Modelos animales en el estudio de la patología

BQ.17.- MODELOS ANIMALES PARA LA PATOLOGÍA
1. Definiciones:
a. Animal transgénico: Animal que porta integrado en su genoma un gen foráneo de la
misma o distinta especie.
b. Animal quimérico: Animal que porta un gen alterado introducido por manipulación de
células STEM embrionarias (SE). Algunas células de este animal derivan del
blastocisto receptor y otras de las células SE inyectadas. Es por tanto un mosaico.
c. Animal Knock-out: Animal en el que se ha interrumpido la función de un gen
determinado por recombinación homóloga, dando lugar a un alelo nulo.
d. Animal Knock-in: Similar al anterior excepto en que tiene sustituido un gen A en el
locus A por un alelo distinto de A o por otro gen B. Está obtenido por recombinación
homóloga.
e. Trasferencia nuclear: Técnica utilizada para hacer un “clon”. El núcleo de una célula
somática de un adulto se inserta en el citoplasma de un huevo. El huevo reprograma los
genes del núcleo de la célula adulta y se comporta como una célula pluripotencial
dando lugar a un nuevo individuo.
2. Organismos utilizados como modelos transgénicos:
a. Levaduras: ej empleadas para ataxia de Friedreich.
b. Arabadopsis (planta).
c. C.elegans (gusano).
d. Drosophila. La más empleada junto con el ratón.
e. Pez Zebra.
f. Ratas.
g. Cerdo.
h. Oveja.
i. Cabra.
j. Vaca.
k. Mono.
l. Xenopus (rana): Xenopus laevis fueron los primeros animales en los que se realizó el
clonaje por transferencia nuclear. Se estableció la técnica de microinyección. La
ventaja es que son ovocitos de núcleos muy voluminosos.
m. Ratón: Modelo en patología humana más importante. Ventajas:
 Fisiológicamente similar al humano.
 Gran reserva de mutantes espontáneos o, generados por mutagénesis química
o por radiación.
 Conocimiento genético extenso (casi casi todo su genoma).
 Colinearidad del genoma humano y el del ratón o sintenia. Ej gran parte del
cromosoma 1 humano está en el 2 de ratón.
 Fenotipo mutante muy similar a fenotipo mutante humano. Hay excepciones,
por ej son malísimos para ATE.
 Permite estudio del desarrollo de una enfermedad y la aplicación de terapias.
 Permite estudiar genes modificadores de la expresión del fenotipo enfermo y
ayudar al estudio de enfermedades poligénicas.
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 S/e son malos para realizar clonación.
3. ¿Cómo integrar el ADN humano en un ADN animal? Pasos.
a. Tenemos el ADN humano que puede ser de dos tipos: genómico y cADN.
b. Tenemos que meterlo en un vector:
 En el caso del ADN genómico los vectores serán trozos de cromosomas,
minicromosomas, BAC (de Bacterial) y YAC. Esto es para modelos
avanzados porque es muy real.
 En el caso del cADN serán plásmidos. Hay que añadir los promotores.
c. Para que exprese nuestro nuevo gen en las células del animal necesitamos promotores,
que son de diferentes tipos:
 Promotor constitutivo: se expresa en todas las células todo el tiempo.
 Promotor regulable por agentes exógenos (hormonas, tetraciclina): se expresa
en todas las células si hay inductor (expresión condicionada).
 Promotor propio del gen en estudio: El gen se expresa sólo en las células en
las que este gen se expresa normalmente.
 También podemos realizar una ablación génica por expresión de un gen ADN
antisentido. Introducimos un cDNA al revés por lo que producimos un RNA
complementario al que era inicialmente⇒doble cadena RNA⇒eliminación.
d. La inserción podemos hacerla al azar (no deseable porque no sabemos bien si
interrumpirá otro gen, cómo se regulará,…) o preferiblemente controlada mediante la
introducción de unas secuencias flanqueantes (ej genes de resistencia a atbs).
Vemos en esta imagen a diferencia al
azar/ controlada:
-si es al azar utilizaría alguna otra
secuencia distinta a las regiones de
homología que hemos puesto para la
recombinación. Ello implicaría que tb se
integra el gen de la Tyr Kinasa y por
tanto la célula muere en presencia de
ganciclovir.
-si utiliza las secuencias de homología
que deseamos no se integra el gen Tyr K
por lo que es resistente a neo y ganciclo.
4. Producción
de
un
ratón
transgénico. (puede llevar años):
a. Se inyecta el ADN ajeno (microinyección) o se introduce por electroporación (pulso
eléctrico atrae DNA a núcleo) en el pronúcleo masculino de un óvulo fecundado.
b. El óvulo se implanta quirúrgicamente en trompa madre adoptiva pseudogestante.
c. Una proporción de la descendencia será trasgénica.
