejor orientación de los alumnos, se incluyen
en esta guía un esquema de la planta del edificio donde se
desarrollará el curso indicando las aulas y laboratorios para tal
fin.
Información adicional acerca de los laboratorios de TP y aula
de teóricos en el Instituto de Biotecnología.
Se solicita permanecer en el auditorio o laboratorio destinado a
las clases del presente curso durante los horarios establecidos.
A los efectos de una mejor ubicación en el Instituto se recomienda consultar el esquema de la planta del Instituto.
Cronograma tentativo
Lunes 21 de julio
8.30- 8.45 hs Introducción general y presentación de los alumnos
9.00 – 13.00 hs Conceptos básicos de Fitopatología (Silvia
López y Marta Rivera)
13.30 – 14.30 hs Biología molecular de virus (Esteban Hopp)
15.00 – 17.30 hs PCR Diagnóstica/PCR en tiempo real y digital (Paula Fernández o Viviana Pedroarias)
Martes 22
8.30-12.30: Introducción teórica al TP Virología molecular
(Ana Distéfano y Carolina Martínez)
y TP Virología molecular: PCR diagnóstica del CLRDV (Ana
Distéfano y Carolina Martínez)
13.30 – 15 hs TP Virología molecular: corrida de geles para
diagnóstico de CLRDV (Carolina Martínez)
15.30 -17.30 hs Secuenciación de genomas virales (Ana Distéfano)
Miércoles 23
8.30 – 12 hs Elementos de Bioinformática aplicada a la Fitopatología (Paula Fernández)
13.00 -17.30 TP Bioinformática: herramientas para análisis de
secuencias virales. Consultas en Bases de datos (Carolina Martinez, Ana Distefano)
Viernes 25
9.00 -11.00: Genómica aplicada al estudio de poblaciones de
fitopatógenos: Marcadores Moleculares (Esteban Hopp)
11.30 -12.30 hs TP Marcadores y bioinformática: análisis bioinformático (D. Tosto, Cintia Acuña)
13.30 – 15.00: Introducción teórica al TP de Sclerotinia y PHC
(Federico Ehrenbolger)
15.00-17.30: Extracción de ADN a partir de capítulos de girasol infectados con Sclerotinia (Federico Ehrenbolger, Ana
Distéfano)
Sábado 26
9 - 10 hs: Presentaciones formales de los temas de trabajo/tesis
de los alumnos (10 minutos cada uno).
10 - 12:30 hs: Biología molecular de hongos fitopatógenos
(Natalia Almasia)
13.30- 15.30: Estrategias biotecnológicas de resistencia a virus
(Alejandro Mentaberry)
Lunes 28
8.30-10.30 hs: Introducción al análisis de diversidad (Verónica Lía)
10.30 – 12.30 TP Sclerotinia, PCR (Federico Ehrenbolger,
Ana Distéfano)
13.30 -14.30 hs: TP Sclerotinia, Siembra geles y corrida
(Federico Ehrenbolger, Ana Distéfano)
14.30 -17.30: Discusión resultados TP Sclerotinia (Federico
Ehrenbolger, Ana Distéfano)
Martes 29 (en INTA)
8.30 – 10.30 Epidemiología molecular (Lorena Ingala, María
José Diéguez) (I. de Genética)
10.30 – 13.00 Evaluación de variabilidad génica de roya de
la hoja del trigo (Lorena Ingala, María José Diéguez) (I. de
Genética) Visita al IGEAF
14.00-14.30 Introducción al TP Silenciamiento Génico (Gabriela Conti) (Instituto de Biotecnología)
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15.00-17.30 TP Silenciamiento génico (1ra parte) Agroinfiltración (Gabriela Conti, Andrea Venturuzzi)
Miércoles 30 (Fundación Pablo Cassará,
http://www.fundacioncassara.org.ar/?es/investiga/lic/fitopatolo
/)
9.00-10.30 Biología molecular de bacterias fitopatogénicas y
estrategias biotecnológicas de resistencia a bacterias (Adrián
Vojnov)
11.00-12.30 Entrada de patógenos por estomas e inducción de
PAMPS (Gustavo Gudesblat)
Tarde: Visita al Laboratorio de Fitopatología Molecular de la
Fundación Pablo Cassará
Viernes 1 de agosto
9.00 – 11.00: Estrategias biotecnológicas de resistencia a hongos (Marisa López Bilbao)
11.30 – 13.30 Biología molecular de la interacción H-P. Silenciamiento, microRNAs (Sebastián Asurmendi)
14.30-17.00 Seminarios de los alumnos
Sábado 2
9.00-10.30 Transcriptómica (Sebastián Moschen)
11 – 12.30 Metabolómica (Fernando Carrari)
13.00 -17.00 Seminarios bibliográficos dados por los alumnos
del curso.
Lunes 4 (en INTA)
8.30 – 10.30 TP Silenciamiento génico (2a parte): análisis
plantas (Gabriela Conti, Andrea Venturuzzi)
10.30 – 15.00: Técnicas de secuenciación convencional y NGS
(Andrea Puebla)
15.00-16.30: Visita al secuenciador y TP de análisis de secuencias genómicas (Andrea Puebla)
Martes 5
9.00 – 11.00 Mejoramiento genético para resistencia a enfermedades, Mapeo de Asociación, Selección Genómica (Esteban
Hopp).
Resto del día: Seminarios de los alumnos.
Miércoles 6 Seminarios de los alumnos.
Sábado 9 (en la EPG - FAUBA) Examen integratorio
Contenido:
1 Silenciamiento
2 Secuenciación
3 Diagnostico de virus CLRDV
4 Bioinformatica viral
5 Detección Streptomyces
6 Marcadores y Diversidad
7 qPCR
TP 1 Virología Molecular: RT- PCR diagnóstica del Cotton leafroll dwarf virus (CLRDV) en
plantas de algodón.
Ana Julia Distéfano
Consideraciones generales
Muchas enfermedades de importancia agrícola regional
no son fácilmente diagnosticables por los síntomas producidos, sobre todo si son subclínicos o como en el caso
de las enfermedades virales. Por otro lado, la sintomatología puede variar con el fondo genético del hospedante, las condiciones ambientales y la constitución genética del patógeno. La identificación rápida y precisa de
los patógenos que afectan a los cultivos de interés agronómico es crítica para predecir y controlar las enfermedades y para seleccionar plantas tolerantes o resistentes
en los programas de mejoramiento.
Para el caso de infecciones virales, en los últimos años
se han desarrollado y optimizado métodos de diagnóstico por RT-PCR de virus pertenecientes a la familia
Luteoviridae (Singh y col., 1995, 1996, 2004)
El algodón es un cultivo regional clave en el NEA. La
enfermedad azul del algodón fue reportada en la Argentina durante la campaña agrícola 1982/83 y actualmente
causa importantes pérdidas económicas en el cultivo,
limitando su productividad si no se implementan medidas adecuadas de control. La enfermedad es producida
por el Cotton leafroll dwarf virus (CLRDV) y el virus
es transmitido exclusivamente por áfidos no siendo
posible su transmisión mecánica. El genoma del
CLRDV fue recientemente secuenciado por nuestro
grupo y se desarrolló un método efectivo de diagnóstico
de la enfermedad permitiendo realizar un diagnóstico
temprano del virus en las zonas afectadas.
Objetivo del TP: Discutir protocolos de extracción de
ARN a partir de muestras de origen vegetal y la subsiguiente síntesis de ADN copia.
Realizar el diagnóstico molecular del CLRDV mediante
la detección de secuencias propias del virus en plantas
de algodón infectadas mediante la técnica de RT-PCR
(transcripción reversa y posterior PCR).
Parte I: Discusión con los docentes del protocolo de
extracción de ARN a partir de plantas del algodón y
síntesis del ADN copia (ADNc), observando los detalles importantes para obtener de manera óptima
estas moléculas.
Extracción de ARN
Consideraciones generales
El primer paso en el diagnóstico basado en técnicas de
detección a nivel de ARN es la purificación de esta
molécula de los otros componentes de la muestra
(ADN, proteínas, etc). Los sistemas de purificación de
ARN a partir de tejidos permiten la obtención de un
RNA de gran pureza e integridad.
Partimos de dos grupos de plantas de algodón: no infectadas (sanas) y plantas con síntomas de infección por el
CLRDV (infectadas). Ver Figura 1.
Figura 1: Plantas sanas de G. hirsutum cv Banda 56
(izquierda) comparadas con plantas de la misma edad
inoculadas con el áfido que presentan síntomas típicos
de enfermedad azul (derecha).
3
Fitopatología Molecular
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te proteínas
La mayoría de los protocolos de extracción de ARN
involucran en general 4 etapas básicas:
1) Se aplica algún tipo de maceración mecánica para
romper las paredes y membranas celulares del tejido. La
maceración de tejido fresco se hace en presencia de
nitrógeno líquido.
2) El tejido se resuspende en el buffer de extracción
para la lisis del mismo y la solubilización de las membranas lipoprotéicas y desnaturalización de las proteínas, en tanto que el ARN es protegido de la acción de
enzimas degradativas.
3) La suspensión se somete a una extracción con solventes orgánicos, como Fenol ácido (ph 4,5) y cloroformo, y las fases orgánica y acuosa se separan por
centrifugación. En esta extracción, lípidos, proteínas, la
mayoría de los polisacáridos y el ADN quedan retenidos en la fase orgánica en tanto que el ARN y algunos
polisacáridos quedan en fase acuosa. A la fase acuosa
obtenida en la etapa anterior se le adiciona alcohol (etanol o isopropanol). El ARN en presencia de alcohol
forman un precipitado, que a veces es visible, que puede ser sedimentado por centrifugación. A este precipitado luego se lo lava con alcohol para eliminar las sales
remanentes.
4) En la última etapa, el ARN es resuspendido en agua
MiliQ libre de RNAsas (agua con Dietil Pirocarbonato).
Protocolo de extracción de ARN utilizando TRIZOL
Minipreparación de ARN en microtubos de 1,5 ml a
partir de 100 mg de tejido de hojas de plantas de algodón sanas e infectadas con CLRDV.
1) Colocar el tejido en un mortero (previamente enfriado con nitrógeno líquido), agregar nitrógeno líquido
y moler el tejido hasta que esté pulverizado.
2) Pasar 100 mg de tejido macerado a un tubo de 1,5
ml. Agregar 1 ml de TRIZOL (Invitrogen) y macerar el
tejido utilizando un émbolo plástico durante 20-40 segundos. Se trabaja en campana.
Aclaración: El TRIZOL es el nombre comercial de una
solución de Tiocianato de guanidinio- Fenol. El TRIZOL mantiene la integridad del ARN durante la homogeneización del tejido fino, mientras que al mismo
tiempo lisa las células y sus componentes.
Precaución: es una sustancia muy tóxica
3) Dejar 5 min a temperatura ambiente. Centrifugar
en microcentrífuga refrigerada a 4°C durante 10 minutos a 12.000 rpm para obtener un sobrenadante limpio
sin restos de material vegetal.
4) Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5
ml. Agregar cloroformo frío hasta volumen final de 1,4
ml. Vortex 2 min y centrifugar en microcentrífuga refrigerada a 4°C durante 10 minutos a
12.000 rpm.
La muestra se separará en dos fases y
una interfase: la superior o acuosa que
contiene el RNA, la interfase que contiene ADN y proteínas y la inferior u
orgánica que contiene mayoritariamen-
5) Transferir cuidadosamente la fase acuosa superior
a un nuevo tubo de 1,5 ml. Medir el volumen y adicionar 1 volumen de isopropanol. Dejar durante la noche a
-20 °C
6) Centrifugar en microcentrífuga refrigerada a 4°C
durante 30 minutos a 14.000 rpm
7) Descartar el máximo posible de sobrenadante sin
perder el pellet (que en general estará difuso y suelto,
encontrándose en el fondo o a lo largo de la pared del
tubo dependiendo del ángulo de rotor utilizado).
8) Lavar el pellet con 250 μl de etanol 70% (generalmente, se observará el pellet más blanco en este punto). Centrifugar 10 min a 14.000 rpm a 4°C.
9) Repetir el paso 8. Dejar secar el pellet al aire por
unos 20 minutos tomando las precauciones de no secarlo completamente (se dificulta su posterior resuspensión).
10) Resuspender el pellet en 50μl de agua libre de
RNAsas (agua DEPC: Dietil Pirocarbonato) previamente calentada a 70°C dado que facilita la resuspensión del
ARN.
11) Guardar el ARN a -80 °C
El RNA es muy lábil y fácilmente degradado por la
acción de RNAsas presentes en la piel y por temperaturas superiores a 4ºC, lo que constituye el principal problema de la extracción del RNA, por ello se utiliza inhibidores de RNasas (como el DEPC), guantes para su
manipulación, se utiliza todo el material libre de RNAsas y se trabaja a temperaturas inferiores a 4ºC.
Para verificar la calidad, integridad y cantidad del ARN
obtenido se realiza una electroforesis en gel de agarosa
1%.
Figura 2: Gel de agarosa 1%. Calle S: 1μl de ARN
obtenido de hojas de plantas de algodón sanas. Calle E:
1μl de ARN obtenido a partir de
hojas de plantas de algodón infecS
E
tadas con CLRDV. Método de
tinción: bromuro de etidio.
Soluciones
Agua DEPC 0.1%
Dietil Pirocarbonato 1 ml
Agua c.s.p 1000 ml
Síntesis de ADNc.
