2011_5 Transformacion vegetal.pdf
Anuncio
Agrobiotecnología Curso 2011 Sistemas de transformación vegetal Alejandro Mentaberry Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Universidad de Buenos Aires Sumario Sistemas de transferencia genética en plantas Biología de Agrobacterium tumefaciens Vectores basados en el plásmidos T Protocolos de transformación mediante A. tumefaciens y A. rhizogenes Genes reporteros Sistemas de transformación genética de plantas por transferencia directa de ADN Transformación por biobalística Transformación mediante electroporación y/o métodos químicos Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal Transformación con whiskers de carburo de silicio Transformación por microinyección Referencias Sistemas de transferencia genética en plantas Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal No satisfactorio No satisfactorio Cultivo de tejidos y transformación genética Adaptado de: Birch, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 1997. Tipos de explantos usados para la transformación de diferentes especies Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal Especie Tipo de explanto Tabaco Cotiledón, hoja, tallo Petunia Hoja Tomate Cotiledón, hoja Lechuga Cotiledón, hoja Arabidopsis Hoja, raíz Lino Hoja, hipocótilo, cotiledón Brassica napus Tallo, hipocótilo, cotiledón Girasol Hipocótilo Algodón Hipocótilo, cotiledón Papa Tallo, hoja Soja cotiledón Sistemas de transformación genética en plantas • Sistemas de transferencia de ADN basados en vectores biológicos - Sistemas basados en Agrobacterium tumefaciens y Agrobacterium rhizogenes - Sistemas basados en virus vegetales • Sistemas de transferencia directa de ADN - Transferencia por biobalística Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal - Transferencia mediada por cationes divalentes y/o electroporación - Transferencia con whiskers de carburo de silicio - Transferencia por microinyección Biología de Agrobacterium tumefaciens Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium tumefaciens Tumor de tallo provocado por Agrobacterium tumefaciens Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal Ciclo de la enfermedad de la agalla de corona causada por Agrobacterium tumefaciens Tomado de: Agrios, Plant Pathology, 1997. Procesos celulares involucrados en las etapas de interacción entre la bacteria y la planta Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal Procesos celulares Etapas de infección Agrobacterium se une a la célula húesped A: Reconocimiento célula-célula BI BD Formación del complejo T inmaduro, compuesto por VirD2 y la hebra T B: Procesamiento del ADN Hebra T C: Empaquetamiento del ADN Formación del complejo T maduro, compuesto por VirD2 y la hebra T cubierta por VirE2 D: Transporte intercelular Formación del pilus para el transporte del complejo T dentro de la célula húesped E: Importación al núcleo Importación de la hebra T al núcleo de la célula húesped F: Integración del ADN y expresión de los genes Integración de la hebra T y la formación del tumor Tomado de: Tzfira and Citovsky, Trends in Cell Biology, 2002. Mapa genético del plásmido Ti de octopina BI Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal BD Regiones homólogas en los plásmidos Ti de octopina (pTi Ach5) y de nopalina (pTi C58) La región T está definida por dos repeticiones directas de 25 pb altamente homólogas Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal Estructura de la región T de un plásmido Ti de octopina Mecanismos moleculares implicados en la transformación por Agrobacterium tumefaciens 2 Tomado de: Tzfira and Citovsky, Trends in Cell Biology, 2002. Agrobacterium tumefaciens posee un sistema regulatorio de dos componentes para reconocer las células vegetales susceptibles Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal Procesamiento de la hebra T y formación del complejo T maduro El complejo T esta compuesto de una cadena simple de ADN-T cubierta por proteína VirE2. Una única molécula de proteína VirD2 se halla unida covalentemente al extremo 5’ del DNA. Se estima que se requieren 600 moléculas de VirE2 para recubrir los 20 Kbp del ADN-T. Ensamblaje de las proteínas de Agrobacterium involucradas en el transporte del complejo T VirB2 Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal Tomado de: Zupan et al., Plant J., 2000. La integración del ADN-T al genoma de la célula vegetal involucra el apareamiento no homólogo entre éste y el ADN cromosómico Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal (1) y (3): digestión de las cadenas desplazadas de ADN de la planta por endonucleasas. (2): digestión del extremo no apareado del ADN-T por exo- o endonucleasas. (4) y (5): cortes en la cadena desapareada del ADN de la planta Vectores basados en plásmidos Ti Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal La capacidad de Agrobacterium tumefaciens de introducir ADN en el genoma de la planta permitió desarrollar vectores plasmídicos basados en el plásmido Ti Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal Ejemplo de vector cointegrado: pAP2034 Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal Ejemplos de vectores binarios Mapa de restricción de los plásmidos pBIN19; pPZP111; pMON10098; pGreen0029. Abreviaturas: BI: borde izquierdo; ori: origen de replicación; BD: borde derecho. Tomado de: Hellens and Mullineaux, Trends in Plant Science, 2000. Optimización del diseño de los vectores binarios Tamaño (kb) Sitios únicos de restricción en ADN-T Selección bacteriana Marcador de selección en: LacZ pBIN19 11777 9 Si Kanamicina pC22 17500 2 No pGA482 13200 7 pPCV001 9200 pCGN1547 Vector Origen de replicación Mobilización Movilización Agrobacterium E. coli BD pRK2 pRK2 Si Ampicilina , estreptomicina y espectinomicina BD pRi ColE1 Si No Tetraciclina BD pRK2 ColE1 Si 6 No Ampicilina BD pRK2 ColE1 Si 14440 5 Si Gentamicina BI pRi ColE1 Si pJJ1881 25700 4 No Tetraciclina BI pRK2 pRK2 Si pPZP111 8909 9 Si Cloranfenicol BI pVS1 ColE1 Si pGreen0029 4632 18 Si Kanamicina BI Tomado de: Hellens pSaand Mullineaux,pUC No Trends in Plant Science, 2000. Genes selectores para transformación de plantas Gen de selección Producto genético Fuente Selección nptII Neomicina fosfotransferasa Tn5 Kanamicina, G418, paromomicina, neomicina Ble Resistencia a bleomicina Tn5 y Streptoalloteichus hindustanus Bleomicina, fleomicina dhfr Dihidrofolato reductasa Plásmido R67 Metotrexato cat Cloranfenicol acetil transferasa Fago p1Cm Cloranfenicol Higromicina fosfotransferasa E. coli Higromicina B SPT Estreptomicina fosfotransferasa Tn5 Estreptomicina aacC3, aacC4 Gentamicin-3-Nacetiltransferasa Serratia marcescens; Klebsiella pneumoniae Gentamicina Fosfinotricin acetil transferasa Streptomices hygroscopicus Fosfinotricina, bialofos 5-enolpiruvilshikimato-3fosfato sintasa Petunia hybrida Glifosato aphIV bar EPSP Genes selectores para transformación de plantas Gen selector Producto genético Fuente Selección bxn Bromoxinil nitrilasa Klebsiella ozaenae Bromoxinil psbA Proteína Qn Amaranthus hybridus Atrazina tfdA 2,4-D monooxigenasa Alcaligenes eutrophus Acido 2,4 diclorofenoxiacético Dihidroxipicolinato sintasa E. coli S-aminoetil L-cisteína AK Aspartato kinasa E. coli Alta concentración de lisina y treonina sul Dihidropteroato sintasa Plásmido R46 Sulfonamida Acetolactato sintasa Arabidopsis thaliana Herbicida sulfonilurea Triptofano decarboxilasa Catharanthus roseus 4-metil triptofano Manosa 6P-isomerasa E. coli Manosa 6P DHPS Csrl-l tdc manA Ejemplo de selección positiva: manosa-6P isomerasa Comparación de frecuencias de transformación entre manosa isomerasa y gen de resistencia a kanamicina (remolacha) manosa-6P manosa–6P isomerasa fructosa-6P Comparación entre métodos de selección basados en manosa isomerasa y resistencia a kanamicina (remolacha) • Gen manA de Escherichia coli • Cultivos transformados: Arabidopsis, cebada, melón, tomate, calabaza, girasol, remolacha, nabo, cassava. Eliminación de los genes marcadores: vectores basados en elementos transponibles Tipo 1 BI Ds Gen de interés Ds Transposasa Marcador de selección BD Tipo 2 BI Ds Gen marcador Ds Gen de interés BD Vector de Tipo 1, contiene tanto el gen que codifica para la transposasa como el gen de selección en el mismo vector. En el vector de Tipo 2, la transposasa es aportada en trans por un vector helper. Ejemplo 1: Eliminación de los genes marcadores en plantas transgénicas por recombinación genética attP: secuencia del bacteriofago 1 TBS: Transformation booster sequence Efector: gen de interés Tms2: ácido indolacético hidrolasa (IAAH) Tomado de: Zubko et al., Nature Biotechnology, 2000. Este sistema permite la deleción de ADN por recombinación homóloga de regiones intracromosómicas (ICR) entre dos secuencias homólogas. El gen tms codifica la ácido indolácetico hidrolasa que permite convertir naftaleno acetamida (NAM) en ácido naftalen acético (ANA), una auxina que evita la formación de raíces y promueve la formación de callos. Selección de plantas de tabaco transgénicas libres de genes selectores A: selección en kanamicina; B: selección en NAM A Tomado de: Zubko et al., Nature Biotechnology, 2000. B + tms2 - tms2 Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal Después de 3 a 5 meses se observó que varios brotes que se habían desarrollado mostraban una coloración blanca debido a que habían perdido el gen de resistencia a NTPII. Debido a que también perdieron el gen tms2, este tejido pudo desarrollar raíces Ejemplo 2: Eliminación de genes selectores mediante el sistema Cre-lox loxP Pr Nos Pr G10-20 XVE XVE: activador transcripcional quimérico constituido por los dominios DUD LexA, DA VP16, y DUL RE. DUD LexA: dominio de unión al ADN de la proteína LexA DA VP16: dominio activador de la transcripción VP16 del Human Herpes Virus; DUL RE: dominio de unión al ligando del receptor de estrógenos. prOlexA-46: promotor constituido por 8 copias del operador LexA (LexARE) fusionadas al promotor mínimo de 35S [pr35S(-46)] Pr OlexA-46 Cre-int HYG DUD LexA loxP DA VP16 8 (LexA RE) DUL RE Gen de interés Tnos estradiol Pr 35S (-46) loxP Cre-int XVE loxP Pr G10-20 Gen de interés Tnos HYG Adaptado de: Zuo et al., Nature Biotechnology, 2001. Protocolos de transformación mediante Agrobacterium tumefaciens Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal Transformación mediante co-cultivo de Agrobacterium tumefaciens y discos de hojas de tabaco A B C D E F Disco foliar Explante inicial (hoja) Co-cultivo con una bacteria desarmada en medio líquido Co-cultivo en medio sólido sin antibióticos Planta transgénica aclimatada en invernadero Medio de enraizamiento con o sin agente de selección Medio de inducción de brotes con antibiótico y agente de selección Transformación de cotiledones de soja mediante co-cultivo con Agrobacterium tumefaciens A B D E G H C F I Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal Tomado de: Olhoft et