CTB-baculovirus2014.pdf

El sistema de expresión Baculovirus-células de
insecto
Oscar Taboga
Instituto de Biotecnología
INTA
1 – Introducción a los baculovirus
2 – Baculovirus para la expresión de
proteínas
3 – Puesta en práctica, ejemplos
Preguntas y discusión
Parte 1 – Introducción a los baculovirus
¿Qué son los baculovirus?
• Su ciclo de vida y cómo podemos
hacer uso de él
Los baculovirus son un grupo de virus
encontrados mayormente en insectos
(Baculoviridae).
Tienen una estructura de varilla
(baculum=bastón), un diámetro de entre 40-50 nm
y una longitud de entre 200-400 nm.
Su información genética está almacenada en una
molécula de ADN doble cadena, circular, de
aproximadamente 80-200 Kpb.
Spodoptera
frugiperda
Trichoplusia ni
En cultivos celulares o cuando se multiplican dentro
de un insecto permisivo, los baculovirus forman dos
tipos de viriones: virus ocluidos y virus brotados.
peplómeros
envoltura
nucleocápside
Para una sobrevida a largo plazo se
forman los cuerpos de oclusión o
poliedros dentro del núcleo que
ocluyen los virus ocluidos.
matriz
nucleocápsides
envoltura
cálix
Ciclo de replicación
Liberación de viriones
por lisis celular
Poliedros
Solubilización
en el intestino
de la larva
Brotación
Endocitosis
Liberación
del
genoma
Virus brotados
Infección
secundaria
Fusión
Infección primaria
Virus
derivados de
cuerpos de
oclusión
¡Película!
Su ciclo de multiplicación
La proteína poliedrina se acumula hasta alcanzar el 50% del
total de proteínas celulares, pero no es indispensable: el virus
puede multiplicarese en cultivos celulares sin formar cuerpos
de oclusión (virus pol -).
¿Qué significa en términos de expresión de
proteínas?
=>Pueden expresarse genes heterólogos bajo el control del promotor de
poliedrina
=> La expresión ocurre en un estadío muy tardío de la infección
=> Los niveles de expresión serán probablemente muy altos
Parte 1 – Introducción a los baculovirus
Parte 2 – Baculovirus para la expresión de
proteínas
Modificaciones postraduccionales
Parte 3 – Puesta en práctica
Seguridad
Riesgo personal o de contaminación de células de
mamífero.
Estudios mostraron que pueden entrar en células de mamífero, pero no se
transcriben genes
Pueden considerarse entonces que no poseen riesgo de seguridad adicional
y son clasificados como Clase I
Contaminación de otras células de insecto
Aunque su rango de hospedador es bastante limitado, pueden penetrar
otras células de insecto pero no replican ni entran en estadíos tardíos
De todas maneras, cuidado de no contaminar otros trabajos y como todo
organismo recombinante, debe ser considerado potencialmente peligroso
Características generales del BVES
Producción de proteínas en un hospedador eucariota
Siendo un sistema eucariota el BVES es capaz de:
•Plegamiento apropiado
•Modificaciones postraduccionales
Estos requisitos son cruciales para proteínas con
actividad biológica
Características generales del BVES
Altos niveles de expresión
El BVES tiene el potencial de una muy fuerte expresión de
genes heterólogos: se han alcanzado niveles de hasta 2550%de las proteínas totales (1g/l).
Sin embargo, usualmente los niveles de expresión están en
orden de:
•1- 3 mg /l (proteínas intracelulares)
•3-15 mg /l (proteínas secretadas)
•Tan poco como 0.1 mg /l (algunas integrinas)
•Hasta 50 mg /l (algunas kinasas)
Características generales del BVES
Expresión de proteínas tóxicas o termosensibles
La mayor fase de producción de proteínas ocurre tardíamente
en la infección. Esto significa que:
•Pueden expresarse proteínas heterólogas tóxicas a pesar
de posibles efectos sobre funciones celulares esenciales
•Hay poca presión de selección contra el gen tóxico ya que
este no interfiere con la producción de virus brotado
La expresión ocurre a 27°C, lo que puede ser permisivo para
proteínas termosensibles
Características generales del BVES
• Construcciones largas o múltiples
Debido a que el genoma de los baculovirus puede acomodar
grandes porciones de ADN, el sistema permite la expresión de
largas construcciones o múltiples genes simultáneos
• Simplicidad de la tecnología
Los vectores son accesibles para el clonado directo
La construcción de un baculovirus recombinante es
considerablemente más rápida que la de una línea celular
eucariota (CHO, por ejemplo)
Hay un rango muy amplio de vectores comerciales disponibles
y kits para la construcción de virus recombinantes.