Un ADN complementario (ADNc)
puede ser sintetizado in vitro a
partir de ARN total utilizando la
enzima transcriptasa reversa (RT), la cual es una ADN
polimerasa dependiente de ARN, que utiliza primers al
azar (random primers o hexámeros al azar) ó un oligo-
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Fitopatología Molecular
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nucleotido poly (dT) de 12-18 pb. Luego de desnaturalizar el ARN mediante calor, el primer actúa como iniciador para la síntesis 5`-3` de una molécula complementaria al ARN, la cual es un ADNc de simple cadena. El ADNc obtenido corresponde a la totalidad de la
población de ARN presente al inicio de la síntesis.
Para la síntesis de ADNc se utilizara el kit comercial
SuperScript III (Invitrogen)
ARN
1 g
dNTPs (10 mM)
1 l
Random primers (150 ng/l)
1 l
H2O Depc
X l
Volumen
15 l
Colocar 5 min a 70 C y luego inmediatamente en hielo.
Hacer un spin.
Agregar la siguiente mix:
Buffer 1st strand 5x
4l
DTT 0,1M (Dithiothreitol)
1l
RNAse out (40U/l)
1l
Transcriptasa reversa (200U/l) (Superscript II) 1l
22
Colocar en un termociclador con el siguiente programa:
25 ºC
2 min
50ºC
2 hs
70ºC
15 min
16ºC
ON
PARTE II: Detección de secuencias específicas del
CLRDV mediante PCR para su diagnóstico molecular.
Consideraciones generales
Para la PCR diagnóstica del CLRDV se amplificarán
dos regiones del genoma viral, una correspondiente al
ORF0 y la otra correspondiente al ORF3. El ORF0 codifica para la proteína P0 que tiene función de supresor
de silenciamiento génico y es una proteína que presenta
considerable variabilidad entre los distintos aislamientos virales. El ORF3 codifica para la proteína P3 que
corresponde a la cápside viral (CP) y es una proteína
muy conservada entre los distintos aislamientos virales.
En la figura 3 se indica la posición de los primers y el
fragmento que se va a amplificar en cada caso.
Figura 3: Esquema de la estructura genómica del
CLRDV. Se indican los primers (flechas grises) utilizados para la amplificación mediante la técnica de PCR
del ORF 0 (Primers 3 y 4) y ORF3 (primers 1 y 2) del
CLRDV. Se indica el tamaño a amplificar en cada caso.
Secuencia de los primers:
Primer 1: CP up 5´ATGAATACGGTCGTGGGTAG 3´
(posición: 3630-3649)
Primer 2: CP low 5´ CTATTTTGGATTGTGGAATT
3´ (posición: 4236- 4217)
Primer 3: P0 up 5´ ATGTTGAATTTGATCATCTG 3´
Reactivos
Concentración final
H2O MilliQ
Buffer 10X
MgCl2 50mM
dNTPs 10 mM
---1X
1,5 mM
0,4 M
(posición: 71-90)
Primer 4: P0 low 5´ TCAACTGCTTTCTCCTTCAC
3’ (posición: 856-837)
Se realizará un control para confirmar que el ADNc
obtenido es amplificable. Para ello utilizaremos un par
de primers que amplifican un ARN mensajero que codifica para un gen endógeno:la Ubiquitina de algodón. Se
obtendrá un producto de 500 pb.
Primer 5: Gh UBI up 5´ CTGAATCTTCGCTTTCACGTTATC3’
Primer 6: Gh UBI low 5´ GGGATGCAAATCTTCGTGAAAAC3´
Se realizará otro control (control positivo) para confirmar que la reacción de amplificación por PCR funcionó. Para ello utilizaremos un plásmido que tiene clonado el ORF 0 (P0) y otro plásmido que tiene clonado el
ORF 3 (CP) con los primers correspondientes.
Protocolo experimental
a) Material
Cada grupo partirá del ADNc de las muestras a analizar
y de los plásmidos control. Algunos grupos amplificarán la secuencia del ORF0 y otros grupos la secuencia
del ORF3, sobre el ADNc de planta sana y planta enferma y los respectivos controles. También algunos
grupos amplificarán la secuencia de la Ubiquitina de
algodón sobre el el ADNc de planta sana y planta enferma y sobre un control de ADN de algodón.
b) Protocolo experimental
b.1.) Reacción de amplificación
Se llevará a cabo el siguiente procedimiento:
1) Rotular apropiadamente los tubos de PCR con marcador de alcohol, (utilizar dos para cada ADNc: planta
sana y planta enferma, uno para el control negativo de
mix y otro para el plásmido control positivo o el ADN
de algodón, según corresponda).
Tubo 1: ADNc planta enferma con Primers 1 y 2 (CP)
Tubo 2: ADNc planta sana con Primers 1 y 2 (CP)
Tubo 3: plásmido CP con Primers 1 y 2 (CP)
Tubo 4: mix sin ADNc con Primers 1 y 2 (CP)
Tubo 5: ADNc planta enferma con Primers 3 y 4 (P0)
Tubo 6: ADNc planta sana con Primers 3 y 4 (P0)
Tubo 7: plásmido P0 con Primers 3 y 4 (P0)
Tubo 8: mix sin ADNc con Primers 3 y 4 (P0)
Tubo 9: ADNc planta enferma con Primers 5 y 6 (Gh
UBI)
Tubo 10: ADNc planta sana con Primers 5 y 6 (Gh
UBI)
Tubo 11: ADN algodón con Primers 5 y 6 (Gh UBI)
Tubo 12: mix sin ADNc con Primers 5 y 6 (Gh UBI)
2) Realizar una mezcla de reacción (Premix) según la
siguiente tabla:
Volúmen en l
MIXADNc
plásmido o ADN
16,45
2,5
0,75
1
Volúmen total
l
l
l
l
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Fitopatología Molecular
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Primer up 50 ng/l
Primer low 50 ng/l
Taq Platinum (10
U/l)
ADNc ó plasmido (1
ng/l)
Volúmen final
2 ng/l
0,08 U/l
Mantener el orden de la lista de reactivos para preparar
la Premix. Una vez preparada, mezclar brevemente,
aplicar un spin de centrífuga y luego
3) Agregar 23 l de la Premix a cada tubo.
4) Pipetear el ADN (2 l en el caso del ADNc ó 1l en
el caso de los pásmidos) en los tubos correspondientes y 2 l de H2O en el tubo “control negativo” o 1
l de H2O en el tubo “control negativo”, según corresponda. .
5) Luego, agregar una gota de aceite mineral. Tapar
bien. Dejar los tubos en hielo hasta colocarlos en el
termociclador.
PRECAUCIÓN: Una vez que la Taq polimerasa fue
agregada a la Premix, trabajar siempre en hielo, ya
que la enzima pierde irreversiblemente actividad a
temperatura ambiente.
El programa de amplificación es el siguiente:
1 ciclo
94 C, 4 min (desnaturalización inicial)
35 ciclos
94 C, 1 min (desnaturalización)
55 C, 1 min (hibridación)
72 C, 1 min (extensión)
1 ciclo
72 C, 10 min (extensión final)
16 C, infinito (conservación de las
muestras)
6) Una vez terminado el programa, agregar a la muestra
5 l de Buffer de Carga y guardar en freezer a -20C
hasta el momento de la visualización de los resultados.
1
1
0,3
l
l
2
(por tubo)
25
l
3) Una vez fundida la mezcla, agregar el volúmen necesario de una solución de bromuro de etidio para obtener una concentación final de 0,5 g/ml en el gel.
PRECAUCIÓN: El bromuro de etidio es extremadamente mutagénico, use guantes y sea cuidadoso durante
la manipulación del gel.
4) Volcar la solución en la cama electroforética (ésta
debe estar apropiadamente nivelada y tener el peine
colocado). Eliminar toda burbuja. Esperar a que gelifique completamente antes de usar.
5) Sumergir la cama junto con el peine en la cuba electroforética, la cual debe poseer buffer TAE 1X en cantidad suficiente para cubrir el gel. Retirar cuidadosamente el peine y proceder a la siembra de las muestras (20
l por calle).
6) La corrida electroforética se llevará a cabo a voltaje
constante (8 V/cm) y los productos de amplificación se
visualizarán bajo luz UV.
PRECAUCIÓN: la radiación UV es particularmente
dañina para los ojos. Para minimizar la exposición,
asegúrese de que la fuente de luz UV esté adecuadamente cubierta con un acrílico. Use anteojos o una
máscara de seguridad que bloquee eficientemente la luz
UV. Use guantes cuando manipula materiales sobre la
fuente de luz UV. Este tipo de radiación es también
mutagénica y carcinogénica.
7)
Observe y analice los resultados.
c) Soluciones empleadas
TAE 10X: 400 mM Tris, 50 mM NaOAc, 7,7mM
EDTA
Tris base (PM=121,10)
48,40 g/L
Na2EDTA (PM=380,2)
2,92 g/L
NaOAc (PM=82,03)
4,10 g/L
Ajustar el pH en 8,0 con Ácido acético glacial
b.2) Visualización de los productos de amplificación
Los productos de amplificación serán resueltos por
electroforesis en un gel de agarosa al 1%. Para ello, se
procederá de la siguiente manera:
1) Mezclar en un Erlenmeyer la cantidad necesaria de
agarosa en el volúmen apropiado de buffer TAE (TrisAcetato -EDTA) 1X para obtener una concentración
Buffer de carga
final de 1%.
Xilenxianol
2 mg/ml
2) Colocar la mezcla de agarosa en el horno microonGlicerol
40% (v/v)
das y calentar a baja potencia hasta el primer hervor.
TP 2: Bases de datos para análisis de secuencias virales
Ana Julia Distéfano y Carolina Martínez
Las enfermedades de las plantas causan la pérdida de
aproximadamente el 15% de la producción agrícola
mundial. En particular, las infecciones virales producen
perjuicios económicos significativos de manera directa,
a través de una disminución del rendimiento por efecto
de la enfermedad, e indirecta a través de un incremento
en los costos debido a la utilización de semilla libre de
virus (por ejemplo en plantas de propagación clonal
como papa, ajo y batata).
En este contexto, el estudio y caracterización de los
virus vegetales desde el punto de vista clásico como
molecular reviste de gran importancia para el desarrollo
de nuevas y mejores estrategias de resistencia en los
diferentes hospedantes vegetales.
El Cotton leafroll dwarf virus (CLRDV)
La enfermedad azul es considerada en la actualidad la
principal enfermedad de origen viral que afecta al cultivo de algodón en la zona algodonera de la Argentina
(NEA).
Se determinó que la enfermedad es causada por el Cotton leafroll dwarf virus, y recientemente se obtuvo la
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Fitopatología Molecular
Julioo-Agosto 2014
secuencia completa del genoma viral (Distefano AJ y
col, Archieves of Virology, 2010). El virus es transmitido únicamente por un insecto vector: Aphis gossypii
Glover. El CLRDV pertenece al género Polerovirus de
la familia Luteoviridae. Su genoma es de ARN de simple cadena positiva, y el tamaño total es de 5866 bases.
Taxonomía y filogenia moleculares
La clasificación de los virus ha sido y sigue siendo un
punto extremadamente confuso y sometido a constante
revisión. No hay que olvidar que para su identificación
y nomenclatura no son válidos los criterios utilizados
con los organismos de estructura celular eucariótica, ni
siquiera los seguidos en el caso de las bacterias. En
virología no hay unanimidad acerca del concepto de
especie, ya que los criterios a seguir para definirla pueden variar de una familia de virus a otra. En general se
valoran: la naturaleza de su genoma (ARN/ADN), tamaño y morfología, la sensibilidad a solventes orgánicos, características antigénicas (muy utilizadas para el
establecimiento de tipos dentro de las especies), formas
de transmisión, rango de huésped y sintomatología.
El concepto de especie, es muy importante desde un
punto de vista taxonómico. Sin embargo, solamente en
1991, la ICTV aceptó la propuesta de Van Regenmortel, de considerarlo como un criterio válido para la taxonomía y nomenclatura de los virus.
Las relaciones filogenéticas entre los virus han sido
posibles de inferir a medida que se ha ido clonando,
secuenciando y caracterizando genes estructurales de
los mismos. Estos análisis constituyen una poderosa
herramienta para realizar estudios de epidemiología
molecular. Por otro lado también permiten analizar la
evolución de los virus y eventualmente definir nuevas
especies o grupos taxonómicos.
En los últimos años, la implementación de las técnicas
de secuenciación masiva junto con la consecuente producción de una gran cantidad de datos y el desarrollo de
la bioinformática, hicieron posible la generación de
bases de datos de secuencias de consulta diaria para
toda la comunidad científica, permitiendo estudios
comparativos de genomas. Estas herramientas, también
son utilizadas para el estudio de los genomas pertenecientes a virus vegetales.
Objetivo
Familiarizarse con el uso de herramientas bioinformáticas y consulta de bases de datos disponibles a través de
internet, empleadas frecuentemente en el estudio molecular de genomas virales.
Desarrollo
Se analizarán tres clones obtenidos a partir de la secuenciación del genoma del CLRDV, estudiando el
nivel de identidad con otras secuencias depositadas en
bases de datos públicas y ubicando la posición de los
clones en el genoma del virus.
Además, se realizará el mismo análisis para la secuencia traducida (secuencia aminoacídica) de dichos clones. Se compararán y discutirán los resultados obtenidos para cada una de ellas.
Procedimiento
1. Identificar la carpeta virología molecular en el Escritorio de la computadora. Abrirla y localizar el archivo
clones.doc, allí se encuentra la secuencia de tres clones
correspondiente al CLRDV. Abrir el archivo con el
Word o el WordPad.