al., Planta, 2003. A: explantos obtenidos a partir de plantas de soja de 5 d de edad. B: cotiledones incubados en un medio conteniendo Agrobacterium. C: explantos incubados en medio de inducción de tallos durante 28 d, los primeros 14 d en ausencia de higromicina, y los segundos 14 d en presencia de higromicina. E, F, G: evolución de los explantos en medio selectivo conteniendo higromicina durante 4 meses. H: plantas seleccionadas in vitro de una altura de 4 cm. I: plantas transferidas a tierra en condiciones de invernáculo. Transformación de Arabidopsis thaliana por infiltración floral con Agrobacterium tumefaciens A C B D Agrobiotecnología Tomado de: Bent, Plant physiology, 2001. Sistemas de transformación vegetal Las plantas florecidas se sumergen en un cultivo de Agrobacterium tumefaciens. Luego se recogen las semillas y se germinan en un medio con agente selector. Tiempos estimados para un protocolo de transformación estándar Co-cultivar discos de hojas con Agrobacterium 1-2 días Lavar los discos de hojas Tratar con antibiótico para eliminar al Agrobacterium y seleccionar las células vegetales transformadas 2-4 semanas Transpasar los discos de hojas sobrevivientes a medio fresco de selección / regeneración 6-10 semanas Enraizar las plántulas en selección Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal 4-6 semanas Rusticar las plantas transgénicas Tiempo total en cultivo: 12-20 semanas Evaluación de construcciones genéticas por agroinfiltración al vacío Hoja infiltrada Plantas tabaco salvajes Hoja no infiltrada E xtracción de proteínas Hojas y flores agroinfiltrados con construcciones del gen reportero uidA dirigidas por promotores tejido-específicos Agrobacterium recombinate E xtracto clarificado Purificación A groinfiltración en vacío Vaquero et al., FASEB J.16:408-410, 2002. La técnica es: Rápida: la proteína recombinante puede obtenerse en aproximadamente una semana. Eficiente: alta eficiencia de transformación; acumulación de proteína comparable con la de plantas transgénicas (hasta 40 mg/kg de hoja). Simple: sólo se requiere equipamiento básico. Flexible: puede utilizarse para producir proteínas de membrana, enzimas o virus quiméricos, o para ensayar promotores Protocolo de transformación mediante Agrobacterium rhizogenes Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal Agrobacterium rhizogenes Tumor de raíces producido por Agrobacterium rhizogenes en discos de remolacha Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal Gentileza del Dr. M. Tepfer Agrobacterium rhizogenes Cultivo de raíces de tabaco transformadas por Agrobacterium rhizogenes Fenotipo Ri en plantas de Brassica napus Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal Gentileza del Dr. M. Tepfer Transformación vía Agrobacterium rhizogenes Algunos desafíos de la transformación vía Agrobacterium • Uso de Agrobacterium para realizar recombinación homóloga . o sitio-específica: frecuencia de integración baja. • Expresión no predecible de los transgenes en la planta: efectos . de posición, cromatínicos y de integración del ADN-T sobre el . silenciamiento génico. • Modificación del genoma de Agrobacterium: alteración del perfil . de expresión de acuerdo con distintos hospedadores vegetales. • Transformación de hongos vegetales y animales mediante . Agrobacterium: transformación de más especies de hongos. Genes reporteros Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal Genes reporteros usados en transformación de plantas Genes reporteros Abreviatura Origen Detección β-glucuronidasa gus/uidA E. coli Fluorométrico (cuantitativo) o histoquímico (in situ), no radiactivo Proteína de fluorescencia verde GFP Aequorea victoria Fluorescencia, no destructiva Cloranfenicol acetiltransferasa Cat E. Coli Ensayo radiactivo sensitivo, semi cuantitativo Luciferasa Luc Photinus pyralis Luminiscencia Luciferasa luxA, luxB Vibrio harveyi Luminiscencia Expresión del gen uidA en Arabidopsis thaliana Tinción de óvulos, sacos embrionarios y lóculos enteros de Arabidopsis thaliana mediante la reacción histoquímica de la enzima β-glucuronidasa luego de la infiltración con Agrobacterium tumefaciens A B C D www.plantphysiol.org Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal A: fotografía de una flor completa donde se observan varios óvulos teñidos. B: Fotografía ampliada de un segmento floral donde se pueden ver óvulos completamente teñidos y óvulos no teñidos. C: Tinción del embrión o saco embrionario, en vez del óvulo entero. D: Cavidad del lóculo completamente teñido. Expresión del gen uidA en flores y frutos de Arabidopsis thaliana 2 1 Flores 3 Pecíolos 4 Cortes histológicos de fruto Expresión del gen uidA en raíces de Nicotiana tabacum 5 6 7 Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal Tomado de: Karthikeyan et al., Plant Physiology, 2002. Expresión tejidoespecífica del gen uidA en Arabidopsis thaliana y Nicotiana tabacum Cortes histológicos de raíz Panel Superior: 1) Expresión en flores, 2) Expresión confinada a la porción entre la silicua y el pecíolo. 