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d. Ejemplo de un ratón transgénico: el gen de la hormona de crecimiento humana
(ordinariamente sólo expresada en hipófisis anterior) se combinó con el promotor del
gen de la metalotioneína y se empleó para producir ratones transgénicos que debido a
la amplia especificidad del promotor expresaron el gen en muchos tejidos y crecieron
hasta alcanzar un tamaño gigante.
5. Producción de un ratón quimera.
a. El genoma de las células en cultivo se altera mediante experimentos de transferencia de
ADN como por ej electroporación y después se seleccionan las células que lo han
integrado (ej R a neo y ganciclovir).
b. Después las células que contienen el nuevo gen se introducen en blastocistos de ratón.
c. Los blastocistos mosaicos se transfieren entonces al útero de una madre adoptiva.
d. Nacimiento de ratones quiméricos, que poseen células normales y alteradas.
e. Ejemplo: altero una SC de ratón agoutí homocigoto (el color de ratón puede ser agoutí
que es dominante o negro=recesivo) y la introduzco en blatocisto ratón negro. Me sale
un mosaico (franjas de color) que produce tres tipo de gametos: negro, agoutí, agoutí
con el gen integrado. Esto lo cruzo con un ratón negro y obtengo la siguiente
descendencia: negro sin integración, pardo sin integración y pardo con integración del
gen (es heterocigoto). Cruzo dos de estos últimos y en la descendencia habrá 1
homocigoto pardo con integración (el que me interesa), 2 heterocigotos con integración
y homocigoto negro sin integración. Verlo aquí:
6. Generación de un Knock-out.
a. Es la recombinación homóloga resultante en interrupción genética. Ej: interrumpir un
exón con un gen de resistencia a atbs.
b. Sirven para estudiar la función de un gen para el cual no existan mutantes naturales.
c. Generalidades:
i. Aunque se genere un alelo nulo estos ratones muchas veces no se afectan
fisiológicamente. Muchos genes no tienen fenotipo, no son indispensables.
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ii. La mayor parte de los genes son pleiotrópicos, esto es, se expresan e diferentes
tejidos, en diferentes formas y a diferentes tiempos en el desarrollo.
d. Lo más importante es generar el constructo de DNA que va a transformar el alelo en
nulo. Hoy día hay empresas que generan knock-out para cada gen del ratón y ahorran
un trabajo que antes suponía 12 meses de 6-7 personas todos los días.
7. Utilidad de estudios con ratones transgénicos.
a. Rescate (curación) de mutantes: rescatamos en fenotipo y lo llevamos a genotipo.
b. Ratones como biorreactores: síntesis prots (ej AcMo).
c. Estudiar la relación estructura-función.
d. Modelos de enfermedades humanas, usos: análisis de los mecanismos celulares y
moleculares implicados en la patogénesis y para testar la terapia farmacológica o
génica.
8. Ejemplos de modelos animales de enfermedades genéticas.
a. Anemia falciforme: Se hace una combinación de animal Knock-out (los genes
endógenos de globina son anulados) y animal transgénicos (los genes humanos de
globina son introducidos como transgenes).
b. Fibrosis quística: Se hace fundamentalmente un animal Knock-out. En esta
enfermedad no funciona bien la terapia génica.
c. Enfermedad poliquística renal: Se usan modelos animales Knock-out.
d. Narcolepsia: Se usan Knock-in. Esta enfermedad existe también en perros. Se
identifica el gen y se transfiere al ratón.
9. Principios de la clonación molecular. (no dada en clase). Es el aislamiento de una secuencia
de ADN de interés y la obtención de múltiples copias de ésta en un organismo, generalmente
una bacteria, que puede crecer durante largos periodos de tiempo.
a. Necesitamos romper la cadena de ADN para aislar la secuencia que nos interesa:
endonucleasas de restricción..
b. Después necesitamos unir este fragmento al ADN de otra fuente (vector), es decir crear
una molécula de ADN recombinante. Para esto es necesario la enzima DNA-ligasa
(enzima que forma enlaces de fosfodiéster para unir dos moléculas de ADN de doble
cadena).
c. Vectores: Son las moléculas de ADN en que se ha introducido el fragmento de ADN
aislado. Pueden replicarse de manera autónoma en un huésped, como células
bacterianas o de levadura. Así, obtenemos múltiples copias de nuestra secuencia de
ADN.
Dijo que lo más importante para el examen eran los diferentes tipos de mutaciones (y
enfermedades que producen) y la diferencia entre animales transgénicos y quiméricos.
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