2. Buscar en la base de datos Genbank utilizando el
programa BLAST la identidad de los tres clones. A la
secuencia enviada, la denominaremos secuencia query.
Para ello acceder a través de la página del National
Center
for
Biotechnology
Information
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. Seleccionar Nucleotide blast (blastn).
3. Copiar la secuencia de cada archivo y pegarla en la
ventana del BLAST “enter query sequence”.
En programme selection elegir “somewhat similar sequence (Blastn)”.
En Chose Search Set elegir “Others (nr etc)”
Enviar la búsqueda (clic en “blast”).
4. Interpretar, analizar y discutir el resultado de las búsquedas con los docentes.
5. A partir de los resultados obtenidos mediante
BLAST, acceder a alguna de las secuencias con mayor
identidad. Discutir con el docente la información que se
obtiene.
Bajar y guardar alguna secuencia en formato fasta, siguiendo las instrucciones del docente.
6. Repetir del paso 2 al 4 pero utilizando la secuencia
traducida de los tres clones que se encuentra en el mismo archivo clones.doc. Para ello acceder a través de la
página del National Center for Biotechnology Information http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. Seleccionar
Protein blast (blastp)
¿Qué diferencias se observan respecto a la comparación
con la secuencia de nucleótidos realizada?
7. Realizar una búsqueda similar a la anterior (puntos 2,
3 y 4), empleando el programa FASTA. Para ello acceder a través de la página del European Bioinformatics
Institute http://www.ebi.ac.uk/fasta33/. Para un desarrollo más dinámico de la práctica, el resultado de esta
búsqueda se encuentra guardado en la carpeta virología
molecular con el nombre de fasta n clones 1, 2 ,3.doc.
¿Qué diferencias observa con el programa Blast?
8. Entrar a http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ y
discutir con los docentes las herramientas disponibles y
la utilidad de este sitio.
9. Entrar a la página
http://www.ictvonline.org/virusTaxonomy.asp?version=
2011 y discutir con los docentes la utilidad de este sitio
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Fitopatología Molecular
Julioo-Agosto 2014
TP 3: Marcadores Moleculares y Diversidad genética:
La detección y cuantificación de la variación genética,
generada por las modificaciones ocurridas en la secuencia de nucleótidos del ADN, ha progresado gradualmente desde las evaluaciones biométricas, los análisis
fisiológicos, los estudios bioquímicos isoenzimáticos, el
análisis del polimorfismo de longitud de fragmentos de
restricción (RFLP), hasta el advenimiento de la técnica de reacción en cadena de la polimerasa o PCR, que
permitió la incorporación de diversos métodos de detección del polimorfismo genético, directamente sobre
la molécula de ADN. Esta clase de marcadores podrían
definirse como los fenotipos/genotipos moleculares,
generados por el polimorfismo genético específico de
una secuencia conocida o desconocida de ADN, que puede o no ser codificante. Por consiguiente, los marcadores
moleculares permiten examinar el polimorfismo en
regiones codificantes, no codificantes y altamente variables de los genomas, tanto nucleares como de organelas, proporcionando con un alto grado de precisión, el
perfil genético de cada individuo analizado (“DNA
fingerprint” o huella digital genética del ADN).
La aplicación de estas herramientas en disciplinas
relacionadas a la Fitopatología permite:
La caracterización molecular de colecciones de aislamientos de especies patogé- nicas asociadas a cultivos
de interés agrícola.
El conocimiento del nivel de diversidad genética
presente en poblaciones de patógenos, el análisis de
la distribución de dicha diversidad y la estimación del
grado de similitud genética existente entre los aislamientos que las componen.
El estudio de la estructura genética de poblaciones de
patógenos y plagas
El desarrollo de sistemas de diagnóstico de patógenos e
identificación de plagas
Características de los marcadores moleculares
Las técnicas moleculares ofrecen numerosas ventajas
respecto a las técnicas tradicionales basadas en evaluaciones fenotípicas:
(1) Son estables y pueden detectarse en todos los tejidos, independientemente de la etapa de diferenciación,
desarrollo o crecimiento del organismo bajo estudio.
(2) No están afectados por el ambiente
(3) Generalmente carecen de efectos pleiotrópicos y
epistáticos.
Un marcador genético ideal debe cumplir con los siguientes requisitos:
(1) Manifestar altos niveles de polimorfismo. Se prefiere, de ser posible, el empleo de marcadores multialélicos
(2) Presentar alta heredabilidad, lo que implica que
debe ser altamente reproducible en la progenie
(3) Presentar segregación mendeliana y comportamiento co-dominante, esto es, la factibilidad de identificar las tres clases alélicas (AA, Aa y aa).
(4) Ser abundantes y dispersos por todo el genoma
(5) Ser fenotípicamente neutros y detectables en
cualquier momento del desarrollo del individuo.
Técnicas Numéricas
Daniela Tosto, Cintia Acuña
Las técnicas numéricas que se aplican a la taxonomía
[utilizando cualquier tipo de marcador (morfométrico,
bioquímico o molecular)], cuantifican la afinidad entre
unidades taxonómicas, basándose en el estado de los
caracteres que se eligen para ejecutar dicha tarea.
Para el análisis de marcadores moleculares los
caracteres están representados por los loci, o bien, por
las bandas electroforéticas amplificadas. En el caso de
marcadores moleculares dominantes como los AFLP y
los RAPD, se asume que cada banda amplificada corresponde a un alelo dominante, para un locus determinado, y por lo tanto sólo pueden ser detectadas dos
condiciones: la presencia de banda (que representa la
presencia del locus en estado de heterocigosis u homocigosis, sin poder discriminar entre ellos) y la
ausencia de banda (que representa la ausencia del locus
o la presencia de alelos nulos). Por otra parte, cuando se
analizan marcadores codominantes y multialélicos,
como los microsatélites, cada banda amplificada (que
corresponde a un alelo) es considerada como un carácter, y la presencia o ausencia del mismo, será considerada como el estado de dicho carácter. Las principales
características de estas metodologías son:
(a) Se efectúan considerando un gran número de ca(a)
( a ) Se efectúan considerando un gran número de caracteres, pudiendo ser éstos infinitos.
(b) Todos los caracteres utilizados tienen la misma
significación e importancia.
(c) La similitud total entre dos entidades es la suma de
la similitud en cada uno de los caracteres utilizados.
(d) Las asociaciones de los organismos no reflejan necesariamente genealogía del grupo.
1. Elección de las unidades: los organismos a estudiar,
definidos como OTUs (Unidades Taxonómicas Operativas) que pueden estar representadas por colección de
aislamientos, colecciones de semillas, variedades, cultivares, etc). Dado que se evalúa el ADN del organismo,
no interesa el estado fisiológico o de desarrollo del
mismo.
2. Elección de los caracteres y registro del estado de
cada uno de ellos (ej. presencia o ausencia de bandas
electroforéticas de RAPD, AFLP o alelos de microsatélites).
Carácter
Estado
Presencia
Banda de determinado tamaño molecular
Ausencia
Ejemplo para Bandas de AFLP de distintos pesos moleculares, expresados en pares de bases (pb)
200 pb, 182pb, 165 bp, 140pb, 120 bp, 100 bp, 94 bp,
75pb
En el caso de marcadores multilocus como los AFLP y
los RAPD, cada locus determina un carácter. Cuando se
trata de microsatélites, este tratamiento no puede realizarse. Se considera en cambio a cada alelo como un
carácter con sus ventajas y desventajas, como se explica a continuación.
Cuando los datos son del tipo cualitativo, con varios
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Fitopatología Molecular
Julioo-Agosto 2014
estados (por ejemplo alelos de microsatélites) y no poseen una secuencia lógica o están desordenados, los
mismos no pueden ser representados adecuadamente a
través de números, pues se carece de fundamentos para
establecer un orden determinado. En estos casos, se
transforma a cada estado (ej. alelo de determinado tamaño) en presencia o ausencia. La desventaja de esta
codificación es que al transformarse en varios caracteres independientes, aumenta su valor taxonómico en
detrimento de los no codificados de esta forma.
Ej: locus A
Alelo 1=120 pb, Alelo 2= 130 pb, Alelo 3= 140 pb
Codificación transformando los datos en doble estado
(1 y 0)
Alelo 1: presencia o ausencia
Alelo 2: presencia o ausencia “
Alelo 3: presencia o ausencia
En este caso, el locus A,
posee 3 caracteres. En
otros casos, como AFLP,
cada banda es un carácter.
Ejemplo de interpretación
de bandas:
calcular las similitudes o las diferencias a través de
operaciones matemáticas. Estos coeficientes pueden ser
clasificados en cuatro grupos: coeficientes de distancia,
coeficientes de correlación, coeficientes de asociación y
coeficientes de similitud probabilística. El tipo de estadístico aplicable a un grupo de datos, para el análisis
de las relaciones genéticas entre OTUs, depende del
tipo de datos evaluados. Específicamente, los coeficientes de asociación miden las coincidencias y diferencias
en los estados de los caracteres entre dos OTUs. Esta
medición exige caracteres de tipo doble estado. Al
comparar dos OTUs para un carácter doble estado pueden presentarse cuatro posibilidades: que las dos OTUs
presenten el carácter comparado (caso a), que sólo una
u otra lo presenten (casos b y c), o bien que el carácter
esté ausente en ambas (cado d).
Los coeficientes de asociación más frecuentemente
utilizados como medidas de similitud en análisis genéticos son:
SM Simple matching: (a+d)/(a+b+c+d).
DICE: 2a/(2a+b+c) (Dice (1945), Nei and Li, 1979)
JACCARD: a /(a+b+c), Jaccard (1908)
Estos coeficientes pueden variar entre un valor mínimo de 0 (cuando el par de individuos no tienen bandas
en común) y un valor máximo de 1 (cuando todas las
bandas presentes en un individuo están presentes en el
otro). Dependiendo de cuál de estos coeficientes se
utilice se acentúan distintos aspectos de la simi123456789
10
litud.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
111111111
1
5. Construcción de una matriz de similitud entre
110101000
1
OTUs.
000111111
1
Esta matriz es triangular, de OTU x OTU (orde111011101
0
nadas de igual forma en cada eje). En cada celda
000100000
0
se indica el valor de similitud obtenido para
101001110
1
ese par de OTUs y por lo tanto se obtienen
000000010
1
valores iguales 1 en la diagonal, por tratarse de
110011111
0
la similitud con la misma OTU.
111111111
1
Es triangular, pues la similitud entre la OTU1 y
la OTU2 por ejemplo, es igual que entre la
OTU2 y la OTU1, y por lo tanto la matriz supe3. Construcción de la Matriz Básica de Datos (MBD)
(organismos vs estados de los caracteres [1 y 0 según se rior resulta la imagen especular de la matriz inferior.
trate de presencia o ausencia de una determinada banda Matriz de similitud (MS) obtenida para la MBD conselectroforética (AFLP)]. Pueden existir datos perdidos, truida en el paso (3), donde se aplicó el coeficiente de
Jaccard, con presencia de datos perdidos:
codificados en el ejemplo con el valor 5.
OTU\pb 200 182 165 140 120 100 94 75
var1
1
1
0
0
0
0
0 5
var2
1
0
0
0
1
0
1 1
var3
0
1
0
5
0
1
1 0
var4
0
0
1
1
0
1
1 0
var5
5
0
0
5
1
1
0 0
4. Obtención de un Índice de similitud o asociación
entre todos los pares de organismos (OTUs)
Para expresar de manera cuantitativa el parecido entre
distintas OTUs existen varios coeficientes de similitud
(Jaccard, Dice, Simple Matching, entre
otros), que permiten
Var 1 Var 2 Var 3 Var 4 Var 5
Var 1
1
Var 2 0.25
1
Var 3 0.25 0.16
1
Var 4
0 0.14 0.5
1
Var 5
0 0.25 0.25 0.25
1
Índice de similitud de Jaccard (Sim J) entre var1 y
var2=1/4
Sim J entre var 2 y var 3=1/6
Sim J entre var 3 y var 4=2/4
Sim J entre var 4 y var 5=1/4
Sim J entre var 2 y var 4=1/7
6. Conformación de grupos.
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Fitopatología Molecular
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Dado que la matriz de similitud es insuficiente para
expresar las relaciones entre la totalidad de las OTUs
(pues sólo expone similitudes entre pares de OTUs), se
desarrollaron gran variedad de técnicas de análisis de
matrices de similitud, con el objeto de sintetizar la
información de dichas relaciones. La más utilizada es el
análisis de agrupamiento; esta técnica forma grupos de
OTUs que se asocian por su grado de similitud y en
general se utilizan técnicas secuenciales:
6.1) Se busca en la matriz de similitud, el mayor valor
(sin considerar los valores de la diagonal). Se identifican las OTUs involucradas y éstas constituirán el primer grupo
6.2) Se busca en la matriz, el próximo valor de mayor
similitud y se une al grupo anterior
6.3) Se repite este proceso hasta que se unen todos los
grupos
6.4) El agrupamiento de individuos puede observarse a
través de una representación gráfica, mediante la construcción de diagramas arborescentes denominados fenogramas.
Fenograma obtenido con la MS del paso (5)
grupo con el valor de similitud promedio entre la misma y
cada uno de los de las OTUs del grupo existente
A
BC
1
0.7
0.4 0.35 0.3
0
7. Medida de la distorsión del fenograma
El método de ligamiento que se emplea para agrupar los
individuos puede generar distorsiones en el fenograma
respecto de los datos de similitud originales. La cuantificación de dicha distorsión se realiza mediante el
cálculo de un coeficiente de correlación denominado
“cofenético”, que consiste en correlacionar la Matriz de
similitud original con una Matriz cofenética, que surge
de las similitudes observadas entre los pares de individuos comparados, en este caso, a partir de los datos del
fenograma.