3 y 4): Cortes histológicos del fruto. Panel inferior: (5) y (6): raíces completamente teñidas. (7): Corte transversal de raíz. Expresión del gen uidA en plantas de maíz Seguimiento de la transformación de embriones de maíz y regeneración de una planta transgénica mediante la reacción histoquímica de la enzima β-glucuronidasa. A B Tomado de: Frame et al., Plant physiology, 2002. C D Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal A: expresión transitoria en embriones cigóticos. B: expresión estable en callos obtenidos de un único embrión. C: hojas aisladas de plantas transgénicas y control. D: plantas transgénicas. Los puntos luminiscentes en la medusa Aequorea victoria se deben a la presencia de la proteína GFP que emite energía como luz verde Aequorina + Ca2+ Ca2+-apo-aequorin-coelenteramida + GFP Luz verde in vivo λmax = 509 nm Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal Luz azul in vitro λmax = 469 nm Expresión del gen GFP en tejidos vegetales Expresión del gen GFP en polen de Nicotiana tabacum cv. Xanthi A B Tomado de: Hudson et al., Molecular Ecology Note, 2001. Expresión del gen GFP en plantas transgénicas de Arabidopsis thaliana y células BY2 C D E Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal Tomado de: Prof Chris Hawes, Research School of Biological & Molecular Sciences,Oxford Brookes University, Oxford, OX3 0BP, UK La expresión del gen gfp permite identificar in vivo los patrones de crecimiento del floema en hojas de tabaco en diferentes estadios del desarrollo Desarrollo de la vena mayor en cotiledones A B C D E F Desarrollo de la vena central y venas secundarias en hojas inmaduras A B C D E F Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal Tomado de: Wright et al., Mechanisms and Processes, 1999. Expresión del gen GFP en plantas transgénicas de Nicotiana benthamiana A B C Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal La expresión del gen GFP produce color verde o amarillo bajo iluminación ultravioleta. En ausencia de GFP el tejido se observa de color rojo debido a la fluorescencia de la clorofila. Expresión del gen Luc en plantas transgénicas de Nicotiana tabacum Gen de luciferasa expresado en plantas transgénicas de tabaco Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal Tomado de: Ow et al., Science, 1986. Sistemas de transferencia directa de ADN Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal Sistemas de transferencia directa de ADN • Ventajas - Son considerados sistemas universales porque, al no depender de organismos vectores, pueden aplicarse a cualquier especie vegetal - No requieren eliminar las células del organismo vector de los tejidos o plantas transgénicas - Requieren construcciones más simples y pequeñas - Son apropiados para estudios de expresión transitoria • Desventajas Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal - Pueden resultar en un alto número de copias y/o copias truncas del transgén y del vector en varios sitios del genoma de las células transformadas - Se caracterizan por la alta frecuencia de aparición de re-arreglos en los transgenes Transformación por biobalística o bombardeo de micropartículas Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal Las técnicas de biobalística fueron desarrolladas en los años 80 Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal Bombardeo de micropartículas 1984. Sandford et al., describen la técnica de bombardeo de micropartículas para la transferencia directa de ADN (Universidad de Cornell, EEUU). Adaptado de: Morrish et al.,Transgenic Plants. Fundamentals and Applications, 1993. Diseño del primer acelerador de micropartículas impulsadas por explosión de pólvora La biobalística es aplicada con éxito en diferentes tipos de organismos Bombardeo de micropartículas 1987. Klein et al. demuestran la utilidad del método al observar expresión transitoria en células epidérmicas de Allium cepa usando un dispositivo de impulsión a pólvora y micropartículas de tungsteno recubiertas de ADN. Microscopía de Normansky de células epidérmicas de Allium cepa luego de un bombardeo. Se observan 8 proyectiles (flecha) en el interior de una célula viva. Barra: 20 µm 1988. Christou et al. demuestran la utilidad del método para transferir ADN biológicamente activo en células vivas y obtener transformantes estables. 1988. Johnston et al. logran transformar por primera vez microorganismos y organelas. Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal 1988. Wang et al., Mc Cabe et al., Christou et al. obtienen plantas superiores transgénicas. 1991. Williams et al. demuestran la transformación de animales in vitro e in vivo. La transformación por biobalística depende de factores físicos, químicos y biológicos • Parámetros físicos y químicos que influyen en la transferencia del ADN - Método de aceleración de las micropartículas - Naturaleza química y física, densidad y volumen de las micropartículas - Naturaleza, preparación, adherencia y concentración del ADN - Vacío y distancias de bombardeo - Diámetro de apertura de la placa de retención - Número de bombardeos Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal • Parámetros relacionados con la construcción genética utilizada - Vector, promotores, intrones, genes reporteros y genes marcadores de selección La transformación por biobalística depende de factores físicos, químicos y biológicos • Parámetros relacionados con el tejido o células blanco - Tipo y capacidad de regeneración in vitro de los explantos - Preparación y condiciones de cultivo de los explantos pre- y post-bombardeo - Requerimientos de temperatura, fotoperíodo y humedad de la planta donante de explantos y del tejido bombardeado Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal Existen diferentes sistemas de impulsión de micropartículas • La aceleración de las micropartículas puede generarse por: - Explosión química de pólvora seca - Descarga de helio a alta presión - Descarga de aire, CO2 o N2 comprimido - Descarga eléctrica de alto voltaje y baja capacitancia o bajo voltaje y alta capacitancia - Flujo de partículas o flujo de helio a baja presión por aspersión - Flujo de helio con cañón de precisión Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal Acelerador de micropartículas ideado por Sandford et al. (New York University, 1984) Tomado de: http://www.smithsonianlegacies.si.edu/ objectdescription.cfm?ID=132 Sistemas alternativos de aceleración de micropartículas Diagrama esquemático del cañón a explosión de pólvora PDS 1000 A: Antes de disparar B: Después de disparar 1: Ensamblaje del iniciador con un percutor activado por solenoide. 