Clase 2 y 3 AGBT 2015 CULTIVO DE TEJIDOS.pdf
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AGROBIOTECNOLOGIA CURSO 2015 Cultivo de tejidos vegetales María Mercedes Rivero Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Universidad de Buenos Aires - Sumario Técnicas del cultivo de células y tejidos vegetales Micropropagación vegetal Consideraciones técnicas de la propagación clonal masiva de plantas Etapas del cultivo in vitro de plantas superiores Vías morfogenéticas: organogénesis y embriogénesis Sistemas de micropropagación vegetal Aplicaciones biotecnológicas del cultivo de tejidos Referencias Cultivo de tejidos vegetales Técnicas del cultivo de células y tejidos vegetales Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales Principales conceptos fisiológicos aplicables a los cultivos in vitro • Existen tres conceptos básicos que fundamentan el cultivo in vitro de células y tejidos vegetales: - Totipotencialidad celular - Desdiferenciación / Rediferenciación Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales - Balance de reguladores del crecimiento vegetal Técnicas del cultivo de células y tejidos vegetales • Micropropagación vegetal • Regeneración de plantas (embriogénesis y organogénesis) • Cultivo de meristemas • Cultivo de suspensiones de células vegetales • Cultivo de protoplastos • Cultivo de anteras • Cultivo de óvulos y embriones Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales Micropropagación vegetal Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales La micropropagación constituye la principal aplicación comercial del cultivo de tejidos vegetales Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales • La micropropagación vegetal, o propagación clonal masiva de plantas superiores, posibilita la obtención y cultivo de plantas a gran escala. • Se realiza bajo estrictas condiciones de esterilidad en un medio sintético nutritivo y con control de temperatura, luz y fotoperíodo. Alcances de la micropropagación vegetal • Propagación vegetativa rápida y a gran escala • Uniformidad seleccionada del material clonado • Multiplicación de plantas recalcitrantes a las técnicas convencionales • Reducción en el tiempo de multiplicación y en el espacio requerido para tal fin • Mayor control sobre la sanidad del material propagado • Introducción rápida de nuevos cultivares Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales • Conservación de germoplasma • Facilidades para el intercambio internacional de material vegetal Consideraciones técnicas de la propagación clonal masiva de plantas Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales La micropropagación requiere una infraestructura mínima especializada y condiciones controladas de cultivo • Laboratorio - Area de preparación de medios - Area de lavado y esterilización - Cuarto estéril - Cámara de cultivo - Area de rusticación • Material vegetal - Plantas madres seleccionadas (preacondicionamiento) - Explantos (elección, disección, esterilización, etc.) • Condiciones de cultivo Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales - Asepsia - Recipientes - Temperatura - Luz y fotoperíodo Laboratorio de preparación de medios y área estéril Gentileza Indear S.A. Cuartos de crecimiento de plantas in vitro y cámaras de cría Gentileza Indear S.A. Area de rusticación e invernáculo Gentileza Indear S.A. La infraestructura productiva debe ser pensada para procesar anualmente una cantidad rentable de plantines • Laboratorio de producción - Estructura para producir cantidades de 3.000 a 10.000 plantines diarios - Cámaras de crecimiento con capacidad para 300.000 a 1.000.000 de plantines Agrobiotecnología Micropropagación masiva Gentileza de Indear S.A. La mano de obra intensiva es el mayor costo involucrado. Esta debe ser respaldada por buen equipamiento Agrobiotecnología Micropropagación masiva El entrenamiento del personal es clave para lograr una producción eficiente El tipo de equipamiento debe acompañar el escalado de producción Los esterilizadores eléctricos de instrumental resultan menos riesgosos y más productivos Área de trabajo aséptica mostrando un esterilizador eléctrico, instrumental de trabajo y recipientes de cultivo. Agrobiotecnología Micropropagación masiva Autoclave Formulación básica de un medio de cultivo para tejidos vegetales • Soluciones concentradas de macroelementos (100x) • Soluciones concentradas de microelementos (100x) • Vitaminas grupo B (500 ó 1000x) • Mio-inositol (100 mg/L) • Azúcares: sacarosa o glucosa en concentraciones de aproximadamente 30 g/L Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales • Agar-agar: hidrato de carbono de alto peso molecular extraído a partir de algas. Se usa entre 5 y 10 g/L Medios de cultivo: composición general Compuestos inorgánicos Macronutrientes: NO4- , PO43- , K+, Ca2+, Mg2+, SO42Micronutrientes: Fe2+, Cu2+, Zn2+, Mn2+, Mo2+, Co2+, ICarbohidratos Sacarosa, glucosa, mio-inositol Vitaminas Tiamina (B1) Piridoxina Acido nicotínico (C) Biotina Aminoácidos Glicina Reguladores del crecimiento Auxinas Citocininas Giberelinas Soporte inerte (medios semisólidos) Agar (0,7 a 1%) Gelrite® pH 5,6 – 5,8 Esterilización 1 atmósfera, 15 a 20 min en autoclave Propiedades físicas de los medios de cultivo Semisólido Consistencia del medio Líquido • El metabolismo de los tejidos puede modificarse dependiendo de las características del medio de cultivo (líquido o semi-sólido). • En el caso de un medio sólido, la concentración y calidad del ágar pueden tener importantes efectos en el desarrollo del cultivo (hiperhidricidad, crecimiento lento, etc.) Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales • El cultivo en medio líquido resulta imprescindible cuando la propagación in vitro es desarrollada a través de las siguientes vías: - Inducción de embriogénesis - Cultivo de protoplastos - Cultivo de suspensiones celulares Propiedades físicas de los medios de cultivo • Intercambio gaseoso: Los recipientes de cultivo se tapan con un film de polietieleno (Resinite ) para posibilitar el intercambio de gases. La organogénesis puede verse modificada si el intercambio de gases se ve dificultado. - La inducción de yemas a partir de callos de tabaco se reduce si no hay suficiente oxígeno - La acumulación de etileno puede inhibir la regeneración de brotes • pH: - Constituye un factor crítico - Se ajusta en el rango 5,5-5,8 - Se modifica durante el crecimiento de los cultivos Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales Existen varias modalidades y alternativas de recipientes para el cultivo in vitro de plantas Diferentes modalidades de cultivo in vitro de plantas Plántulas de arroz regeneradas in vitro Rescate de embriones inmaduros de maíz Agrobiotecnología Micropropagación masiva Embriones somáticos de alfalfa en germinación Plántulas doble haploides de maíz Composición de medios de cultivo comúnmente usados Concentración en el medio de cultivo (mg/L) Compuesto White Schenk y Hildebrandt (SH) Gamborg (B5 Heller Murashige y Skoog Ca(NO3)2 142 - - - - KNO3 81 2.500 300 - 1.900 NaNO3 - - - 600 - NH4NO3 - - - - 1.650 NH4H2PO4 - 300 - - - (NH4)2SO4 - - 134 - - 74 400 500 250 370 - 200 150 75 440 KCl 65 - - 750 - KH2PO4 12 - - - 170 NaH2PO4.H2O - - 150 125 - MnSO4.H2O - 10 10 - - MnSO4.4H2O - - - 0,1 22,3 KI - 1 0,75 0,01 0,83 H3BO3 - 5 3 1 6,2 ZnSO4.7H20 - 1 2 1 8,6 CuSO4 - 0,2 0,025 - - CuSO4.5H2O - - - 0,03 0,025 NaMoO4.2H2O - 0,1 0,25 - 0,25 MgSO4.7H2O CaCl2.2H2O Composición de medios de cultivo comúnmente usados Concentración en el medio de cultivo (mg/L) Compuesto White Schenk y Hildebrandt (SH) Gamborg B5 Heller Murashige y Skoog (MS) CoCl2.6H2O - 0,1 0,025 - 0,025 AlCl3 - - - 0,03 - NiCl2.6H2O - - - 0,03 - FeCl3.6H2O - - - 1 - FeSO4.7H2O - 15 - - 27,86 2,46 - - - - Sequestrene 330 Fe - - 28 - - Na2EDTA - 20 - - 37,26 Mio-inositol - 1.000 100 - 100 Tiamina-HCl - 5 10 - 0,4 Acido nicotínico - 5 1 - - Piridoxina-HCl - 0,5 1 - - 100 - - - - 20.000 30.000 20.000 - 30.000 5,9 5,5 Fe(SO4)3 Extracto de Levadura Sacarosa pH 5,8 Reguladores del crecimiento comúnmente usados en medios de cultivos vegetales Clase Nombre Abreviatura Peso Molecular Rango de concentración (M) Auxina Acido clorofenoxiacético pCPA 186,6 10-7-10-5 Acido 2,4diclorofenoxiacético 2,4-D 221,0 10-7-10-5 Acido indol 3-acético AIA 175,2 10-7-10-5 IBA 203,2 10-7-10-5 NAA 186,2 10-7-10-5 Acido -naftoxiacético NOA 202,2 10-7-10-5 6-bencilaminopurina BAP 225,2 10-7-10-5 N-isopentenilaminopurina 2iP 203,3 10-7-10-5 6-furfurilaminopurina (kinetina) K 215,2 10-7-10-5 Zeatina Zea 219,2 10-7-10-5 Acido 3-indolbutírico Acido 1-naftalenoacético Citoquininas Giberelina Acido giberelico GA3 364,4 10-7-5x10-6 Preparación de solución stock Comentarios Las auxinas son usualmente tituladas en solución con NaOH El AIA puede ser oxidado por células vegetales. Es frecuentemente usado como única fuente de auxinas en el medio de cultivo Las citoquininas son normalmente disueltas en NaOH diluídas o en etanol acuoso La zeatina es termolábil y no debería ser autoclavada Soluble en agua Es termolábil, no debe ser autoclavada. Es comúnmente necesario para la iniciación o el mantenimiento de callos y cultivos en suspensión. Algunas veces necesario para la regeneración de plántulas. Reguladores del crecimiento • Grupos básicos de reguladores del crecimiento: - Auxinas - Citoquininas - Giberelinas - Acido abscísico - Etileno • Generalidades: - Actúan a bajas concentraciones - Interactúan unos con otros (los resultados están determinados por las concentraciones relativas entre las diferentes fitohormonas). Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales - Los reguladores endógenos del crecimiento están presentes en la planta durante todo su ciclo de vida pero su concentración fluctúa. Su concentración relativa varía en función del estado fisiológico de la planta y en cada uno de los órganos de ésta. - Están involucrados en numerosos procesos fisiológicos. Las auxinas se emplean como promotores de la proliferación celular y la inducción de la morfogénesis O OH Acido indol acético (AIA) (auxina endógena) N • Las auxinas fueron descubiertas entre 1933 y 1935 a partir de bioensayos realizados para caracterizar el mensajero responsable de la elongación y de la respuesta fototrópica del coleoptile de gramíneas. - Alargamiento y división celular - Crecimiento de secciones de hojas, tallos y frutos - Formación de raíces adventícias - Dominancia apical - Acción herbicida - Estimulación de la producción de etileno • Se sintetizan en las yemas, hojas jóvenes, frutos y en el embrión. La concentración endógena en la planta varía entre 0,001 y 0,1 mg/Kg. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales • Su transporte es polar • Auxinas sintéticas: - Acido indol butírico (IBA) - Acido naftalen acético (ANA) - 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) Las citoquininas determinan diferentes respuestas morfogenéticas en combinación con las auxinas • Fueron descubiertas en 1955 estudiando sustancias promotoras de la división celular in vitro. • Están involucradas en variadas respuestas fisiológicas: - Promoción de la división celular - Promoción de la organogénesis (relación auxinas/citoquininas) - Retardo de la senescencia - Síntesis de clorofila y desarrollo de cloroplastos • Citoquininas endógenas: - Zeatina (Zea) - Isopenteniladenina (2iP) • Citoquininas sintéticas: - Kinetina (Kin) - Benziladenina (BAP) Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales • Se sintetizan en el embrión y las raíces; se encuentran en todos los tejidos. La concentración endógena en plantas varía entre 0,1 y 500 g/Kg. • Su transporte es no polar. Las giberelinas favorecen el crecimiento y el alargamiento de los entrenudos de los brotes O Acido giberélico (GA3) C O HO H OH H CH3 H COOH CH3 • Fueron aisladas del hongo Gibberella fujikuroi, a partir de plantas de arroz infectadas. Estas plantas presentaban marcada clorosis y largos entrenudos. Los primeros ensayos se llevaron a cabo usando extractos solubles del hongo. • El ácido giberélico (GA3) fue la primera giberelina identificada. En la actualidad se conocen alrededor de 50 giberelinas diferentes. • Algunos efectos mediados por las giberelinas son: Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales - Promoción del crecimiento en plantas de genotipos enanos o plantas bianuales - Crecimiento de yemas latentes - Germinación de semillas en dormición - Floración - Movilización de reservas en la semilla • Se sintetizan en hojas jóvenes, en yemas y en el embrión. • Su transporte no es polar. Etapas del cultivo in vitro de plantas superiores Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales Las distintas etapas del proceso de micropropagación definen cada nuevo procedimiento a realizar • Etapa I: establecimiento de un cultivo aséptico - Esta etapa se considera finalizada cuando se logra un adecuado número de explantos sobrevivientes sin contaminación. • Etapa II: producción de nuevos brotes clonales que separados del explanto inicial pueden dar origen a nuevas plantas - La multiplicación se realiza a partir de los nuevos vástagos, tanto apicales como axilares, que a su vez serán subcultivados incrementando su número. • Etapa III: preparación para el crecimiento en su ambiente natural - Enraizamiento Agrobiotecnología - Los vástagos o plantines deben crecer lo suficiente como para poder fotosíntetizar y así sobrevivir sin el suplemento artificial de carbohidratos. • Etapa IV: transferencia al ambiente natural Micropropagación masiva - La transferencia de los plantines de in vitro a ex vitro es sumamente importante. Si no se realiza cuidadosamente puede resultar en importantes pérdidas del material micropropagado. El proceso de micropropagación de especies vegetales consta de varias etapas Elección de una planta madre selecta Explantos ETAPA 1 Desinfección superficial Establecimiento en medio de cultivo apropiado Transferencia a un medio de multiplicación ETAPA 2 Formación de brotes o embrioides Agrobiotecnología ETAPA 3 Transferencia a un medio para el enraizamiento de los brotes ETAPA 4 Pasaje a maceta en un invernáculo Cultivo de tejidos vegetales Etapa I: Elección del explanto inicial Los explantos deben ser esterilizados antes de ser establecidos en condiciones de cultivo • Protocolo tipo de esterilización superficial de material vegetal: - Etanol 70%, entre 5 y 10 seg. - Solución de hipoclorito de sodio (NaCIO) de 5 a 20%, entre 5 y 30 min. Este paso puede ser reemplazado por el uso de soluciones diluídas de bicloruro de mercurio (HgCl2), entre el 0,01 y 0,05%. - Enjuagues con abundante H2O estéril (4 ó 5 veces). Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales - En el caso del HgCl2, el material se debe enjuagar sucesivas veces pues es difícil de eliminar. El cultivo in vitro de plantas puede iniciarse a partir de la extracción de yemas de la planta madre Propagación a partir de yemas apicales y/o axilares Agrobiotecnología Micropropagación masiva Adaptado de: Edwin George. Plant Propagation by Tissue Culture,1996. El explanto inicial sigue su diferenciación a vástago (plantín en crecimiento) Etapa I: Diferenciación del explanto Agrobiotecnología Micropropagación masiva Plantín de arándano a los 30 días de su iniciación in vitro La multiplicación de plantines se realiza bajo condiciones de asepsia absoluta Etapa II: Subdivisión de microplantines bajo flujo de aire estéril Agrobiotecnología Micropropagación masiva Multiplicación de soja in vitro La tasa de multiplicación se optimiza para obtener un máximo rendimiento Etapa II: Multiplicación a gran escala Agrobiotecnología Micropropagación masiva Plantines de papa multiplicados in vitro Antes de cada nueva subdivisión o repique se constata la calidad del material en propagación Etapa II: Monitoreo de la calidad y homogeneidad de los plantines Agrobiotecnología Micropropagación masiva Plantas transgénicas de soja multiplicadas clonalmente El control varietal o genotípico puede realizarse utilizando marcadores moleculares • Caracterización genotípica El control varietal puede desarrollarse por distintas técnicas de marcadores moleculares: - RAPD: Random Amplified Polymorphic DNA. - AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphisms. - SSR: Simple Sequence Repeats (microsatélites). - SNP: Single Nucleotide Polymorphism. - RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism. Agrobiotecnología Micropropagación masiva El control varietal puede realizarse utilizando marcadores moleculares Agrobiotecnología Micropropagación masiva Puesta a punto de la técnica de microsatélites para identificación varietal en arándanos Etapa III: enraizamiento El enraizamiento ideal depende de la especie de interés Métodos alternativos de enraizamiento Las especies que enraizan in vitro tienen mayor probabilidad de supervivencia durante la aclimatación Etapa III: enraizamiento in vitro Agrobiotecnología Micropropagación masiva Plantas de alfalfa regeneradas y enraizadas in vitro La rusticación es una etapa crítica en la que gran cantidad de plantas deben ser aclimatadas gradualmente Etapa IV: Invernaderos / Aclimatación de plantas Agrobiotecnología Micropropagación masiva Rusticación de plantas transgénicas de soja (izq); eventos transgénicos de maíz y alfalfa en invernáculo (der) El proceso culmina con el desarrollo de las plantas hasta alcanzar el tamaño comercial Etapa IV: Invernaderos / Finalización Agrobiotecnología Micropropagación masiva Rusticación de plantas transgénicas de soja (sup.); Plantas doble haploides de maíz obtenidas y multiplicadas a partir de la tecnología de cultivo in vitro. Vías morfogenéticas: organogénesis y embriogénesis Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales Posibles respuestas de los cultivos vegetales in vitro Existen dos posibles vías morfogenéticas para la diferenciación de novo de brotes o plantas completas • Posibles vías morfogenéticas (pueden darse de manera directa o indirecta): - Organogénesis - Embriogénesis • Diferencias entre las dos posibles vías: - La organogénesis es de origen pluricelular. Un grupo o cluster de células del explanto inicial se desdiferencia inicialmente para luego rediferenciarse dando lugar a un órgano vegetal. No se obtienen por esta vía plantas completas. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales - La embriogénesis se presupone de origen unicelular. Una célula del explanto se aísla y constituye el punto de partida para la obtención de un embrión somático. Se diferencian embriones o estructuras bipolares que completan cada una de las etapas implicadas en la ontogenia de un embrión cigótico. El resultado es una planta completa. Fotomicrografías de las dos vías morfogenéticas en papa Organogénesis d Embriogénesis av pf pf cv ar Estudio de la ontogenia de las vías morfogenéticas implicadas en la regeneración de diferentes cultivares de C. tinctorius a b c Caracterización histológica de material de C. tinctorius en diferentes estadios de diferenciación: a., brotes regenerados; b, nódulos meristemáticos; c, corte longitudinal de las neoformaciones. La micropropagación puede iniciarse partiendo de trozos de órganos como hoja o pecíolo Agrobiotecnología Micropropagación masiva Propagación por medio de vástagos adventicios o embriones: tipos de morfogénesis Sistemas de propagación vegetativa in vitro Regeneración directa e indirecta Se pueden desarrollar plantas completas a partir de diferentes explantos mediante morfogénesis directa Agrobiotecnología Micropropagación masiva Morfogénesis directa La morfogénesis directa permite obtener una gran cantidad de plantines en la etapa inicial de la