Esquema del Análisis de Agrupamiento con marcadores moleculares AFLP
La incorporación de una OTU a un grupo existente
puede realizarse de tres formas distintas.
Ejemplo:
Matriz de similitud:
OTUA
OTUB
OTUC
OTUA
1
0.7
0.4
OTUB
1
0.3
OTUC
1
A
BC
1 0.7
0.4
0
Ligamiento simple: la nueva OTU se une al grupo con el
valor de similitud máximo al de las OTUs del grupo existente
Ligamiento completo: la nueva OTU se une al grupo con el
valor de similitud mínimo al de las OTUs del grupo existente
A
BC
1 0.7
0.4
0.3 0
• Ligamiento promedio (Unweighted Pair Group Method
Arithmetic Average o UPGMA): la nueva OTU se une al
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Fitopatología Molecular
Julioo-Agosto 2014
GUIA PARA USAR EL NTSYS 1.7/1.8/2.0
El desarrollo de esta práctica tiene como objetivos:
• La interpretación de datos provenientes de marcadores
moleculares.
• El uso de técnicas bioinformáticas (NTSys) para establecer relaciones fenéticas.
• La visualización de la aplicación práctica de ambas herramientas para la evaluación comparativa de la diversidad
genética
Construcción de la Matriz Básica de Datos
Construir la MBD [matriz de variables (bandas) x OTUs]
con los siguientes requisitos: (1) Construcción de la MBD
utilizando “Solo texto” de cualquier procesador de textos
(2) Si la MBD se construye en Excel, guardar con extensión “csv” y controlar luegoque los datos estén separados
por comas y no por puntos y comas.
“Si se tienen muchos datos, tratar de que sea lo más angosta posible, si es necesario debe transponerse la matriz.”
(3) Puede también construirse la MBD en Excel e importarla desde el editor de matrices del NTSYS versión pc
Códigos de entrada de los datos
Primer renglón:
1er n°: 1 si es matriz cuadrada o rectangular (no triangular)
2do n°: número de filas de la matriz. Si se aclaran los
nombres se coloca L.
3er n°: número de columnas
4to n°: 1 si existen datos perdidos
5 to n°: número asignado para el dato perdido
Segundo renglón:
Identificación de las OTUs. La nomenclatura de cada
OTU no debe contener signos y no debe superar los 8 caracteres. Se recomienda que los renglones que contengan
los nombres no superen el ancho de la pantalla.
Renglones sucesivos
Se incorporan los datos binarios de cada fila y columna
Ejemplo: Matriz básica de 5 variedades (filas) por 8 variables (columnas). Existen datos perdidos que se codifican
con 5. Los 1 indican presencia de banda y los 0 indican
ausencia de banda.
1 5L 8 1 5
var1 var2 var3 var4 var5
11000005
10001011
01050110
00110110
50051100
Una vez confeccionada la matriz en block de notas o bien
programas de texto sin formato o Excel (csv), se recomienda comprobar que la matriz no tenga errores mediante el
comando Output del menú GENERAL.
Empleo del editor de matrices del NTSYS
1) Construcción de la MBD en Excel siguiendo los mismos
pasos descriptos para su construcción en modo “solo texto”, exceptuando la identificación de las OTUs, renglón
que debe dejarse vacío. También debe dejarse vacía la 1°
columna, por debajo del 1° número en el primer renglón
N° de columnas (en el ejemplo representan a las variables (bandas)
Código para Matriz rectangular
N° de filas (en el ejemplo representan a las OTUs (variedades)
1
5
8
5
1
1
0
0
5
1
0
1
0
0
0
0
0
1
0
0
0
5
1
5
0
1
0
0
1
0
0
1
1
1
0
1
1
1
0
5
1
0
0
0
Código utilizado
para dato perdido
2) En el programa NTSYS, en la opción File, debe seleccionarse la opción Edit data file y abrir el archivo de Excel que
contiene la MBD. En la pantalla de edición vacía, seleccionar File y luego las siguientes opciones:
Import Excel ► using OLE…. y abrir nuevamente el mismo archivo de Excel que contiene la MBD
De manera automática se edita la matriz, pudiéndose con la
opción Row Labs identificar las diferentes OTUs. Puede observarse que el editor indica el tipo de matriz, número de filas y
columnas y el valor asignado a los datos faltantes.
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Fitopatología Molecular
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La matriz obtenida puede guardarse en File, opción Save file as… con la extensión “.NTS”. Se sugiere guardar la versión
importada desde el Excel sin modificaciones.
PASOS A SEGUIR PARA TODAS LAS VERSIONES DEL PROGRAMA:
1) Control de la Matriz Básica de Datos (MBD), o cualquier otra matriz generada por el programa
En Menú Principal: General, opción Output
Input file: ingresar el archivo
(extensiones “.txt” o “.nts)
Field width: dejar el valor predeterminado
Decimal places: dejar el valor predeterminado o
modificar según interés
Page width: cambiar el valor predeterminado a un
valor de
1000
Opción Compute para hacer correr la matriz
Output: NTSYSpc 2.02g, (C) 1986-1998, Applied Biostatistics Inc.
Date & time: 27/07/2004 11:09:15 a.m.
---------------------------------------- Input parameters
Read input from file: A:\Var.nts
Format: width=9 decimals=0
Page width: 80
Field width: 9
Decimal places: 0
Page width: 80
Matrix type =1(rectangular), size =5 by 8, missing value
code =5
C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8
------------------------------------------------------------1 |
1
1
0
0
0 0 0 5
2 |
1
0
0
0
1 0 1 1
3 |
0
1
0
5
0 1 1 0
4 |
0
0
1
1
0 1 1 0
5 |
5
0
0
5
1 1 0 0
• Los códigos de presencia/ausencia son distintos de 1/ 0,
respectivamente.
• El código utilizado para definir al dato perdido no es coincidente con los valores adjudicados en el cuerpo de la MBD
y/o el primer renglón de la matriz (ver código de entrada de
datos, pág.8)
• Excesivo número de columnas, en cuyo caso se sugiere
transponer la matriz
2) Construcción de la Matriz de Similitud (MS)
En Menú Principal:
Similarity
Errores que no permiten visualizar la matriz
• Códigos erróneos para la entrada de datos (error en el número de filas y/o columnas.
• El número de caracteres por “label” supera los 8 caracteres
permitidos.
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Fitopatología Molecular
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opción
SimQual
(Similarity
measures
Qualitative)
Input file: ingresar el archivo
(extensiones “.txt” o “.nts)
By rows?: la construcción de la MS entre filas o columnas depende de cuales sean las OTUs y cuales las variables, en el ejemplo las OTUs están dispuestas en las
filas.
Coefficient: elección del coeficiente de similitud a aplicar,
en el ejemplo J (Jaccard)
Output file: nombre del archivo donde se va a crear la MS
Positive code: predeterminado
Negative code: predeterminado
Opción Compute para obtener la matriz
3) Aplicación del Método de agrupamiento
En Menú Principal: Clustering opción SAHN
(Sequential Agglomerative Hierarical nested cluster
Analysis)
Input file: ingresar el archivo de la MS
Output tree file: nombre del archivo que va a guardar el fenograma
Clustering method: elección del método de agrupamiento de las OTUs, en el ejemplo UPGMA
In case of ties: La opción WARN elige sólo uno de
los posibles árboles y lo muestra, la opción FIND
permite ver más de un fenograma en caso de empate.
Opción Compute para ejecutar el agrupamiento
Permite observar el fenograma obtenido
según la opción WARN
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Fitopatología Molecular
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4) Visualización del Fenograma
En Menú Principal: Graphics opción Tree plot
Input file: ingresar el archivo del fenograma
Opción Compute para el dibujo del fenograma
Luego de la obtención del feno- grama, dentro
de Options la opción Plot options permite el
agregado del Título y subtítulo, modificaciones
en el tamaño y tipo de letras, definir el grosor de los brazos del fenograma y definir las es-
calas, entre otras posibles.
El fenograma puede copiarse mediante la opción Edit, luego
copy bitmap y pegarse en programas de texto (ej. Word) y
diseño gráfico (ej. Power Point)
5) Obtención de la Matriz Cofenética
En Menú Principal: Clustering opción Coph
Input tree file: ingresar el archivo del fenograma
Output coph. file: nombre del archivo que va a guardar
la Matriz Cofenética
Opción Compute para la obten- ción de la Matriz
6) Cálculo del Coeficiente de correlación Cofenético (CCC)
En Menú Principal: Graphics opción
MxComp
Input file 1: ingresar el archivo de la Matriz de
Similitud
Input file 2: ingresar el archivo de la Matriz
Cofenética
Normalize Mantel stat?: permite normalizar la
prueba de Mantel
Number
Opción Compute para la obtención del CCC y
prueba de Mantel
MxComp: NTSYSpc 2.02g, (C) 1986-1998, Applied Biostatistics Inc. Date & time: 28/07/2004 04:26:28 p.m.
---------------------------------------- Input parameters
Read X input from file: A:\Var Sim.nts Read Y input from file: A:\Var Cof.nts Mantel statistic will be normalized.
1000 random permutations will be performed.
Comments:
SIMQUAL: input=A:\Var.nts, coeff=J
by Rows, += 1.00000, -= 0.00000
Matrix type =3, size =5 by 5, missing value code ="none" (similarity) Comments:
SIMQUAL: input=A:\Var.nts, coeff=J
by Rows, += 1.00000, -= 0.00000
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Fitopatología Molecular
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SAHN: input=A:\Var Sim.nts, method=UPGMA, tie=WARN COPH: tree=A:\Var Fen.nts
Matrix type =3, size =5 by 5, missing value code ="none" (similarity) N
=
8
Mean X = 0.2574 SSx = 0.0805
Mean Y = 0.2237 SSy = 0.1099
Tests for association:
Matrix correlation:
r = 0.91409 (= normalized Mantel statistic Z)
Approximate Mantel t-test: t = 2.7043
Prob. random Z < obs. Z: p = 0.9966
Out of 1000 random permutations:
994 were < Z, 6 were = Z, and 0 > Z
(The observed comparison is not included in these counts.) The one-tail probability is:
p[random Z >= observed Z] = 0.0080
Representación gráfica de la correlación cofenética entre la Matriz de Similitud y la Matriz Cofenética
Bibliografía
Crisci, J.V. y López Armengol, M.F.1983. Introducción a la teoría y práctica de la taxonomía
numérica. Secretaría General de la Organización de
los Estados Americanos. Programa Regional de
Desarrollo Científico y Tecnológico, Washington
D.C.(Serie de Biología, n°26). 132 pp.
Dice, L. R. 1945. Measures of the amount of ecologic association between species.
Ecology, 26: 297-302.
Jaccard, P. 1908. Nouvelles rescherches sur la distribution florale. Bull. Soc. Vaud.
Sci. Nat., 44:223-270.
Johnson, S.C. 1967. Hierarchical clustering schemes.
Psychopmetrica. 32: 241-254. Rohlf, F.J. 1998.
NTSYS-PC Numerical Taxonomy and Multivariate
analysis System, Version 2.0. Exeter Software, Setauket., N.Y.
TP 4: Cuantificación por PCR en tiempo real de secuencias diagnósticas
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
La Reacción en Cadena de la polimerasa es una reacción de
biología molecular extremadamente sensible y altamente
específica. Esta metodología permite la detección, cuantificación e identificación específica de secuencias blanco de
interés presentes en el genoma o muestra a analizar. En la
actualidad es un método sumamente utilizado en diferentes
áreas.
El fundamento de la PCR consiste en la multiplicación in
vitro de un fragmento de ADN, mediante un proceso denominado amplificación, con el fin de aumentar su concentración hasta obtener una cantidad de copias de ADN que permita ser detectado. Este proceso de amplificación es fundamental porque las secuencias de ADN a detectar se encuentran en muy baja proporción con respecto al ADN total de la
muestra analizada.
Para la reacción de PCR se requieren, además del ADN en
estudio, los 4 nucleótidos (unidades constitutivas del ADN),
una enzima denominada Taq ADN polimerasa, que es la
encargada de sintetizar las millones de copias de un mismo
fragmento de ADN y por último un par de cebadores (primers en inglés) que son pequeñas secuencias de ADN de
simple cadena de alrededor de 20 a 30 bases, los cuales se
encargan de indicarle a la enzima donde iniciar la síntesis de
nuevas copias de ADN.
La gran especificidad de la PCR se sustenta en la capacidad
de los cebadores para reconocer por complementaridad de
bases una secuencia particular de ADN y para ello es necesa-
Paula Fernández
rio conocer, al menos parcialmente, la secuencia del ADN
que se quiere detectar para diseñar los primers adecuados.
La reacción ocurre en un equipo denominado termociclador
que regula los tiempos y temperaturas óptimos para que ocurra la reacción. La reacción tiene tres etapas: desnaturalización, hibridación y elongación.
 Etapa de desnaturalización, donde se produce la separación de las dos cadenas de ADN para obtener el ADN como
cadenas simples. Esta etapa ocurre a 94ºC o 95ºC.
 Etapa de hibridación (annealing en inglés) donde ocurre
el reconocimiento por parte de los primers de las secuencias
complementarias. Esta etapa se realiza a una temperatura que
resulta la óptima para ese reconocimiento. Dicha temperatura
varía de acuerdo al diseño de los primers y se encuentra dentro de un rango que va desde los 50 ºC hasta los 70 ºC. En
esta etapa sólo se produce la hibridación si el ADN de la
muestra que se estudia contiene las secuencias buscadas. Si
ellas no están presentes, no habrá unión y por lo tanto, no
habrá amplificación.