2: Iniciador (carga de pólvora). 3: Macroproyectil (bala de Nylon) portando microproyectiles. 4: Tubo de aceleración (cañón). 5: Retén con placa de retención. 6: Placa de retención con el macroproyectil deformado. 7: Microproyectiles acelerados. Adaptado de: Klein et al., Bio/technology, 1992. Sistemas alternativos de aceleración de micropartículas Acelerador de micropartículas PDS 1000/He por descarga de helio a alta presión Modelo comercial actual Medidor de presión de helio Tubo de aceleración de gas Interruptores de control Medidor de vacío Portador del disco de ruptura Portador del macroproyectil Ensamblaje del propulsor de microproyectiles Cámara de bombardeo Células blanco Soportedel del tejido blancoblanco Soporte Válvula de medición de helio Controles del flujo de aire y de vacío Acelerador de partículas por descarga de helio a alta presión PDS 1000/He Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal Preparación de las muestras 1. Remoción del soporte e inserción del disco de ruptura Acelerador de partículas por descarga de helio a alta presión PDS 1000/He Preparación de las muestras 2. Cargado de la muestra de micropartículas recubiertas de ADN Micropartículas de oro Micropartículas de tungsteno 0,6-3 µm 0,2-3 µm 3. Ensamblaje del lanzador de microproyectiles Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal Mecanismo de disparo de un cañón impulsado por He a alta presión (PDS 1000/He) Estado del disco de ruptura, macroproyectil y malla de retención luego del bombardeo Distancias de bombardeo críticas en un cañón de He a alta presión PDS 1000/He Adaptado de: Hagio, JARQ,1994. A: Distancia entre la membrana de ruptura y la membrana transportadora (macroproyectil) B: Distancia entre la membrana transportadora (macroproyectil) y la malla de retención C: Distancia entre la malla de retención y el tejido blanco Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal Control Efecto Presión de ruptura Distancia A Distancia B Distancia C A > presión > velocidad A < distancia > velocidad A > distancia > velocidad A > distancia < velocidad Sistemas alternativos de aceleración de micropartículas Acelerador de micropartículas que utiliza helio a alta presión (EMBRAPA, 1998) Adaptado de: Rech y Aragao. Manual de Transformación Genética de Plantas, Embrapa-SPI-Cenargen, 1998. Sistemas alternativos de aceleración de micropartículas Acelerador de partículas Genebooster impulsado por alta presión de N2 comprimido Sistemas alternativos de aceleración de micropartículas Pistola Génica Helios B A Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal C La pistola génica Helios permite la transformación de tejidos in vivo Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal Transformación genética de plantas in vivo usando una pistola génica Helios Expresión transitoria del gen reportero uidA en explantos bombardeados con micropartículas A B C Tomado de: http://webdoc.sub.gwdg.de/ebook/y/2002/pub/agrar/02H059/prom.pdf Expresión transitoria en embriones inmaduros de centeno bombardeados con un cañón PDS 1000 He usando diferentes concentraciones de micropartículas. A: 200 µg, B: 100 µg y C: 30 µg A B Tomado de: Helenius et al., Plant Molecular Biology Reporter, 2000.. Expresión transitoria en hojas de Arabidopsis bombardeadas con una pistola Helios con y sin malla de difusión de micropartículas Sistemas alternativos de aceleración de las partículas Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal Acelerador de partículas impulsado por un arco voltaico (cañón eléctrico Accell®) Tejidos blanco, genes reporteros y marcadores usados en transformación de monocotiledóneas por biobalística Especie Tejido blanco Gen reportero Hordeum vulgare L. Suspensión celular Embriones/Callo Embriogénico Callos de microsporas uidA Zea mays Suspensión celular Suspensión celular Callo Embriones uidA/cat cat/luc/uidA uidA uidA nptII/bar als/bar bar nptII/bar Oryza sativa Suspensión celular Callo Embriones cat/uidA uidA nptII/csr-1 nptII nptII /hpt Triticum aestivum Suspensión celular Base de hoja Hoja Callo Embriones/callo embriogénico cat/uidA uidA uidA uidA uidA nptII /bar nptII nptII nptII nptII /bar Saccharum officinarum Suspensión celular Callo embriogénico uidA uidA hpt/bar nptII uidA/cat uidA/cat Gen marcador nptII nptII/bar uid A: gen de β-glucuronidasa de E. coli. cat: gen de cloranfenicol acetiltransferasa de E. coli. luc: gen de luciferasa de Photinus pyralis. bar: gen de fosfinotricina acetiltransferasa de S. hygroscopicus csr-1/als: gen mutante de acetolactasa sintasa de Arabidopsis thaliana. hpt: gen de higromicina fosfotransferasa de E. coli. npt II: gen de neomicina fosfotransferasa II de E. coli. Promotores constitutivos usados