Clase 10 AGBT 2015 Editado Genico.pdf
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AGROBIOTECNOLOGIA CURSO 2015 Editado Génico Sebastian Asurmendi Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Universidad de Buenos Aires - Transgénesis NEW PLANT BREEDING TECHNIQUES Nuclease-based gene targeting (NBGT): ZINC FINGER NUCLEASE TECHNIQUE OLIGONUCLEOTIDE DIRECTED MUTAGENESIS MEGANUCLEASE TECHNIQUE CISGENESIS AND INTRAGENESIS REVERSE BREEDING RNA DIRECTED DNA METHYLATION EARLY FLOWERING AGROINFILTRATION GRAFTING ON GM ROOTSTOCK Gene Targeting en plantas Gene Targeting: técnica que emplea la recombinación homóloga para modifidar el genoma de un organismo vivo, primordialmente desarrollada en la levadura Saccharomyces cerevisiae. Durante el proceso un fragmento de ADN exógeno ingenierizado se introduce en una célula para modificar en forma permanente la copia genómica endógena creando un cambio seleccionable y heredable en el genoma. Gene targeting por Recombinación homóloga de genes no seleccionables: en levaduras y otros hongos desde los 80 En otros eucariotas: misión imposible Ratones: células ES + selección positiva +selección negativa Se necesita: Método para introducir el DNA Interacción donante-target por RH Método para detectar y seleccionar las células/organismos modificados Ausencia de reacciones de competencia( inespecíficas) Gene conversion Experimentos de transformación de levadura, Hinnen et al 1978) Integración del plásmido sitio específica Recomb Homóloga + de una copia Ilegítima Un corte doble cadena (DSB) en el “donante” promueve la recombinación en ese sitio ends-in strategy (Hastings et al., 1993). Interrumpe pero no deleciona Reemplazo génico en levaduras Targeted gene replacement (ends-out strategy) (Rothstein, 1983) Secuencias homólogas Marcador de selección No deleciona todo Impide uso repetido Se transforman las células con un fragmento liberado por restricción (u otro fragmento) Reemplazo génico Reemplazo génico en levaduras Reciclado del marcador Los primers tienen 60 nt, 20 pegan el marcador y 40 son homólogos al sitio de integración Liberación del casette transformación transformación Reemplazo génico Escición del marcador Uso del sistema Cre-Lox para reciclar el marcador Apilar knockouts Gene Targeting en ratones selección positiva selección negativa Poco frecuente Mayoritario Gene targeting en ratones requiere céllas ES, para seleccionar el evento invitro La introducción de DSB aumenta la frecuencia de integración transgénica Hig R ½ KanR Sitio endonucleasa Puchta, 1996 Reparación del Corte doble hebra (DSB) Single-strand annealing. Homologous recombination Nonhomologous end-joining. NHEJ Reparación de DSBs por HR synthesis-dependent strand annealing SDSA DSBR El terminal a ser reparado aparea con un homólogo Two-ended breaks that involve joint molecule formation with both ends result in double Holliday junctions that need to be separated into two intact chromatids H.J. Reparación de DSBs por Nonhomologous endjoining. (NHEJ) DNA end processing Bridging of the DNA ends and promotion of end stability Ligation of the DNA ends and dissolution of the NHEJ complex. Nuclease-based gene targeting (NBGT) Nuclease-based gene targeting (NBGT) Model showing the individual Zif268 fingers docked against ideal B-DNA with ten bp per turn. Each finger has been docked in a way that preserves the local DNA contacts. A dashed line indicates the distance each of the linkers would have to span (measured from carbon to carbon of the indicated residues); the omitted residues could span at most 17.5 Å in extended conformation. Finger one is colored red; finger two, yellow; finger three, purple; and the DNA, blue Zinc-finger nuclease (ZFN)-1 Zinc-finger nuclease (ZFN)-1 Reconoce hasta 18 pb Zinc-finger nuclease (ZFN)-2 Detección de las mutaciones Los spacers son críticos, se ingenierizaron heterodímeros para mayor especificidad y menor toxicidad Dominio FokI Uso del NHEJ para reemplazo alélico Toma ventaja de la preponderancia del NHEJ sobre la HR Weinthal et al 2013 Reemplazo génico por NHEJ Problemas con los Zinc-fingers: Falta especificidad para ciertos tripletes Efectos del contexto Naturaleza empírica del sistema Demanda de recursos Dominio de unión a DNA de los efectores TAL TALE: Transcription activator–like (TAL) effectors Se encontraron en Xanthomonas. Factores de virulencia, efectores injectados Por TipoIII Secretion system, regulan expresión génica en la planta, desarrollan síntomas expanden la colonización 33-35 aa c/u Truncado en 20 13-28 repeats Polimorfismo Residuos 12-13 T precede Frecuencia/ código Cada repetición reconoce una base! TAL effector nucleases (TALENs) Fusión de los TALE a dominio catalítico de FokI TD: translocation domain, AD: activation domain NLS: nuclear localization sequence RVD: “repeat variable di-residue” Los spacers son críticos en ambos casos, pero TALEN es más flexible Spacer 5-7 bp flexibilidad Spacer 10-30 bp Cada monómero reconoce cadenas opuestas Menos “constrains” para el diseño Usos de los TALENs Usos de las site specific nucleases (SIN) RVDs menos específicos para targetear homólogos Algunos ejemplos del uso de TALENs Sistema Golden Gate para armar TALENs a medida Diseño de TALENs por Golden http://boglabx.plp.iastate.edu/TALENT/) Testeo en levaduras CRISPR/Cas El sistema Cas9 Hwang-NatBiotech-2013 El crRNA y el tracrRNA se pueden fusionar en un solo gdRNA Hwang-NatBiotech-2013 CRISPR/Cas CRISPR/Cas CRISPR/Cas Coexpresion de Cas9 y el sgRNA en protoplastos produce mutaciones y HR Feng-CellRes-2013 Heredabilidad de las mutaciones inducidas por CRISPR-cas Jiang-PLoSone2014 Heredabilidad de las mutaciones inducidas por CRISPR-cas Jiang-PLoSone2014 Heredabilidad de las mutaciones inducidas por CRISPR-cas Feng et al-PNAS-2014 Off-targets? Feng et al-PNAS-2014 siRNAS Genes Blanco Systemic gene silencing. UV LB p 35S GFP GFP Agroinfiltration PTGS GFP GFP intron PFG GFP Sistemic PTGS RB A practical approach to the understanding and teaching of RNA silencing in plants. Bazzini et al. EJB 10 (2) 2007 Silenciamiento transcripcional por RNAi (RdDM) Metilación de ADN (silenciamiento transcripcional) dependiente de RNA interferente (RdDM: RNAdependent DNA methylation) • Reducción de los tiempos del ciclo de mejoramiento (por ej del tiempo de floración en frutales y forestales) • Por knock down de factores de juvenilidad/ de estado vegetativo como el TFL1 • Sobre-expresión del factor de inducción floral BpMADS4 Flachowsky H. et al., Acta Hort 763: 215-222 (2006) Flachowsky H. et al., Acta Hort 738: 307-312 (2007)