 Etapa de elongación, donde ocurre la síntesis de dos
nuevas cadenas de ADN a partir de la original, mediante la
acción de la enzima Taq polimerasa. Esto se desarrolla a una
temperatura de alrededor de 72º C, que es la temperatura
óptima de acción de la enzima.
Estas tres etapas forman un ciclo de PCR. Estos ciclos se
repiten de 30 a 50 veces.
15
Fitopatología Molecular
Julioo-Agosto 2014
Se busca la presencia o ausencia de bandas de un determinado peso molecular que se corresponden con el tamaño del
fragmento amplificado.
La lectura del producto de amplificación ocurre en la fase de
plateau de la PCR, por lo tanto, el tipo de resultado obtenido
es cualitativo (ausencia o presencia de la secuencia de interés) o semicuantitativos (en rangos de concentración). Para la
obtención de resultados de tipo cuantitativo por PCR convencional es necesario realizar el análisis individual de distintos conjuntos de muestras y tener en cuenta consideraciones estadísticas para el armado y cantidad de conjuntos a
analizar.
Esquema
de
la
amplificación
www.porquebiotecnologia.com.ar
por
PCR.
Cinética de la Reacción
La cinética de la reacción de PCR tiene tres momentos o
fases:
 La fase inicial, donde se encuentran pocas moléculas de
secuencias blanco (target) y alta concentración de los reactivos de PCR.
 La fase exponencial, donde la eficiencia de la síntesis de
las nuevas cadenas es máxima debido a que hay abundancia
de reactivos, de targets y de productos de PCR. En ella la
relación entre producto de PCR formado y el número inicial
de moléculas de ADN presentes en la muestra es directamente proporcional.
La fase de plateau, donde los reactivos de PCR se agotan y
existe un exceso de producto amplificado. Allí la eficiencia
de síntesis decae.
PCR
en tiempo real
Gráfico de la Cinética de reacción de la PCR.
Fotografía de los resultados por PCR en punto final. Gel
de agarosa. www.porquebiotecnologia.com.ar
PCR en tiempo Real
La técnica de PCR en Tiempo Real es una alternativa a la
PCR en tiempo final que permite la obtención de resultados
cuantitativos. La denominación de “tiempo real” se debe a
que el ADN amplificado puede ser detectado durante todo el
proceso de amplificación y no al final del mismo, como sucede con la PCR convencional.
La PCR en tiempo real combina el uso de un termociclador,
un sistema de detección de fluorescencia y una computadora.
El termociclador tiene acoplado un sistema para la detección
de fluorescencia. A medida que transcurre la reacción el
equipo toma señales de la fluorescencia generada y las analiza (en "tiempo real"). La señal de fluorescencia recolectada
es analizada por la computadora. La señal generada es directamente proporcional a la cantidad de producto de PCR amplificado. Como la lectura de los datos se realiza durante la
fase exponencial de la reacción, se obtiene así una cuantificación más adecuada y precisa del producto amplificado.
Esta metodología, siempre que sea adecuadamente diseñada
y puesta a punto, permite obtener una mayor sensibilidad y
especificidad. Dado que la amplificación y la detección ocurren al mismo tiempo, el análisis es más rápido que en la
PCR en punto final. Además, como no es necesario, manipular los productos de PCR se reduce la posibilidad de contaminación con estos productos.
Dentro de la metodología de PCR hay dos modalidades que
son ampliamente utilizadas. Ellas son: PCR en tiempo final y
PCR en tiempo real. Ambas se realizan en un termociclador.
La diferencia que presentan estas dos modalidades es la forma y fase en la cual se produce la detección del producto de
amplificación y por lo tanto, en el tipo de resultados obteniEntre las desventajas que presenta frente a la PCR en tiempo
dos.
final se pueden señalar su mayor costo, tanto en el equipo
como en los reactivos utilizados, así como la complejidad del
PCR en tiempo final
En la PCR en tiempo final una vez concluida la reacción, los diseño de los primers y sondas, que en muchos casos resultan
fragmentos amplificados son separados mediante electrofo- más exigentes.
resis en gel de agarosa y visualizados bajo luz ultravioleta
por medio de un colorante fluorescente (bromuro de etidio).
16
Fitopatología Molecular
Julioo-Agosto 2014
Fluorescencia
Ciclo de PCR
Esquema de una corrida de PCR. Lectura de Fluorescencia en función del ciclo de PCR para diferentes concentraciones de target.
Para la medición de la fluorescencia dos son las modalidades
más utilizadas: las sondas fluorescentes y los agentes intercalantes de ADN.
Las sondas son secuencias de oligonucleótidos que reaccionan por complementariedad de bases con un pequeño fragmento de la secuencia a amplificar. Estas sondas están marcadas con moléculas que emiten fluorescencia cuando se
produce la amplificación específica. Las sondas se colocan
en la reacción de PCR junto con los otros reactivos y solamente se detecta fluorescencia, si la secuencia de interés está
presente en la muestra y hay amplificación.
Entre las ventajas de estas sondas podemos mencionar la alta
especificidad de la reacción, debido a que sólo se genera
fluorescencia si la reacción específica de la PCR ha ocurrido
y la posibilidad de detectar y cuantificar múltiples targets en
una única reacción de PCR mediante el uso de varias sondas
distintas en la misma reacción.
Entre las desventajas que presentan podemos señalar el diseño de las sondas que deben resultar específicas y no interferir
con los primers; la necesidad de sintetizar una sonda distinta
para cada target que se quiere detectar; y por último el mayor
costo de la PCR debido a la incorporación de estas moléculas
marcadas.
Existen distintos modelos de sondas. Las más utilizadas son
las sondas que se hidrolizan (sondas Taqman). Además se
pueden mencionar las sondas conformacionales (Molecular
beacons, Scorpions, donde lo marcado y diseñados especialmente son los primers) y las sondas de hibridación.
El otro formato ampliamente utilizado son los agentes intercalantes de ADN. El mas empleado es el SYBR Green. El
SYBR Green es una molécula que presenta la característica
de no emitir fluorescencia cuando se encuentra en solución.
En presencia de ADN doble cadena, el SYBR Green se intercala entre las cadenas de ADN emitiendo así una señal
fluorescente. Este fluorocromo se agregar a la reacción de
PCR junto con los otros reactivos. Si en la reacción de PCR
hay amplificación, el SYBR Green se une al ADN de doble
cadena recién sintetizado en cada ciclo y va generando un
aumento en la señal de fluorescencia que es proporcional a la
cantidad de producto generado durante la amplificación.
Hay que tener en cuenta que esta reactivo no es específico de
una secuencia determinada y por lo tanto se intercala con el
ADN doble cadena que puede corresponder tanto a productos de amplificación específicos como inespecíficos. Para
evitar la generación de señal inespecífica, que llevará a resultados equivocados, es muy importante la optimización de la
reacción de PCR de manera tal de evitar la formación de
productos inespecíficos de PCR.
Entre las ventajas que presenta con respecto a las sondas se
pueden mencionar que dado que no necesita la síntesis de
sondas marcadas es un método más económico. Por otro
lado, puede ser utilizado para la detección y cuantificación
de diferentes secuencias sin necesidad de sintetizar sondas
diseñadas específicamente para ello.
Entre las desventajas, en comparación con las sondas fluorescentes, podemos mencionar su menor especificidad y el
hecho de que no es posible la cuantificación de diferentes
targets en una única PCR.
Si bien generalmente se menciona en la bibliografía sobre el
tema que la especificidad es menor a la que se obtiene utilizando sondas fluorescentes, es posible lograr alta especificidad. Para ello algunas de las estrategias a utilizar son:
 La optimización de la reacción de PCR para la amplificación de un único producto, asegurándose la ausencia de productos inespecíficos.
 El análisis de los productos de amplificación a través de
la lectura de la temperatura de fusión (melting point). Esta
temperatura (Tm) es aquella en la cual la mitad de las cadenas de ADN están como doble cadena y la otra mitad están
desnaturalizadas. Es propia y específica de cada producto de
amplificación, dado que dependen del tamaño del producto
amplificado y de la composición de las bases del mismo.
Para llevar a cabo este análisis, al final de la PCR se programa el equipo para realizar un paso más. Este consiste en
aumentar la temperatura muy despacio desde una temperatura baja (60ºC) a una temperatura alta (95ºC). Durante todo el
proceso se monitorea constantemente la fluorescencia generada y esta señal es recolectada por el equipo. A bajas temperaturas todos los productos de PCR están en la conformación
de doble cadena, por lo tanto el SYBR Green se une a ellos y
la emisión de fluorescencia es máxima. A altas temperaturas,
los productos se encuentran desnaturalizados resultando en
un rápido descenso en la señal de fluorescencia.
Al llegar a la temperatura de fusión, se produce un brusco
descenso en la señal de fluorescencia. Este descenso es detectado por el equipo y graficado. Así, se obtiene un grafico
de fluorescencia en función de la temperatura, donde se observa un pico (en la primera derivada de este gráfico) que
corresponde a la temperatura de fusión del producto.
Si la reacción ha sido puesta a punto de manera adecuada,
solo se espera ver la presencia de un pico que corresponde al
producto de interés.
Con el método de SYBR Green y analizando las curvas de
melting, es posible diferenciar los aporte a la señal de fluorescencia generada por los distintos productos (sean estos
específicos o inespecíficos). Generalmente los productos
inespecíficos formados presentan temperaturas de fusión
(Tm), menores a la del producto específico.
Cuantificación Absoluta
Determina la cantidad absoluta de muestra (expresado como
número de copias o concentración) Se determina utilizando
estándares externos. Estos estándares poseen secuencias que
17
Fitopatología Molecular
Julioo-Agosto 2014
son iguales o muy similares a la secuencia target y los sitios
de unión al primer son también idénticos. Esto asegura eficiencias de amplificación equivalentes de las moléculas estándar y target. La curva estándar es generada utilizando
diluciones seriadas de los estándares. Comparando los CT
(ciclo umbral, ciclo en el cual se detecta por primera vez
fluorescencia) de cantidades desconocidas de templado con
los de la curva estándar permite el cálculo de la cantidad
inicial de templado usado en la real-time PCR.
inespecíficos y resultara en un inadecuado análisis de las
curvas de melting, ya que estas se llevan a cabo una vez
completada la corrida.
Controles del proceso
Dada la alta sensibilidad de la técnica de PCR, es necesario
siempre descartar la ausencia de contaminación. Para ello se
utilizan controles negativos para el control de contaminación
de reactivos o de la matriz a analizar, así como para chequear
la ausencia de falsos positivos productos de reacciones inesCuantificación Relativa
pecíficas. Para ello, se utilizarán como controles de la reacDetermina la relación entre la cantidad de muestra blanco y ción de PCR:
la molécula de referencia, usualmente un gen de referencia.
Este valor normalizado puede ser utilizado para comparar  Control negativo de PCR. Este control contiene todos los
expresión diferencial de genes en muestras diferentes. El componentes de la reacción excepto el templado (ADN).
caso de aplicación más común de este método es el análisis Este control debe dar negativo (ausencia de amplificación
de la expresión génica o la determinación de la abundancia específica). Se lo utiliza para descartar la contaminación en
de RNA. El nivel de expresión de las moléculas de referen- los reactivos de PCR utilizados.
cia, como un gen de referencia de expresión estable, no debe  Control negativo de matriz. Este control es una muestra
variar bajo ninguna condición experimental, o aún en dife- que no presenta la secuencia target. Esta muestra sigue el
rentes estadios del mismo tejido (por ejemplo enfermedad vs. mismo proceso que las muestras a detectar. Su resultado
Muestras normales). Por lo tanto el nivel es utilizado como debe indicar ausencia de amplificación específica. Se la utiliun valor de referencia para la cuantificación.
za para descartar la presencia de contaminación desde la
extracción de ADN hasta la PCR.
Consideraciones generales útiles en PCR
Diseño de primers
Además de los controles negativos se incluyen siempre controles positivos. Ellos permiten la evaluación al final del
Longitud
18-30 nucleotidos
proceso de la eficiencia, la especificidad y la sensibilidad de
Contenido
40-60%
la reacción. Asimismo, permiten detectar la presencia de
de GC
sustancias inhibidoras que afectan la reacción de PCR. Se
Tm= 2ºC x (nº de [ A+T] + 4ºC x ( nº de[
utilizan muestras que contienen la matriz y la secuencia de
C+G] )
ADN a determinar. Ellas son incluídas desde el comienzo de
Tm
La temperatura óptima de annealing debe
ser unos grados por debajo de la Tm (alrede- la reacción y acompañan todo el proceso.
dor de 5ºC)
Generación de curvas estándar
 Longitud ideal del producto entre 100- Para generar una curva estándar para PCR en tiempo real, se
150 pb.
necesitan al menos 5 concentraciones conocidas y la canti Evitar la complementariedad de 2 o más dad de la muestra desconocida debe caer dentro de ese ranbases en los extremo 3´ de los pares de go. Los estándares deben poseer el mismo sitio de unión al
primers para reducir la formación de díme- primer, la misma secuencia entre los sitios de unión al priros.
mer, y las mismas secuencias río arriba y río abajo de la se Evitar seguidillas de 3 o más Guaninas en cuencia a amplificar que la muestra a ser cuantificada.
Secuencia
el extremo 3´.