en transformación de interés agronómico por biobalística Promotor Actividad relativa en células de cereales Uso en cereales transgénicos 35S Baja Arroz Maíz Pasturas 35S-Adh1 intrón 1 Baja Maíz Avena Trigo Emu Moderada Caña de azúcar Arroz Act1-Act1 intrón 1 Moderada Arroz Ubi1-Ubi1 intrón 1 Alta Trigo Cebada Arroz 35S: Promotor de 35S de CaMV 35S-Adh1 intron 1: Promotor de 35S de CaMV e intrón de alcohol deshidrogenasa de maíz Emu: Promotor modificado de alcohol deshidrogenasa de maíz Act1-Act1 intrón1: Promotor e intron de actina de arroz Ubi1-Ubi1 intrón: Promotor e intrón de ubiquitina de maíz Tejidos blanco, genes reporteros y marcadores usados en transformación de dicotiledóneas por biobalística Especie Tejido blanco Gen reportero Gen marcador Carica papaya Suspensión celular uidA nptII Glycine max Meristemas Callos embriogénicos uidA uidA / gfp Nicotiana tabacum Polen Suspensiones Hoja / cloroplasto Hoja uidA uidA uidA/gfp uidA/gfp nptII hpt / nptII bar bar csr-1 nptII bar nptII nptII Helianthus annuus Meristemas uidA nptII Liriodendron tulipifera Suspensión celular uidA nptII Gosypium hirsutum Suspensión celular uidA nptII/bar uid A: gen de la enzima β-glucuronidasa de Escherichia coli; gfp: gen de la proteína de fluorescencia verde de Aequorea victoria; bar: gen de la enzima fosfinotricina acetiltransferasa de Streptomyces hygroscopicus; hpt: gen de la enzima higromicina fosfotransferasa de Escherichia coli; npt II: gen de la enzima neomicina fosfotransferasa II de Escherichia coli; csr-1: gen de una forma alterada de la enzima sintasa del ácido acetohidroxil, también conocida como acetolactasa sintasa, de mutantes de Arabidopsis thaliana. Parámetros relacionados con el tejido o células blanco Tipos de explantos utilizados para experimentos de transformación A B C D E F M P Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal Adaptado de: Hansen and Wright, Trends in Plant Science, 1999. A y B: callos de maíz. C: brotes primordiales de maíz. D y E: callos y brotes de soja. F: ápice de una plántula de algodón de 4 días (M: meristema apical y P: primordio foliar). Plantas transgénicas obtenidas por bombardeo de micropartículas Transformación de Oryza sativa a partir de embriones inmaduros A B C D E F Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal Tomado de: Christou, Trends in Plant Science, 1996. A, B, C: expresión transitoria del gen uidA en embriones inmaduros 24 h post-bombardeo. D y E: embriones inmaduros bajo selección en higromicina. F: regeneración de los callos transgénicos bajo selección. Plantas transgénicas obtenidas por bombardeo de micropartículas Transformación de Festuca arundinacea a partir de suspensiones celulares A B C D Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal Tomado de: http://www.noble.org/ForgBiot/GeneticTransformation/ A: suspensión de células de Festuca arundinacea sobre papel de filtro antes del bombardeo. B: selección de células transformadas en medio de selección conteniendo higromicina. C y D: plántulas transgénicas de Festuca arundinacea regeneradas a partir de callos resistentes. Plantas transgénicas obtenidas por bombardeo de micropartículas Transformación de Glycine max a partir de tejido embriogénico A B C D E E F Adaptado de: http://www.cropsoil.uga.edu/homesoybean/somprot.htm A: tejido embriogénico. B: expresión transitoria del gen uidA en tejido embriogénico bombardeado. C y D: tejido embriogénico en selección post-bombardeo. E: germinación de embriones somáticos. F: plantas transgénicas completas. Plantas transgénicas obtenidas por bombardeo de micropartículas Transformación de Cassava spp. a partir de cotiledones A B D E C F Tomado de: Zhang et al., Plant Cell Reports, 2000. A: Ensayo histoquímico de gus de cotiledones bombardeados. B y C: Formación de yemas a partir de cotiledones en medio de selección. D y E: Enraizamiento de yemas transgénicas en selección con higromicina. F: Ensayo histoquímico de gus en hojas de Cassava spp. no transgénicas y transgénicas. Expresión transitoria en explantos bombardeados con micropartículas Expresión de GFP en hojas de petunia y embriones de trigo y soja bombardeados con acelerador de flujo de micropartículas D A B E Agrobiotecnología C Sistemas de transformación vegetal F Adaptado de: http:/ /www.oardc.ohio-state.edu/plantranslab/gfp.htm A y B: Embriones de soja. C,D y E: Embriones de trigo. F: Hoja de petunia. La biobalística puede utilizarse con diversos fines experimentales - Transferencia de genes a células, tejidos . y órganos vegetales - Transferencia de genes a microorganismos y organelas (cloroplastos) - Estudio de expresión transitoria - Análisis de promotores y de delección de genes - Estudio de mecanismos de expresión . y regulación de genes Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal - Transferencia de ARN viral Transferencia de ADN mediada por electroporación y/o métodos químicos Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal Aislamiento y purificación de protoplastos de Nicotiana tabacum Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal Adaptado de: Gomes Barros y Campos Carneiro. Manual de Transformación Genética de Plantas, 1998. Electroporación de protoplastos Adaptado de Gomes Barros y Campos Carneiro. Manual de Transformación Genética de Plantas, 1998. Pulsador de electroporación Cubetas de electroporación Electroporación y regeneración de plantas a partir de protoplastos Cultivo y regeneración de