micropropagación Micropropagación por morfogénesis directa Agrobiotecnología Micropropagación masiva Plantines de Begonia rex originados por morfogénesis directa La morfogénesis indirecta permite regenerar plantas a partir de callos formados por células desdiferenciadas Morfogénesis indirecta Resulta posible regenerar brotes o yemas a partir de tejidos vegetales desdiferenciados in vitro • Consideraciones generales: - Callo: masa de células desdiferenciadas obtenidas a partir de un explanto cultivado in vitro (disco de hoja, meristema, células en suspensión, etc.) - Es posible regenerar brotes o vástagos a partir de estos callos. - Las plantas diferenciadas pueden no ser uniformes, debido al posible desarrollo de variantes somaclonales. Esto debe tenerse en cuenta, especialmente cuando se trabaja en propagación clonal a gran escala. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales La embriogénesis indirecta puede utilizarse para generar plantas transgénicas Callos de alfalfa en regeneración en medio selectivo Agrobiotecnología Micropropagación masiva Gentileza Indear S.A. La ontogenia de un embrión somático es similar a la diferenciación de un embrión de origen sexual Embriogénesis somática en alfalfa Agrobiotecnología Micropropagación masiva Izq. Callo embriogénico de alfalfa; Der. Detalle de embrión somático de alfalfa Sistemas de propagación vegetativa in vitro Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales Propagación vegetativa in vitro Regeneración directa e indirecta Aplicaciones del cultivo de tejidos: Transformación genética de plantas Agrobiotecnología Aplicaciones del cultivo de tejidos La transformación genética vegetal implica la regeneración de plantas completas a partir de las células transformadas -Entre las tecnologías de transformación genética de plantas de uso más difundido se incluyen la biobalística y la transformación mediada por vectores biológicos (gro. Agrobacterium spp). -Se transforman células, tejidos u órganos vegetales. - Una vez transferido e insertado el ADN foráneo al genoma de la célula vegetal blanco de la transformación resulta necesario regenerar una planta completa que resulte transformada de manera estable. -La regeneración de una planta transgénica puede tener lugar por organogénesis o embriogénesis. -Debe priorizarse una vía morfogenética directa de manera de evitar eventos quiméricos y posibles variantes La obtención de plantas transgénicas involucra la aplicación exitosa de diferentes tecnologías de cultivo in vitro Se resumen la etapas implicadas en la obtención de plantas transgénicas de soja que incluyen la infección e incubación de explantos con A. tumefaciens (a y b), la regeneración de brotes de novo (c), su enraizamiento y rusticación así como la caracterización genotípica y fenotípica de las plantas obtenidas (d-f). a c b Agrobiotecnología Aplicaciones del cultivo de tejidos e f d Gentileza Indear S.A. Pasos implicados en la transformación genética de Cártamo (Carthamus tinctorius) Obtención de eventos transgénicos de Carthamus tinctorius como plataforma biológica para la producción de proteínas recombinantes. Gentileza Indear S.A. Transformación genética de alfalfa Material vegetal: Clones seleccionados de genotipos modelo, pre-comerciales y comerciales (con aceptable potencialidad embriogénica) Explantos: porciones de tejido de plantas madre en invernáculo Multiplicación : Método eficiente para la propagación clonal de los eventos transgénicos Elevada eficiencia de transformación. Eficientes % de regeneración, screening y selección in vitro de eventos putativos de transformación. Multiplicación y mantenimiento de eventos transgénicos en invernáculo Gentileza Indear S.A. Liberación de patógenos Agrobiotecnología Aplicaciones del cultivo de tejidos El empleo de meristemas como explantos es una posible herramienta para el saneamiento de plantas infectadas Cultivo de meristemas Meristema apical Meristema axilar Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales Domo meristemático Los meristemas son grupos de células indiferenciadas que retienen la capacidad de dividirse durante todo el ciclo de vida de una planta Los meristemas determinan el crecimiento de la planta y dan origen a sus diferentes órganos • Posibilitan la micropropagación de diferentes especies vegetales. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales • Constituyen el explanto ideal para liberar de patógenos in vitro a plantas infectadas por virus, hongos o bacterias. • Son ampliamente utilizados como explantos para la criopreservación y conservación de germoplasma. El cultivo de meristemas facilita la eliminación de patógenos - El domo meristemático no está vascularizado (muchos patógenos se translocan por los tejidos de conducción). - El número de partículas virales es menor en los meristemas que en otros tejidos (White, 1934). - La velocidad de división celular a nivel del meristema es mayor que la velocidad de replicación de un virus. - Las primeras plantas saneadas a partir del cultivo de meristemas fueron obtenidas por Morel y Martin entre 1952 y 1957 a partir de cultivos de papa y Dahlia. Los meristemas se introducen en tubos individuales para evitar contaminaciones masivas Agrobiotecnología Micropropagación masiva Meristemas de caña de azúcar en crecimiento El cultivo de tejidos posibilita el saneamiento de las plantas multiplicadas vegetativamente Mediante esta técnica es posible sanear plantas infectadas sistémicamente por diferentes tipos de patógenos como bacterias, hongos, virus y viroides. Síntomas producidos por el Tomato mosaic virus. Partículas de Potato virus Y Agrobiotecnología Aplicaciones del cultivo de tejidos El tratamiento de plantas madres puede efectuarse por distintas técnicas El material vegetal infectado por virus, bacterias, hongos y/o micoplasmas puede ser tratado con diferentes técnicas: • Termoterapia • Quimioterapia • Cultivo de meristemas Agrobiotecnología Aplicaciones del cultivo de tejidos Estos tratamientos pueden usarse por separado, pero incrementan su efectividad notablemente cuando se los combina, trabajando in vivo e in vitro. Consideraciones prácticas para el saneamiento de plantas madres por termoterapia • Termoterapia El tratamiento por calor es un método eficaz para inactivar algunos virus y viroides. Se debe elegir una temperatura y tiempo de tratamiento tales que la planta sea capaz de sobrevivir, pero que permita la inactivación del virus. Ejemplo: El tratamiento de plantas madres de Solanum tuberosum a 8ºC durante 4 meses permiten obtener un 30% de platas libres de Potato spindle tuber viroid (PSTV). Agrobiotecnología Aplicaciones del cultivo de tejidos Sintomas inducidos por PSTV en tubérculos de papa Aspectos prácticos del saneamiento de material vegetal por quimioterapia • Quimioterapia Esta técnica implica el tratamiento de las plantas madres o explantos (in vivo o in vitro) con las siguientes sustancias: - Fungicidas en el caso de hongos - Insecticidas frente al ataque de insectos - Antibióticos en el caso de bacterias - Inhibidores metabólicos (actinomicina D) Agrobiotecnología Aplicaciones del cultivo de tejidos - Análogos de aminoácidos (fluorofeniladenina) La metodología de saneamiento empleada debe ser evaluada • Las plantas regeneradas in vitro deben ser evaluadas para comprobar si ha sido eliminado el patógeno considerado. • Estas pruebas se denominan ensayos de indización (indexing) y difieren según el sistema huesped-patógeno de que se trate. • Se incluyen entre estas pruebas: - Selección visual u observación de síntomas - Empleo de hospedantes indicadores Agrobiotecnología Aplicaciones del cultivo de tejidos - Métodos serológicos - Microscopía electrónica Observación visual • Consiste en la observación de síntomas. • Se trata de un método impreciso. • Resulta confiable en el caso de enfermedades que inducen síntomas muy característicos o conspícuos. Potato Virus X Coliflower Black Rot Agrobiotecnología Aplicaciones del cultivo de tejidos Enfermedades bacterianas y/o virales con síntomas distintivos Mosaico clorótico producido por Tomato mosaic virus en tomate Síntomas de pie negro y podredumbre blanda causados por Erwinia carotovora en papa. Agrobiotecnología Aplicaciones del cultivo de tejidos Pie negro Tubérculo inoculado con E. carotovora Tuberculo no inoculado Síntomas de enfermedades causadas por hongos Antracnosis en Fragaria spp. causada por Colletotrichum Síntomas en estolones Agrobiotecnología Aplicaciones del cultivo de tejidos Síntomas en frutos Powdery Mildew en Solanum tuberosum causado por Erysiphe spp. Síntomas de enfermedades causados por nematodes Disminución de tamaño causada por nematodes en maíz Agrobiotecnología Aplicaciones del cultivo de tejidos Micrografías de un nematode del género Trichodorus (tamaño aproximado: 0,5 µM de diámetro, 1 mm de largo). Empleo de hospedantes indicadores • Es una técnica frecuentemente utilizada para detectar virus que pueden transmitirse mediante el jugo infeccioso extraído de plantas enfermas. • Se usan como indicadoras variedades muy susceptibles de la especie estudiada u otras especies que desarrollan síntomas característicos en un corto tiempo. Agrobiotecnología Aplicaciones del cultivo de tejidos • Los síntomas inducidos en la planta indicadora revelan la presencia del patógeno y permiten identificarlo. Métodos serológicos • Se basan en la alta especificidad de la reacción antígeno-anticuerpo, por la cual un anticuerpo reconoce y se combina sólo con la porción de antígeno que le dio origen. - Pruebas inmunoenzimáticas (DAS-ELISA) - Floculación de látex sensibilizado (partículas de látex recubiertas por anticuerpos específicos, se observa agregación de partículas con formación de precipitado) - Microprecipitación (gotas de antisuero y antígeno, se observa formación de