 Evitar que el extremo 3´ termine con Objetivos del TP demostrativo:
Timina ya que tienen una alta tolerancia a Entender el procedimiento, técnica y exigencia en el diseño
los missmatch.
de una reacción o experimento basado en la tecnología de
 Evitar la complementariedad de secuen- qPCR.
cias dentro de la secuencia del primer y Conocer la metodología de análisis de una qPCR cuantitativa
entre los pares de primer.
y cualitativa.
Interpretar curvas y analizar resultados de experimentos de
qPCR.
Número de ciclos
Por lo general los programas constan de 35 a 45 ciclos, pero Conocer la complejidad, costo y rigurosidad de la técnica
se pueden llevar a cabo hasta 55 ciclos. Sin embargo, llevar a para poder decidir su aplicación en el futuro.
cabo tantos ciclos aumentará el background de productos
Ejemplo: Grafico de la corrida de PCR (Equipo LightCycler de Roche)
- Metodología: SYBR Green
- Análisis: Detección del Promotor 35S en muestras de maíz. Cuantificación absoluta
18
Fitopatología Molecular
Julioo-Agosto 2014
TP 5 DETECCIÓN DE Sclerotinia sclerotiorum EN CAPÍTULOS DE GIRASOL
Federico Ehrenbolger
requiere de un método de extracción técnicamente senPARTE I: Extracción y cuantificación de
cillo, rápido y eficaz.
ADN
S. sclerotiorum es un hongo necrotrófico. Se han reportado alrededor de 400 especies susceptibles a este patógeno. Algunos hospedadores son: girasol, soja, colza,
tomate, lechuga y cítricos entre otros. La podredumbre
húmeda del capítulo (PHC) es causada por la fase sexual del hongo, a partir de fructificaciones conocidas
como apotecios que producen ascoesporas. Este hongo
también produce en la Argentina la podredumbre basal
del tallo (PBT) desde los esclerocios, que germinan y
producen un micelio blanco que invade los tejidos de
las raíces superficiales y la base del tallo. Esta fase no
alcanza el nivel de importancia de la podredumbre del
capítulo. La etapa de mayor sensibilidad para el inicio
de la infección que conduce a la PHC es la floración, si
las esporas llegan y se depositan en el disco floral coincidiendo con condiciones favorables (al menos dos días
con humedad ambiental de 100%), germinan produciendo un micelio blanco que comienza a desarrollarse
entre las flores, penetra a través de ellas, invade el capítulo y continúa hasta receptáculo. Dentro del receptáculo el hongo puede o no desarrollarse. A medida que el
micelio avanza va consumiendo tejido y pudriendo
zonas del receptáculo. Cuando ya no queda material
fácilmente asimilable para el hongo, el micelio comienza el proceso de concentración e inicia la producción de
esclerocios de resistencia. Los esclerocios vuelven al
suelo como fuente de nuevo inóculo. La aparición de un
micelio blanco algodonoso del hongo en el frente del
capítulo es el primer signo de la presencia de la enfermedad, aunque no siempre es visible. Alrededor de 15
días post infección, pueden verse manchas de color
marrón claro localizadas en la parte trasera del receptáculo. Estas manchas tienen de 3 a 7 cm de diámetro y
en ellas un dedo puede introducirse fácilmente ya que
hay pudrición blanda. Si la enfermedad avanza los síntomas de la podredumbre pueden abarcar todo el capítulo y provocar la caída total o parcial, dejando en la parte
superior del tallo sólo fibras aisladas en forma de escoba.
Detección del patógeno fungíco:
Debido a las dificultades que se encuentran para identificar síntomas a tiempos cortos post-inoculación artificial, se han desarrollado técnicas basadas en PCR para
identificar la presencia o ausencia del hongo en un capítulo de girasol. Se han desarrollado primers para amplificar por PCR una región microsatélite que generan
fragmentos específicos para S. sclerotiorum y no generan productos inespecíficos, ni siquiera contra el hongo
filogenéticamente más cercano, Botrytis cinérea.
Extracción de ADN
El primer paso en el diagnóstico basado en técnicas de
detección a nivel de ADN es la purificación de esta
molécula de los otros componentes de la muestra.
Generalmente, en este tipo de estudios el número de
muestras a analizar es muy grande y, por lo tanto, se
En la literatura se encuentran descriptos distintos métodos de extracción de ADN que varían principalmente en
la clase de material del cual se parte (especie determinada, medio de cultivo, etc) y en la calidad del mismo
(tejido fresco; tejido liofilizado; etc.). Pero, los protocolos son básicamente similares con algunas modificaciones tratando de resolver los problemas específicos de la
especie bajo estudio.
Electroforesis
La técnica de electroforesis fue desarrollada hace unos
50 años, ganando fuerte aceptación a partir de la década
del 60. La técnica se basa en el movimiento de moléculas (proteínas –como isoenzimas- ácidos nucléicos) a
través de una matriz soporte (almidón, agarosa, acrilamida) con un buffer (TBE, TAE, etc.). La matriz funciona como un filtro, separando las moléculas de acuerdo con su tamaño y carga eléctrica neta que poseen al
ser sometidas a un campo eléctrico. En el caso de los
ácidos nucléicos, el grupo fosfato es responsable de la
fuerte carga negativa en condiciones de pH neutro, haciendo que los fragmentos migren hacia el polo positivo
(ánodo) durante la electroforesis. Como la carga eléctrica neta de los fragmentos es negativa, la separación
ocurrirá sólo en base al tamaño de los mismos.
Es posible verificar la separación de fragmentos de
ADN de entre 100 pb a 60 kb utilizando agarosa (una
forma refinada del agar extraído de las algas marinas).
El proceso de separación de fragmentos de ADN por
electroforesis depende básicamente del tamaño de los
fragmentos, de la concentración de la agarosa y del
voltaje aplicado. Durante la electroforesis, como la
agarosa actúa como si fuese un filtro separando los
fragmentos de diferentes tamaños, se observa que los
fragmentos menores migrarán más rápidamente en la
dirección del polo positivo, en tanto que los fragmentos
de mayor tamaño lo harán más lentamente. Así, fragmentos de diferentes tamaños son separados a lo largo
del gel. Al aumentar la concentración de agarosa se
dificulta el movimiento de los fragmentos a lo largo de
la matriz, permitiendo obtener una mayor separación de
los fragmentos de menor tamaño. Por otro lado, una
reducción en la concentración de agarosa, favorece la
separación de fragmentos mayores. Un incremento del
voltaje, aumenta proporcionalmente la velocidad de
migración de los fragmentos a lo largo de la matriz. De
esta forma, conociendo estas variables se pueden adecuar las condiciones ideales para proceder a la separación de fragmentos de ADN de distintos tamaños.
Actualmente, se disponen de kits comerciales para realizar extracciones de todo tipo. Estos productos comerciales permiten la obtención de extracciones de alta
pureza y reducen los tiempos de trabajo en gran medida, razón por la cual conviene evaluar la disponibilidad
de recursos y la reducción de tiempos.
Cuantificación de ADN
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Fitopatología Molecular
Julioo-Agosto 2014
Existen varias técnicas utilizadas en la cuantificación
del ADN. Algunas dependen del empleo de equipamientos costosos, como espectrofotómetros, mientras
que otras, menos precisas, son simples y económicas.
La elección de uno u otro método depende básicamente
de la disponibilidad de equipamiento y de los objetivos
del experimento a realizar con ese ADN.
Una técnica simple utilizada para la cuantificación del
ADN es el análisis comparativo de muestras coloreadas
con bromuro de etidio en geles de agarosa. Para lo cual
se requiere disponer de un ADN patrón de concentración conocida (como por ejemplo, ADN del fago lambda). La técnica consiste en la utilización de una secuencia ascendente de concentraciones de solución patrón de
ADN, pipeteadas lado a lado en un gel de agarosa en el
cual también se cargan las muestras de concentración
desconocida. Luego de someter el gel a electroforesis,
éste se colorea con una solución de bromuro de etidio y
se estima la concentración de las muestras estudiadas
por observación comparativa con la banda de ADN
patrón, mediante visualización con luz ultravioleta. De
esta forma, se estima la concentración desconocida del
ADN en cuestión. Asimismo, esta técnica permite controlar que el ADN aislado sea de alto peso molecular y
no se encuentre degradado. El ADN nativo debe migrar
como una banda nítida y compacta de alto peso molecular ya que se obtiene ADN de girasol junto con el ADN
de Sclerotinia sclerotiorum.
Objetivo del TP: Extracción de ADN a partir de tejido
de girasol infectados con ascoesporas de Sclerotinia
sclerotiorum. A su vez, detectar presencia o ausencia
del hongo en los distintos tratamiento (inoculado y no
inoculado)..
Protocolo experimental NucleoSpin® Plant II (MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG)
1) Agregue 200 ul de Buffer PL1 y 10 ul de RNase A
en un eppendorf de 2 ml. Rotular el tratamiento del
material.
2) A partir de capítulos macerados de girasol inoculados artificialmente con esporas del hongo, tome 20 mg
del mismo. Coloque el tejido en el tubo que posee el
Buffer PL1.
3) Vortexear la mezcla durante algunos segundos.
4) Incubar a 65ºC durante 30-60 min.
5) Centrifugar el lisado crudo a 11.000 rpm durante 5
mins a temperatura ambiente.
6) Transferir el sobrenadante a un tubo colector de 2
ml nuevo que contenga un filtro violeta provisto por el
kit. Evitar llevarse el lisado precipitado.
7) Agregar 450 ul del Buffer Pc y mezclar varias veces
pipeteando.
8) Poner un filtro verde en un tubo colector de 2 ml
nuevo y pasar 700 ul de la muestra.
9) Centrifugar a temperatura ambiente por 1 min a
11.000 rpm y descartar elución.
10) Repetir desde paso 8: agregar 700 ul hasta agotar
muestra.
11) Agregar 400 ul de solución PW1 al filtro verde y
centrifugar 1 min a 11.000 rpm. Descartar elución.
12) Agregar 700 ul de solución PW2 al filtro verde y
centrifugar 1 min a 11.000 rpm. Descartar elución.
13) Agregar 200 ul de solución PW2 al filtro verde y
centrifugar 1 min a 11.000 rpm. Descartar elución.
14) Centrifugar durante 2 mins a 11.000 rpm el filtro y
la columna para secar completamente la membrana de
silica.
15) Pasar el filtro verde a un eppendorf de 1,5 ml nuevo.
16) Agregar 50 ul de buffer de Elución PE a 65ºC y
centrifugar a temperatura ambiente por 60 segs. 11.000
rpm.
17) Repetir una nueva elución con 50 ul de Buffer PE a
65ºC.
18) Decartar filtro verde y guardar el ADN extraido a 20ºC hasta su utilización.
Electroforesis
1) Arme un minigel de electroforesis (0,8% agarosa en
TAE 1X): derrita la agarosa en el horno de microondas,
mezclando un par de veces durante este proceso. Enfríe
a 55°C aproximadamente. Selle los extremos de la cama
con cinta adhesiva de papel, acomode el peine y vuelque la agarosa. Elimine toda burbuja. Deje solidificar
(20 minutos, aproximadamente). Retire el peine y la
cinta adhesiva. Coloque la cama que contiene al gel en
una cuba de electroforesis. Coloque suficiente buffer
TAE 1X como para llenar la cuba, cubriendo unos 0,5
cm el gel.
2) Cargue un volumen de cada muestra (a la que se le
habrá adicionado buffer de carga, azul de bromofenol)
en los pocillos del gel (wells). La decisión sobre cuántos microlitros cargar en el gel dependerá básicamente
del tamaño de los pellets obtenidos, de la viscosidad de
la solución de ADN y de la experiencia anterior con el
material. Comúnmente, se carga de 1 a 5 μl de la solución de ADN extraído. Lado a lado con las muestras
siembre cantidades conocidas del ADN patrón, procurando tener una franja de concentraciones en las cuales
las muestras extraídas se encuentren. Generalmente,
con esta minipreparación se obtienen concentraciones
de 10 a 200 ng/μl. Por lo tanto, es interesante cargar
cantidades crecientes como 10, 50, 100 y 200 ng del
ADN de referencia.
3) Corra las muestras a voltaje constante (3 V/cm2)
hasta que el colorante azul de bromofenol haya migrado
2 cm aproximadamente.
4) Retire la cama de la cuba y tiña el gel en una solución de bromuro de etidio 1 μg/ml durante 20 minutos
con agitación constante.
PRECAUCIÓN: El bromuro de etidio es extremadamente mutagénico, use guantes y sea cuidadoso durante
la manipulación del gel.
5) Enjuague el gel en dH2O por 10 minutos (se pueden evitar los pasos de tinción y enjuague si se agrega
el bromuro de etidio a la agarosa ya derretida, antes de
volcarla en la cama). Coloque el gel sobre un transiluminador de luz UV y fotografíe.
20
Fitopatología Molecular
Julioo-Agosto 2014
PRECAUCIÓN: la radiación UV es particularmente
dañina para los ojos. Para minimizar la exposición,
asegúrese de que la fuente de luz UV esté adecuadamente cubierta con un acrílico. Use anteojos o una
máscara de seguridad que bloquee eficientemente la luz
UV. Use guantes cuando manipula materiales sobre la
fuente de luz UV. Este tipo de radiación es también
mutagénica y carcinogénica.
10X TAE Buffer: 400 mM Tris, 50 mM NaOAc, 7,7
mM EDTA
STOCK
1 litro
Tris Base (PM=121,10)
48,40 g
NaOAc (PM=82,03)
4,10 g
Na2EDTA (PM=380,20)
2,92 g
ddH2O
a volumen
Ajustar el pH en 8,0 con ácido acético glacial.