protoplastos de tabaco A B C D E F Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal Tomado de: Gomes Barros y Campos Carneiro. Manual de Transformación Genética de Plantas, 1998. Protocolo de transformación de protoplastos de Oryza sativa por electroporación Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal Protocolo de co-transformación de protoplastos de Oryza sativa con dos plásmidos distintos mediante electroporación Aislamiento y electroporación de protoplastos de Citrus sinensis (naranjo dulce) con el gen gfp Línea celular embriogénica usada como fuente de protoplastos Protoplasto fluorescente a las 24 h de la electroporación Protoplastos luego de la electroporación Callos embriogénicos de 4 semanas derivados de protoplastos Callos embriogénicos GFP positivos a los 6 meses de la transformación Planta regenerada a partir de callos en selección positiva Adaptado de: www.ushrl.saa.ars.usda.gov/hb/niedz/gfp/ Expresión estable de genes transferidos a protoplastos de plantas por métodos químicos y/o electroporación Gen marcador de selección / agente de selección Técnica de transformación Tipo de transgénico Nicotiana tabacum Métodos químicos Plantas fértiles npt II / kanamicina Lolium multiflorum Métodos químicos Callos npt II / kanamicina Triticum monococcum Métodos químicos Callos npt II / kanamicina Brassica campestris Métodos químicos Callos npt II / kanamicina Petunia hybrida Métodos químicos Plantas npt II / kanamicina Brassica napus Electroporación Callos npt II / kanamicina Panicum maximum Electroporación Callos dhfr / metotrexato Oryza sativa (Japonica) Electroporación Plantas fértiles hpt / higromicina Dactylis glomerata Métodos químicos / Electroporación Plantas hpt / higromicina Solanum tuberosum Electroporación Plantas fértiles npt II / kanamicina hpt / higromicina als / clorosulfuron Arabidopsis thaliana Métodos químicos Plantas fértiles hpt / higromicina Oryza sativa (Indica) Métodos químicos Plantas fértiles hpt / higromicina Festuca arundinacea Métodos químicos Plantas fértiles hpt / higromicina pat / fosfinotricina Zea mays Métodos químicos Plantas fértiles npt II / kanamicina pat / fosfinotricina Especie Adaptado de: Bilang et al. Plant Molecular Biology Manual, 1994. Electroporación de tejidos organizados Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal Adaptado de: Bilang et al. Plant Molecular Biology Manual, 1994. A: diseño de la cámara de electroporación B y C: preparación de las muestras para la electroporación D: cámara dispuesta para la electroporación Electroporación de tejidos intactos de café A B C D E F Adaptado de: Fernandez-Da Silva, Plant Biotechnology, 2003. Expresión del gen uidA en tejidos de café electroporados sin (A-B) y con (C-F) tratamiento enzimático A-B: células de callo embriogénico C: callo embriogénico. D: embrión en estado globular E: embrión en estado de torpedo F: sección de hoja de una planta in vitro Producción de plantas transgénicas por electroporación de pro-embriones intactos de Nicotiana tabacum A B C D E F A-E: expresión del gen uidA en células de pro-embriones de Nicotiana tabacum electroporados F: expresión del gen gfp en pro-embrión electroporado Tomado de: Shitao et al., Chinese Science Bulletin , 2000. Transformación con whiskers de carburo de silicio Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal Transformación de maíz mediante whiskers de carburo de silicio A B C A: suspensiones celulares de maíz penetradas por fibras de carburo de silicio (0,30,6 µm por 10-100 µm) recubiertas de ADN (transformación) B: expresión transitoria del gen uidA luego de la transformación D E F C: callos resistentes a fosfinotricina D y E: inflorescencia y fruto de una planta transgénica R0 F: ensayos de resistencia a fosfinotricina con plantas R1 dos semanas después del tratamiento Adaptado de: Frame et al. The Plant Journal, 1994 y de Petolino et al. Plant Cell Reports, 2000. Transferencia de ADN por microinyección Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal Transformación de células vegetales por microinyección Se transformaron plantas de Nicotiana tabacum, Petunia sp., Brassica napus y Hordeum vulgare Célula vegetal microinyectada Micromanipulador Microinyección de ADN con microjeringa GEF A: Punta de un microelectrodo convencional (0.7 µm). C A C A B: Punta de un microinyector GEF (0.1 µm). C: Diagrama de la fentojeringa de expansión por galistan (GEF). 1: DNA o fluoróforo; 2: galistan (galio, indio y estaño); 3: aceite de silicona; 4: Tapa de vidrio rellena con epoxi. D B B E G F H Adaptado de Knoblauch et al., Biotechnology, 1999. D: Diagrama del sosten/calentador de la fentojeringa (GEF). 1: Aire impulsado por una bomba; 2: microjeringa GEF; 3: tubo de plástico; 4: capilar; 5: resistencia de alambre; 6: fuente de poder E: Inyección de Lucifer Yellow en una cianobacteria, F: en un cloroplasto simple de célula de parénquima de Vicia fava. G y H: en núcleo de células de Xenopus distal. Microinyección de ADN con microjeringa GEF A B C A-C: Fluorescencia de GFP en un cloroplasto a las 24 h de la inyección del ADN plasmídico. D E F Expresión de GFP en cloroplastos luego de la inyección de ADN A, D y G: Imagen de cloroplastos por microscopia confocal. B, E y H: Fluorescencia de GFP. C, F e I: Fluorescencia combinada de GFP y clorofila. D-F: Fluorescencia de GFP en tres cloroplastos a las 30 h de inyectar uno de ellos con ADN G H I G-I: Fluorescencia de GFP en varios cloroplastos de la misma célula a los 3 d de inyectar uno de ellos con ADN Adaptado de Knoblauch et al., Biotechnology, 1999 ¿Transferencia directa de ADN versus Agrobacterium tumefaciens? vs. A Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal Referencias 1. Tzfira, T. and Citovsky, V. Agrobacterium-mediated transformation of plants: biology and biotechnology.Current Opinion in Biotechnology, 17:147-154, 2006. 