precipitado) Agrobiotecnología Aplicaciones del cultivo de tejidos Microscopía electrónica • Observación de partículas virales en extractos vegetales (dip method) • Inmunoelectromicroscopía • Cortes ultrafinos de tejidos vegetales (observación directa del patógeno o de anomalías citológicas o efectos histopatológicos como secuela de la presencia del patógeno) Inclusiones virales detectadas con el microscopio óptico Agrobiotecnología Aplicaciones del cultivo de tejidos Inclusión cristalina del virus del mosaico de tabaco (I) en células epidérmicas de Nicotiana tabacum Célula de tricoma de Vicia faba con inclusión amorfa (I) Conservación de germoplasma Agrobiotecnología Aplicaciones del cultivo de tejidos Conservación de germoplasma Las técnicas de cultivo in vitro de tejidos vegetales costituyen parte esencial de una estrategia general para la conservación e intercambio de recursos fitogenéticos. Agrobiotecnología Aplicaciones del cultivo de tejidos Gentillieza W. Roca Existen diferentes métodos para la conservación de germoplasma • Colecciones in vitro • Bancos de semillas • Crioconservación Agrobiotecnología Aplicaciones del cultivo de tejidos www.cgiar.org Bancos de germoplasma in vitro • La conservación de germoplasma mediante el cultivo de tejidos se basa en la limitación del crecimiento del material vegetal. • Implementación: - Medios de cultivo de composición subóptima - Baja intensidad lumínica (<500 lux) - Temperaturas inferiores a las adecuadas para el activo metabolismo de las células y tejidos vegetales bajo cultivo (15-20 ºC) Agrobiotecnología Aplicaciones del cultivo de tejidos - Alta concentración de compuestos osmóticamente activos (sacarosa, manitol) Los bancos de semilla permiten la conservación de especies vegetales que se propagan sexualmente • Resultan de utilidad en el caso plantas cuyas semillas se mantienen viables durante un largo período de almacenamiento. • El material debe mantenerse bajo condiciones controladas en una cámara de mantenimiento: - Bajas temperaturas - Bajo contenido de humedad • Este método no puede aplicarse a la conservación de plantas cuyas semillas presentan longevidad reducida, especies autoincompatibles o especies de propagación vegetativa obligada Agrobiotecnología Aplicaciones del cultivo de tejidos Crioconservación de germoplasma • Consiste en el mantenimiento de material vegetal a temperaturas ultrabajas (-196 ºC), por inmersión en nitrógeno líquido • Diferentes explantos (ápices de yemas, meristemas, anteras, embriones inmaduros) así como callos y suspensiones celulares pueden ser crioconservados a -196 ºC. Agrobiotecnología Aplicaciones del cultivo de tejidos www.science.siu.edu Etapas del proceso de crioconservación de material vegetal • Crioprotección • Congelamiento • Almacenamiento • Descongelamiento • Pruebas de viabilidad Agrobiotecnología Aplicaciones del cultivo de tejidos • Recultivo Crioconservación y cultivo de meristemas de soja Cultivo in vitro de células haploides y embriones Agrobiotecnología Aplicaciones del cultivo de tejidos Aplicaciones del cultivo in vitro de células haploides • Mejoramiento vegetal. • Estudios de genética cuantitativa. • Estudios de diferenciación celular y alternancia de generaciones. Agrobiotecnología Aplicaciones del cultivo de tejidos Tétradas de microsporas Sacos polínicos (con granos de polen) Cultivo in vitro de anteras Consiste en el cultivo de anteras inmaduras en medios sintéticos que promueven la división celular y la formación de embriones o callos. Los embriones, transferidos a un medio de regeneración, darán lugar a plantas haploides. anteras Agrobiotecnología Aplicaciones del cultivo de tejidos El cultivo de anteras ofrece numerosas ventajas para el mejoramiento de plantas de interés comercial - Permite la expresión e identificación de alelos recesivos - Constituye una fuente útil para el mejoramiento intravarietal - Permite la rápida introducción de caracteres citoplasmáticos en un fondo genético homocigótico - Crea y acrecienta las reservas citogenéticas y citoplasmáticas de los cultivos Agrobiotecnología Aplicaciones del cultivo de tejidos - La obtención de haploides duplicados resulta útil para el desarrollo de nuevas variedades con el fin de distribuirlas en ambientes ecológicos muy diversos y para ensayarlas en ellos. - Las microsporas o células haploides pueden usarse para la inducción de mutantes y para la selección de caracteres esporofíticos. Aplicaciones del cultivo de óvulos • Rescate de embriones (mediante polinización y fertilización in vitro) • Inducción de la embriogénesis somática a partir de nucelos de diferentes especies vegetales. es Agrobiotecnología Aplicaciones del cultivo de tejidos Embriones somáticos (es) obtenidos a partir del cultivo de óvulos de Arabidopsis. El cultivo de embriones inmaduros permite realizar diferentes aplicaciones • Estudio de requerimientos nutricionales de embriones en