6) Observando la fotografía, estime la concentración
de ADN extraído por comparación con el ADN patrón
de concentración conocida.
DETECCIÓN DE SCLEROTINIA SCLEROTIORUM EN MUESTRAS CAPÍTULOS DE GIRASOL
PARTE II: Detección de secuencias específicas de Sclerotinia sclerotiorum mediante PCR
Consideraciones generales
Mediante la metodología de PCR, se amplificará un
fragmento de la secuencia microsatélite M13, con un
tamaño de 253 pb para S. sclerotiorum. Como control
positivo de la extracción del ADN se amplificará la
secuencia de la actina de girasol.
Figura 1: Esquema de la amplificación mediante la técnica de PCR. Los primers se destacan como rectángulos
negros)
Objetivo del TP: Detectar mediante la técnica de PCR
una secuencia específica de Sclerotinia sclerotiorum en
DNA extraído de capítulos de girasol inoculados artifi-
Reactivos
H2O MilliQ
Buffer 10X
MgCl2 50 mM
dNTPs 10 mM
Iniciador F 10 M
Iniciador R 10 M
Taq plat.(10 U/l)
ADN X l
Concentración final
---1X
4 mM
100 M
2,5 M
2,5 M
0,05 U/l
15-30 ng totales
Volúmen final
Mantener el orden de la lista de reactivos para preparar
la Premix. Una vez preparada, mezclar brevemente con
Vortex, aplicar un spin de centrífuga y enfriar en hielo.
4) Agregar 23 l de la Premix a cada tubo que ya
tiene el ADN. Tapar bien. Dejar los tubos en
hielo hasta colocarlos en el termociclador.
PRECAUCIÓN: Una vez que la Taq polimerasa fue
cialmente con el hongo necrotrófico o inoculados con
agua.
Protocolo experimental
a) Material
Cada grupo partirá del ADN extraído en la práctica
anterior.
b) Protocolo experimental
b.1.) Reacción de amplificación
Se llevará a cabo el siguiente procedimiento:
1) Rotular apropiadamente los tubos de PCR con
marcador de alcohol, (utilizar uno para cada
ADN y uno para el control negativo).
2)
Pipetear 2ul de ADN (20-30 ng) en los tubos
correspondientes y 2 l de H2O en el tubo “control negativo”.
3) Realizar una mezcla de reacción para cada uno
de los pares de primers a evaluar (Premix) según la siguiente tabla:
Volúmen x1 (l)
18,125
2,5
0,75
0,5
0,5
0,5
0,12
2
Volúmen total
l
l
l
l
l
l
l
(por tubo)
25
agregada a la Premix, trabajar siempre en hielo, ya
que la enzima pierde irreversiblemente actividad a
temperatura ambiente.
El programa de amplificación es el siguiente:
1 ciclo
95 C, 5 min (desnaturalización inicial)
40 ciclos
94 C, 45 sec (desnaturalización)
21
57 C, 45 sec (hibridación)
72 C, 45 sec (hibridación)
1 ciclo
72 C, 10 min (extensión final)
16 C, infinito (conservación de las
muestras)
5) Una vez terminado el programa, agregar a la
muestra 5 l de Buffer de Carga y guardar en
freezer a -20C hasta el momento de la visualización de los resultados.
b.2) Visualización de los productos de amplificación
Los productos de amplificación serán resueltos por
electroforesis en un gel de agarosa al 1,5%. Para ello, se
procederá de la siguiente manera:
6)
Mezclar en un Erlenmeyer la cantidad necesaria
de agarosa en el volúmen apropiado de buffer
TAE (Tris-Acetato -EDTA) 1X para obtener
una concentración final de 1,5%.
7)
Colocar la mezcla de agarosa en el horno microondas y calentar a baja potencia hasta el
primer hervor.
8)
Una vez fundida la mezcla, agregar el volúmen
necesario de una solución de bromuro de etidio
para obtener una concentación final de 0,5
g/ml en el gel.
PRECAUCIÓN: El bromuro de etidio es extremadamente mutagénico, use guantes y sea cuidadoso durante
la manipulación del gel.
9)
10)
Volcar la solución en la cama electroforética
(ésta debe estar apropiadamente nivelada y tener el peine colocado). Eliminar toda burbuja.
Esperar a que gelifique completamente antes de
usar.
Sumergir la cama junto con el peine en la cuba
Fitopatología Molecular
Julioo-Agosto 2014
6)
electroforética, la cual debe poseer buffer TAE
1X en cantidad suficiente para cubrir el gel. Retirar cuidadosamente el peine y proceder a la
siembra de las muestras (5-15 l por calle).
La corrida electroforética se llevará a cabo a
voltaje constante (8 V/cm) y los productos de
amplificación se visualizarán bajo luz UV.
PRECAUCIÓN: la radiación UV es particularmente
dañina para los ojos. Para minimizar la exposición,
asegúrese de que la fuente de luz UV esté adecuadamente cubierta con un acrílico. Use anteojos o una
máscara de seguridad que bloquee eficientemente la luz
UV. Use guantes cuando manipula materiales sobre la
fuente de luz UV. Este tipo de radiación es también
mutagénica y carcinogénica.
7)
Observe los patrones de amplificación obtenidos, detecte presencia o ausencia de la banda
específica esperada y analice los resultados.
c) Soluciones empleadas
TAE 10X: 400 mM Tris, 50 mM NaOAc, 7,7mM
EDTA
Tris base (PM=121,10)
48,40 g/l
Na2EDTA (PM=380,2)
2,92 g/l
NaOAc (PM=82,03)
4,10 g/l
Ajustar el pH en 8,0 con Ácido acético glacial
Buffer de carga
Azul de Bromofenol
Ó xylen cyanol
Glicerol
2 mg/ml
40% (v/v)
TP 6: Silenciamiento génico como sistema de defensa contra virosis
Gabriela Conti, A. Venturuzzi
El objetivo del Trabajo Practico es demostrar el silenciamiento génico post-transcripcional (PTGS) de un transgén a
nivel local y la supresión del mismo proceso por la actividad de una proteína viral (supresor) en hojas de Nicotiana
benthamiana de genotipo silvestre (wt) y en hojas de N. benthamiana de la línea 16C transgénicas para GFP.
Esquema general del proceso a nivel molecular
p35S
pBin61-GFP
Transcripción
pBic- dsGFP
GFP RNAdc
Cap
GFP mRNA
PolyA
GFP
Traducción
GFP siRNAdc
P19
pBin61-HcPro
GFP siRNA
Esquema de los vectores utilizados
Con estos plásmidos:
pBin61-GFP
pBic-dsGFP
KanR 50 ug/ml
pBin61-HcPro
se transforma Agrobacterium thumefaciens
GV3101 RifR 100 ug/ml, GentR 40 ug/ml
22
p35S
LB
Fitopatología Molecular
Julioo-Agosto 2014
GFP/dsGFP/P19
t35S
tnos
pBin61/pBic
Ntp II
pnos
RB
Ntp II
ori V
Preparación de las bacterias para infiltrar
1) Estriar en una placa de LB agar con los antibióticos
apropiados las bacterias portando los distintos plásmidos. Incubar durante dos días a 28C.
LB agar + Rif 100 ug/ml, Gent 40 ug/ml, Kan 50
ug/ml
2) Inocular con una colonia aislada 3 ml de LB líquido
en un tubo de cultivo con los antibióticos apropiados.
Incubar con agitación (200 r.p.m) a 28C ON.
LB + Rif 100 ug/ml, Gent 40 ug/ml, Kan 50 ug/ml
3) Inocular con los 3 ml del cultivo obtenido 30 ml de
LB líquido e incubar con agitación (200 r.p.m) ON a
28C.
LB + Rif 100 ug/ml, Gent 40 ug/ml, Kan 50 ug/ml
Acetosiringona 20 µM
4) Centrifugar el cultivo de bacterias durante 10 minutos a 4.000 r.p.m y a 4C. Resuspender las bacterias
en Solución de MES. Llevar a OD600=1. Incubar las
bacterias a temperatura ambiente al menos durante 2
horas (puede ser ON). Para las co-infiltraciones se
realizan mezclas de partes iguales de la agrobacterias portando los distintos plásmidos.
Solución de MES + acetosiringona 100 µM
Nota: Al resuspender las bacterias con la solución
de MES utilizando el mismo volumen que el de LB
utilizado para crecerlas (en este caso 30 ml) se obtiene una suspensión bacteriana de OD600 ≈ 1.
5) Agroinfiltrar hojas en la cara abaxial con la suspensión bacteriana utilizando una jeringa.
Material Vegetal
Plantas de N. benthamiana wt y de la línea 16 C de aproximadamente un mes de edad. Deben ser plantas saludables en etapa vegetativa de un estado intermedio de desarrollo.
Esquema de agroinfiltración (Expresión de GFP vista al
UV después de 4 días post-agroinfitlración)
pBin61-GFP
pBic- dsGFP
pBin61-GFP
pBic- dsGFP
pBin61-GFP
+
pBic-dsGFP
pBin61-GFP
+
pBic-dsGFP
+
pBin61-HcPro
pBin61-GFP
+
pBin61-HcPro
pBic-dsGFP
+
pBin61-HcPro
N. benthamiana
wt
N. benthamiana
16C
Tejido expresando GFP
23
Fitopatología Molecular
Julio-Agosto 2014
Medios, soluciones necesarias y antibióticos necesarios
LB
Extracto de levadura
5 g/L
Bactotriptona®
10 g/L
NaCl
10 g/L
Agua csp 1 L
Ajustar a pH 7,5 con NaOH 5 M
LB – Agar: Agregar a 1L de LB
Solución de MES
MES (ácido N-morpholinoetanesulfonico) 10 mM
MgCI2
10 mM
Agua bidestilada
Autoclavar la solución.
Rifampicina [100 mg/ml]
Disolver 100 mg de rifampicina en 1 ml de Metanol, esterilizar
la solución por filtrado (filtro de 0,22 micrones). Consevar a 20C (la rifampicina es fotosensible por lo que es conveniente
envolver el eppendorf con papel de aluminio)
Gentamicina [25 mg/ml] y kanamicina [50 mg/ml]
Disolver la cantidad adecuada
de antibiótico en agua bidestilada, esterilizar la solución por
filtración y conservar a -20C.
Acetosiringona [200 mM]
Disolver 40 mg de acetosiringona en 1 ml de DMSO. Conservar a -20C.
Referencias
 Vazquez Rovere, C.; Bazzini, A.; Rodríguez, C.; Almasia, N; Asurmendi, S. Métodos para generar y analizar diversidad. Usos del
Silenciamiento génico para el análisis funcional de genes candidatos.
En: Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II - V. Echenique, C.
Rubinstein, E. Hopp y L. Mroginski (eds), Editorial INTA, 2010, en
prensa.
 Bazzini A.A, Mongelli V.C, Hopp H.E, Del Vas M, Asurmendi S
(2007) A practical approach to the understanding and teaching of
RNA silencing in plants. Electronic Journal of Biotechnology 10 (2),
178-190.
yectos de genomas de organismos complejos. Hoy, con
la difusión de mas de 1000 genomas completos de diversos organismos
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/genome) y el inicio
de otros tantos, con más de 150 billones de pares de bases
depositadas en GenBank, estamos transitando la era post
genómica, iniciada a mediados de la década del 2000.
Actualmente el énfasis esta puesto no solo en la secuenciación de genomas de especies aun no descifrados total o
parcialmente sino en la resecuenciación de genomas conocidos, para la identificación de variantes alélicas asociadas a diversidad fenotípica, en distintas especies de
importancia económica, con importantes avances para el
genoma humano (The International HapMap Consortium,
2003, 2005; The ENCODE Project Consortium, 2004).
Esto es posible gracias al desarrollo de diferentes tecnologías e instrumental en continuo proceso de actualización (ver ej. en Tabla 1).
La secuenciación capilar con equipos como el Applied
Biosystems Incorporated (ABI) 3130 que se utilizará en
esta práctica, permite la lectura simultánea de distintas
muestras (16, para este equipo), con muy buena resolución y lecturas largas de hasta 800 bp, utilizando distintos fluoróforos. Los fluoróforos mas comúnmente usados
son los basados en el colorante rhodamine (R110, REG,
TAMRA and ROX) que son excitados a una longitud de
onda de 488 nm y emiten fluorescencia a distintas longitudes de onda (Figura 1a).
ABI desarrolló un sistema de terminadores llamados “Big
Dye terminators” que son utilizados en la secuenciación
automática (Figura 1b)
Figura 1a
TP Nº 7: Secuenciación por Electroforesis Capilar de Fragmentos Fluorescentes
Andrea Puebla
Las estrategias de secuenciación basadas en el método de
terminación de la cadena por incorporación de nucleótidos dideoxi (ddNTPs) desarrollado por Sanger mas de 30
años atrás han sufrido un proceso de cambio y superación
continuo desde la detección de moléculas radioactivas en
geles hasta la actual detección fluorescente mediante
secuenciación en paralelo en microcapilares o las estrategias de secuenciación en fase sólida basada en chips
(Tabla 1). La incorporación de sistemas de detección
fluorescerente en la década del 80 permitió el inicio de la
secuenciación genómica y la entrada, en la década del 90,
en la era genómica, con los reportes de los primeros genomas completos de E.coli y C. elegans y el inicio del
proyecto Genoma Humano cuyo borrador fue liberado en
2001 y finalizado oficialmente en Abril 2003.