2. Gelvin, S.B. Improving plant genetic engineering by manipulating the host. Trends in Biotechnology, 21:95-98, 2003. 2. Gelvin, S.B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the “Gene-Jockeying” tool. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 67:16-37, 2003. 3. Tzfira, T. and Citovsky, V. Partners-in-infection: host proteins involved in the transformation of plant cells by Agrobacterium. Trends in Cell Biology, 12: 121-129, 2002. 4. Bent, A.F. Arabidopsis in planta transformation. Uses, mechanisms, and prospects for transformation of other species. Plant Physiology, 124:1540-1547, 2000. 5. Gelvin, S.B. Agrobacterium and plant genes involved in T-DNA transfer and integration. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, 51:223-256, 2000. 6. Tzfira, T. and Citovsky, V. From host recognition to T-DNA integration: the funtion of bacterial and plant genes in the Agrobacterium-plant cell interaction. Molecular Plant Pathology, 1:201-212, 2000. 7. Zupan, J., Muth, T.R., Draper, O. and Zambryski, P. The transfer of DNA from Agrobacterium tumefaciens into plants: a feast of fundamental insights. The Plant Journal, 23: 11-28. 2000. Agrobacterium Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal Referencias Biobalística 1. Christou, P. Genetic transformation of crop plants using microprojectile development. The Plant Journal, 2:275-281, 1992. 2. Christou, P. Transformation technology. Trends in Plant Science, 1:423-431, 1996. 3. Hunold, R., Bronner, R. and Hahne, G. Early events in microprojectile development: cell viability and particle location. The Plant Journal, 5:593-604, 1994. 4. Klein, T.M, Wolf, E.D,, Wu, R, and Sandford J.C, High velocity microprojectiles for delivering nucleic acid into living cells. Nature, 327:70-73, 1987. 5. McElroy, D. and Brettell, R.I.S. Foreign gene expression in transgenic cereals. Trends in Biotechnology, 12:62-68, 1994. 6. Potrykus, I., Bilang, R., Futterer, J., Sautter, C. and Schrott, M. Genetic engineering of crop plants. In: Agricultural Biotechnology. Altman, A. (ed.) pp. 119-159. Marcel Dekker, 1998. Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal 7. Potrikus, I. Gene transfer methods. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, 42:205-225, 1991. 8. Taylor, N.J. and Fauquet, C.M. Microprojectile bombardment as tool in plant science and agricultural biotechnology. DNA and Cell Biology, 21:963-977, 2002. Anexo. Biología molecular de Agrobacterium Agrobiotecnología Sistemas de transformación vegetal Los eventos moleculares mediados por Agrobacterium tumefaciens pueden agruparse según el espacio en donde ocurren Eventos que ocurren en el espacio extracelular 1) Agrobacterium reconoce y se une a la célula huésped. 2) El sistema de traducción de señales de Agrobacterium reconoce señales específicas de la planta. 3) La proteína virG media la traducción de señales y la activación de los genes vir. Sensores de Agrobacterium CHvE Densidad óptica (650 nm) Receptores de la superficie celular de la planta Densidad óptica (650 nm) Proteínas tipo vitronectina Unión a la célula húesped Receptores de Agrobacterium CHvA, CHvB, PscA, Att P10 P21 VirA Autofosforilación de Vir A Señales de la planta azúcares Vector Control Control CAX2 fenolesVector cnb CAX2 cnb Fosforilación de VirG Vector Control Vector CAX2 cnb VirG CAX2 Concentración de Mn2+ (mM) cnb Genes de virulencia (vir) de Agrobacterium Eventos que ocurren dentro de Agrobacterium tumefaciens 4) Formación de la cadena de ADN-T, complejo T inmaduro. 5) Formación del complejo T maduro. 6) Formación del complejo de transporte compuesto las proteínas virB y la proteína virD4. Inducción de la expresión de los genes vir Fosforilación de VirG Genes de virulencia (vir) de Agrobacterium VirB1, VirB3 VirB4, VirB6 VirB7, VirB8 VirB9, VirB10 VirB11, VirD4 Inducción de la expresión de los genes vir VirD1 Complejo endonucleasas VirD1/D2 Bordes del ADN-T VirE2 VirD2 VirC1 VirB2, VirB5 VirE1 Formación del complejo T maduro Hebra T/VirD2/VirE2 Transporte del complejo T maduro dentro del citoplásma de la planta Ensamblaje del pilus Complejo VirE1/VirE2 Generación del complejo T inmaduro Hebra T/ VirD2 “Nicks” en los bordes del ADN-T Ensamblaje del complejo de trasporte Canal entre célula vegetal y Agrobacterium Disociación del complejo VirE1/VirE2 Eventos que ocurren dentro de la célula vegetal 7) El complejo T maduro es importado al núcleo. 8) Integración de la hebra de ADN-T al genoma de la planta. Transporte del complejo T maduro dentro del citoplásma de la planta VirD2/Hebra T/ VirE2 NÚCLEO RocA, Roc4, CypA AtKAPa PP2C Integración y transformación genética CITOPLASMA Factores nucleares Agrobiotecnología y ADN cromosómico Sistemas de transformación VirD2 Complejo T vegetal: Agrobacterium Hebra T = Transporte dentro del tumefaciens VirE2 núcleo Estabilización del complejo T e importación al núcleo VirD2/Hebra T/VirE2 AtKAPa PP2C RocA, Roc4, CypA VIP1 VIP2 VIP1, VIP2 VIP1, VIP2 Estabilización del complejo T e importación al núcleo VirD2/Hebra T/VirE2