desarrollo. • Rescate de embriones híbridos derivados de cruzamientos interespecíficos e intergenéricos. • Produción de monoploides, líneas doblehaploides o poliploides. • Superación de la latencia de las semillas. Embrión cigótico Agrobiotecnología Aplicaciones del cultivo de tejidos Corte longitudinal de una semilla de Brassica Pasos implicados en la obtención de plantas doble haploides de maíz Etapas implicadas en el protocolo para la obtención de plantas doble-haploides de maíz en el marco de proyectos propios de mejoramiento vegetal o como provisión de servicios externos. Gentileza Indear S.A. Semillas sintéticas Agrobiotecnología Aplicaciones del cultivo de tejidos Semillas sintéticas Embriones somáticos de Pinus sp Agrobiotecnología Aplicaciones del cultivo de tejidos Obtención de embriones somáticos Las semillas artificiales reproducen la estructura de una semilla de origen sexual Agrobiotecnología Aplicaciones del cultivo de tejidos Las semillas artificiales poseen una cubierta de protección, contienen sustancias de reserva y portan un embrión en su interior. Procedimiento para encapsular embriones somáticos Agrobiotecnología Aplicaciones del cultivo de tejidos Cultivo de protoplastos Agrobiotecnología Aplicaciones del cultivo de tejidos Los protoplastos son células vegetales desprovistas de pared celular Agrobiotecnología Aplicaciones del cultivo de tejidos Suspensión de protoplastos de mesófilo de tabaco Los protoplastos constituyen un explanto ideal para diferentes fines biotecnológicos Agrobiotecnología Aplicaciones del cultivo de tejidos Esquema general de la manipulación genética de protoplastos in vitro para la realización de técnicas de mutagénesis, fusión o transformación. Métodos para el aislamiento de protoplastos • Método mecánico - Bajo rendimiento - Procedimiento tedioso - Aplicabilidad limitada Choque osmótico para producir plasmólisis celular y ruptura de la pared. Los protoplastos se liberan de las células rotas mediante el restablecimiento de su nivel osmótico. • Método enzimático Consiste en la incubación de las células en una mezcla de enzimas que degradan la pared celular: celulasas, hemicelulasas y pectinasas. Las preparaciones comerciales de dichas enzimas contienen además proteasas, nucleasas y lipasas. Otras aplicaciones: Multiplicación de plantas para ensayos agronómicos Agrobiotecnología Micropropagación masiva Papas transgénicas resistentes al Potato virus Y (PVY) Proyecto Biosidus- Lab. Agrobiotecnología, FCEyN-UB Agrobiotecnología Micropropagación masiva Micropropagación masiva de plantines transgénicos de papa destinados a ensayos de campo en condiciones controladas Las infecciones virales producen grandes pérdidas económicas en la producción de papa en la Argentina Los virus económicamente más relevantes son: • Potato leaf roll virus . (PLRV) • Potato virus Y . (PVY) • Potato virus X . (PVX) Síntomas producidos por una infección del virus PVY en plantas de papa Selección de líneas resistentes al virus PVY en condiciones contenidas Ensayos de infección con el virus PVY de líneas transgenicas de papa en condiciones de invernadero 300 líneas Agrobiotecnología 200 líneas Infección mecánica Micropropagación masiva 100 líneas Selección a campo 100 líneas Agrobiotecnología Micropropagación masiva 80 líneas Infección natural 20 líneas Ensayos comparativos con la línea transgénica SY233 Se realizan ensayos en cuatro regiones distintas de Argentina Agrobiotecnología Micropropagación masiva Infección natural SY233 1/1500 infectadas Control 450/1500 infectadas Eventos transgénicos de alfalfa con resistencia a estrés hídrico Agrobiotecnología Lab. de Transformación y cult. de tejidos Indear- Bioceres Micropropagación masiva Evaluación fenotípica de eventos transgénicos de alfalfa multiplicados clonalmente in vitro en ensayos de resistencia a estrés hídrico a campo y bajo shelter. Etapas del proceso regulatorio CONABIA 1° Fase de Evaluación CONABIA 2° Fase de Evaluación SENASA DIRECCION NACIONAL DE MERCADOS AGROALIMENTARIOS (SAGPyA) CERTIFICACION DE PAPA SEMILLA Agrobiotecnología Micropropagación masiva COMERCIALIZACION Referencias 1. Altman, A. and Loberant, B. Micropropagation: clonal plant propagation in vitro. En: Agricultural Biotechnology. Arie Altman Ed. Chapter 2: 19 – 40 Marcel Dekker, New York, U.S.A., 1998. 2. Cassells, A. S. In vitro production of pathogen-free plants. En: Agricultural Biotechnology. Arie Altman Ed. Chapter 4: 57 – 82. Marcel Dekker, New York, U.S.A., 1998. 3. Doods, J. H. and Roberts, L. W. Experiments in Plant Tissue Culture. Cambridge University Press. Cambridge, U.S.A. 1992. 4. Herrera Estrella, A. and Chet, I. Biocontrol of bacteria and phytopathogenic fungi. En: Agricultural Biotechnology. Arie Altman Ed. Chapter 11: 263 – 282. Marcel Dekker, New York, U.S.A., 1998. 5. Litz, R. E. Cultivo de embriones y óvulos. 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