El desarrollo de secuenciadores automáticos basados en
electroforesisis capilar, el perfeccionamiento de los sistemas de detección fluorescentes y el desarrollo de herramientas de análisis de secuencias a gran escala posibilitaron el desarrollo de estrategias de secuenciación mas
eficientes con el consiguiente abaratamiento de costos
unitarios, y el concomitante desarrollo de números pro-
Parte A: Ensayo de secuenciación de ADN con Terminadores fluorescentes y secuenciador automático
Objetivo:
Cuantificar ADN por fotometría y fluorometría (Spectra
Max Gemini EM)
Realizar una reacción de secuenciación de ADN utilizando diferentes templados (plásmidos, productos de PCR y
BAC/COS).
Purificar por precipitación las reacciones de secuenciación.
24
Fitopatología Molecular
Julio-Agosto 2014
Preparar las muestras manualmente y con estación de
trabajo para análisis en secuenciador automático.
Realizar la electroforesis capilar de los productos de secuenciación en secuenciador automático (Genetic
Analyzer 3130xl, Applied Biosystems)
Materiales:
ADN (distintos templados).
Iniciadores universales y específicos para cada templado particular.
Fluoróforo para cuantificación por fluorometría (Hoechst en
buffer TNE)
ADN control de timo de ternera para la curva estándar.
Kit de secuenciación con terminadores fluorescentes (Big Dye
Terminador v3.1, Applied Biosystems).
EDTA 125 mM, etanol absoluto y etanol 70% para precipitación.
Formamida HiDi.
Polímero comercial para la electroforesis capilar de fragmentos
de ADN.
Buffer con EDTA para electroforesis capilar.
Equipamiento:
Espectrofotómetro:
Nanodrop ND-1000 (Thermoscientific).
Espectrofluorómetro: Spectra Max Gemini EM.
Termociclador de 96 pocillos: GeneAmp PCR system 9700
(Applied Biosystems)
Sistemas automatizados para manejo de líquidos: Biomek FX
(Beckman Coulter).
Secuenciador automático de 16 capilares: Genetic Analyzer
3130xl (Applied Biosystems)
Equipamiento general
de biología molecular
Curva Std Promedio
Actividades
1) Cuantificación de
ADN
[cc]
15
27
57
116
150
215
305
Reacción ¼ X
BDT v3.1
5 x Seq Buffer
Primer 5 mM (5 pmol)
Templado (conc. vs)
Agua calidad ultrapura
Volúmen
1 ul
1.5 ul
2ul
hasta 10ul VF

Elongación en termociladores
 96°C 1 min.
25 ciclos
 96°C 10 seg.
 50°C 5 seg.
 60°C 4 min.
 Purificación por precipitación
Agregar: 2,5 l EDTA 125mM + 30 l Etanol absoluto.
Centrifugar 45 min a Max veloc. (4.000 rpm) en
centrífuga de placas. Eliminar solventes por inversión.
Agregar: 120 l Etanol 70%.
Centrifugar 15 min a Max veloc. (4.000 rpm) en centrífuga de placas. Eliminar solventes por inversión.
Secar precipitados a 37ºC por 30 min.
3) Preparación de muestras para electroforesis en secuenciador automático con sistemas automatizados
para manejo de líquidos
F
19
106
193
428
542
842
1197
Tipo de templados y
concentración requerida:
Templado
Concentración
Productos de PCR
100-200 pb
5 ng/ul
200-500 pb
15 ng/ul
500-1000 pb
30 ng/ul
1000-2000 pb
60 ng/ul
mayor a 2000 pb
75 ng/ul
ADN doble cadena
200 ng/ul
ADN simple cadena
100 ng/ul
BAC/Cósmidos
200 ng/ul
Cuant HOECHST - SEQ#08y09 - 20/01/2009
y = 0,2591x
R2 = 0,9954
350
300
cc
250

200
150
100
2)
Reacción de secuenciación y purificación
50
Preparación
de la Mix de seq
0
0
200
400
600
800
F
1000
1200
1400
25
Fitopatología Molecular
Julio-Agosto 2014
TABLA 1 (adaptada de Mitchelson et al 2007. En: New High
throughthput Technologies for DNA sequencing and Genomics. Ed K. Mitchelson , Elservier, UK)
1
C15
C27
C57
C116
C150
C215
C305
C0
2
C15
C27
C57
C116
C150
C215
C305
C0
3
Muestra1
Muestra2
Muestra3
Muestra4
Muestra5
Muestra6
Muestra7
Muestra8
4
Muestra9
Muestra10
Muestra11
Muestra12
Muestra13
Muestra14
Muestra15
Muestra16
Electroforesis capilar en secuenciador automático con sistemas
automatizados para manejo de líquido
PARTE B: Análisis de Secuencias de ADN utilizando
el programa Sequencing Analysis 5.1
Sequencing Analysis
Objetivo: Analizar los resultados de las corridas electroforéticas de secuencias de ADN provenientes de distintos
tipos de templados, editar los resultados obtenidos y discutir la calidad de los mismos.
Materiales:
Archivos de las corridas electroforéticas de secuencias de
ADN realizadas en el secuenciador autómatico ABI 3130
xl con el programa Data Collection 3.0 (CD).
Computadora con el programa Sequencing Análisis 5.1
Actividades
PROYECTO 1
1. Adicionar muestras al programa en Sample Manager.
2. Setear Analysis Protocol para este proyecto:
a.
General:
Nombre
Seq File Format: Write Standard
Chromatogram Format File
b.
c.
d.
Basecalling:
a.
b.
c.
d.
e.
KB.bcp
POP7.BDTv3.mob
True Profile
Ending base: After
1000bp
Quality Threshold:
Do not assign N’s
to Basecalls.
Mixed Bases: Desactivado
Clear Range: Desactivado
3.
Apply to all Samples
Done
4.
Indicar analisis de Base Calling (BC)
ANALIZAR
5. Revisar:
Raw
EPT
Annotation:
o Sample Name
o Capillary
26
o
o
o
Bases detected
Average Signal Intensity
Simple Store
Sequence View: Barras de Calidad e Indice de Phred
Electropherogram View: editar bases
GUARDAR
PROYECTO 2 Y 3:
Cambiar seteo:

Base calling: Quality Threshold: Assign N’s to
Basecalls.

Mixed Bases

Clear Range
Reanalizar los datos y discutir diferencias.
Algunas Reglas Básicas de Higiene y Seguridad en
Laboratorios
Las medidas de Seguridad en Laboratorios son un conjunto de medidas preventivas destinadas a proteger la salud de los que allí se
desempeñan frente a los riesgos propios derivados de la actividad,
para evitar accidentes y contaminaciones tanto dentro de su ámbito de
trabajo, como hacia el exterior.
Las reglas básicas aquí indicadas son un conjunto de prácticas de
sentido común realizadas en forma rutinaria.
El elemento clave es la actitud proactiva hacia la seguridad y la información que permita reconocer y combatir los riesgos presentes en el
laboratorio. Será fundamental la realización meticulosa de cada técnica, pues ninguna medida, ni siquiera un equipo excelente puede sustituir el orden y el cuidado con que se trabaja.
1. Se deberá conocer la ubicación de los elementos de seguridad en
el lugar de trabajo, tales como: matafuegos, salidas de emergencia,
mantas ignífugas, lavaojos, gabinete para contener derrames, accionar
alarmas, etc.
2. No se permitirá comer, beber, fumar o maquillarse.
3. No se deberán guardar alimentos en el laboratorio, ni en las heladeras que contengan drogas.
4. Se deberá utilizar vestimenta apropiada para realizar trabajos de
laboratorio y cabello recogido (guardapolvo preferentemente de
algodón y de mangas largas, zapatos cerrados, evitando el uso de
accesorios colgantes).
5. Es imprescindible mantener el orden y la limpieza. Cada persona
es responsable directa de la zona que le ha sido asignada y de todos
los lugares comunes.
6. Las manos deben lavarse cuidadosamente después de cualquier
manipulación de laboratorio y antes de retirarse del mismo.
7. Se deberán utilizar guantes apropiados para evitar el contacto con
sustancias química o material biológico. Toda persona cuyos guantes
se encuentren contaminados no deberá tocar objetos, ni superficies,
tales como: teléfono, lapiceras, manijas de cajones o puertas, cuadernos, etc.
8. No se permitirá pipetear con la boca.
9. No se permitirá correr en los laboratorios.
10. Siempre que sea necesario proteger los ojos y la cara de salpicaduras o impactos se utilizarán anteojos de seguridad, viseras o pantallas
faciales u otros dispositivos de protección. Cuando se manipulen
productos químicos que emitan vapores o puedan provocar proyecciones, se evitará el uso de lentes de contacto.
11. No se deben bloquear las rutas de escape o pasillos con equipos,
máquinas u otros elementos que entorpezcan la correcta circulación.
12. Todo material corrosivo, tóxico, inflamable, oxidante, radiactivo,
explosivo o nocivo deberá estar adecuadamente etiquetado.
13. No se permitirán instalaciones eléctricas precarias o provisorias.
Se dará aviso inmediato a la Secretaría Técnica en caso de filtraciones
o goteras que puedan afectar las instalaciones o equipos y puedan
provocar incendios por cortocircuitos (Interno 355).
14. Se requerirá el uso de mascarillas descartables cuando exista
riesgo de producción de aerosoles (mezcla de partículas en medio
líquido) o polvos, durante operaciones de pesada de sustancias tóxicas
o biopatógenas, apertura de recipientes con cultivos después de agitación, etc.
Fitopatología Molecular
Julio-Agosto 2014
15. Las prácticas que produzcan gases, vapores, humos o partículas,
aquellas que pueden ser riesgosas por inhalación deben llevarse a
cabo bajo campana.
16. Se deberá verificar la ausencia de vapores inflamables antes de
encender una fuente de ignición. No se operará con materiales inflamables o solventes sobre llamas directa o cerca de las mismas. Para
calentamiento, sólo se utilizarán resistencias eléctricas o planchas
calefactoras blindadas. Se prestará especial atención al punto de
inflamación y de autoignición del producto.
17. El material de vidrio roto no se depositará con los residuos comunes. Será conveniente ubicarlo en cajas resistentes, envuelto en papel
y dentro de bolsas plásticas. El que sea necesario reparar se entregará
limpio al taller.
18. Será necesario que todo recipiente que hubiera contenido material
inflamable, y deba ser descartado sea vaciado totalmente, escurrido,
enjuagado con un solvente apropiado y luego con agua varias veces.
19. Está prohibido descartar líquidos inflamables o tóxicos o corrosivos o material biológico por los desagües de las piletas, sanitarios o
recientes comunes para residuos. En cada caso se deberán seguir los
procedimientos establecidos para la gestión de residuos. Consultar al
Servicio de Higiene y Seguridad (Interno 275).
20. Cuando sea necesario manipular grandes cantidades de materiales
inflamables (más de 5 litros.) deberá tenerse a mano un extintor apropiado para el material en cuestión.
21. Cuando se trasvase material combustible o inflamable de un tambor a un recipiente más pequeño, realice una conexión con una cadena
del tambor a tierra y con otra entre el tambor y el recipiente de manera
de igualar potenciales y eliminar la posible carga estática.
22. Al almacenar sustancias químicas considere que hay cierto número de ellas que son incompatibles pues almacenadas juntas pueden dar
lugar a reacciones peligrosas. Ante dudas consultar al Servicio de
Higiene y Seguridad (Interno 275).
23. No almacene en estantes sobre mesadas sustancias corrosivas,
hágalo en estantes bajo mesadas y en caso de ácidos o álcalis concentrados (mayor de 2N) deben ser mantenidas dentro de lo posible en
bandejas de material adecuado.
24. Los cilindros de gases comprimidos y licuados deben asegurarse
en posición vertical con pinzas, grampas y correas o cadenas a la
pared en sitios de poca circulación, protegidos de la humedad y fuentes de calor, de ser posible en el exterior.
25. Los laboratorios contarán con un botiquín de primeros auxilios
con los elementos indispensables para atender casos de emergencia.
26. Se informará al Dpto. de Seguridad y Control cuando se necesiten
dejar equipos funcionando en ausencia del personal del laboratorio.
27. Se anotará en un lugar visible desde el exterior los teléfonos de los
responsables de cada laboratorio para que puedan ser consultados en
caso de alguna anomalía verificada por el personal de Seguridad y
Control en su recorrida fuera de los horarios habituales de trabajo.
Procedimientos ante emergencias
 Emergencias médicas
Si ocurre una emergencia tal como: cortes o abrasiones, quemaduras o
ingestión accidental de algún producto químico, tóxico o peligroso, se
deberá proceder :
1. A los accidentados se les proveerán los primeros auxilios.
2. Simultáneamente se tomará contacto con el Servicio Médico
(Interno 482), o al Servicio Médico de Deportes (784-4351 / 3948)
3. Avise al Jefe de Laboratorio o autoridad del Departamento, quienes solicitarán asistencia de la Secretaría Técnica (interno 380) para
que envíen personal del Dpto. de Mantenimiento, Seguridad y Control
o Servicios Generales según correspondan.
4. El Jefe de Departamento notificará el accidente al Servicio de
Higiene y Seguridad para su evaluación e informe, donde se determinarán las causas y se elaborarán las propuestas para modificar dichas
causas y evitar futuras repeticiones.
-------------------------------------------------------CUPÓN PARA ENTREGAR AL DOCENTE
Fecha:
El/La alumno/a .............................................
de la materia Fitopatología Molecular ha leído minuciosamente la guía de Normas de
Seguridad que acompaña esta guía.
-------------------------------------------------------27