Costos
Los costos son significativamente más altos que los
sistemas de expresión bacterianos y de levaduras,
tanto en materiales como en equipamiento.
Modificaciones postraduccionales
Las células de insecto son capaces de lidiar con
modificaciones postraduccionales como:
•Clivaje de péptido señal (incluidos los de mamífero)
•Fosforilación
•N y O glicosilaciones
•Miristilación
•Plegamiento, formación de puentes S-S, oligomerización
•Modificaciones lipídicas
Modificaciones postraduccionales
Limitaciones:
•Clase y grado de modificación puede no ser idéntico al
encontrado en la especie o tejido original
•El muy alto nivel de expresión puede disminuir la
capacidad de la célula de modificar correctamente el
producto
•Secreción, fosforilación y glicosilación pueden verse
particularmente afectadas
•Algunos de estos inconvenientes pueden resolverse usando
promotores más tempranos
Diferencias en las rutas de glicosilación
1 – Introducción a los baculovirus
2 – Baculovirus para la expresión de
proteínas
3 – Puesta en práctica
Preguntas y discusión
Sistemas de expresión
Vector
Hospedador
Metodología
Características
Ambiente eucariota para la producción de
proteínas
Expresión excepcionalmente alta
Expresión durante la fase de oclusión
Expresión a 27ºC
Capacidad de grandes inserciones
Expresión eficiente de genes no “spliceados”
(cDNAs)
Simplicidad de la tecnología
Crecer virus parental
Preparar ADN viral
Clonar gen en vector de transferencia
Preparar ADN plasmídico
Cotransfectar
Screening de recombinantes
Purificar recombinantes
Amplificar recombinantes
Confirmar identidad
Caracterizar expresión génica
Scaling-up
Historia
Placas de lisis occ+ vs
pacas occ- (1:1000)
Gen reportero (igual frecuencia)
Linealización del genoma (eficiencia 30%)
Bsu361
Deleción en orf letal y linealización
(eficiencia 100%)
Bsu361
Bsu361
Variaciones
Bácmidos como fuente de ADN viral
Generación de recombinantes por
transposición
Bácmido bAcGOZA
Ppol
marker
Mini F
Pp10
poliedrina
∆orf1629
Generación de baculovirus recombinantes por el
sistema Bac to Bac
Elección del virus y
especie hospedadora
500 especies
AcNPV y BmNPV
90% identidad
rango de hospedador y líneas
susceptibles muy diferentes y con
distintas propiedades
AcNPV vs BmNPV
Crecimiento y niveles de expresión de
las líneas
Rango de plásmidos de transferencia
Expresión en larvas de insecto (tamaño,
voumen de hemolinfa, canibalismo,
bioseguridad, métodos de infección
Cultivo de células vs larvas
Células:
Igual sistema al usado en la caracterización
inicial
Más “limpio” (medio libre de suero)
Más homogéneas purificaciónes
postraduccionales
Caro
Equipamiento
Cultivo de células vs larvas
Larvas:
Más alta eficiencia de modificaciones
postraduccionales
Bajo costo
Se necesita mantener insectos
Más difícil purificación
Elección de células
Propiedades
Tiempo de duplicación
Capacidad de crecimiento en monocapa o
suspensión
Tamaño
Susceptibilidad
Modificaciones postraduccionales
Elección del plásmido de
transferencia
Método de producción (transposición vs.
recombinación)
Proteína auténtica vs. fusión
Secretada vs citoplasmática
Complementación de la deleción letal en orf
1629
Bajo la regulación de qué promotor
Una o más proteínas
Fenotipo occ + vs occ-
Proteína auténtica
Acortar región 5’ no
traducida entre promotor
y ATG (hasta 100 pb)
Evaluar secuencias que rodean ATG
Consenso: A YAUG Y
consenso
TAAG
100 pb
ATG
UAA
Proteínas secretadas
Señales propias
Señales probadas (gp64, melitina, etc)
Promotores
Immediate early
no usados (usados en
líneas celulares)
Early
poco usados
Late
durante y luego de S! de
ADN, 39K, proteína
básica
Very late
P10, Pol
Más de un gen
simultaneamente
Heterodímeros
Necesidad de coexpresión de enzima
modificante tejido o célula-específica
1 p10 + 1 pol en locus poliedrina
2 p10 + 1 pol en locus poliedrina
1 p10 + 1 pol en locus p10
Fenotipo del virus
Mantener una copia de poliedrina bajo su
promotor o el de p10
Conclusiones básicas
Usar genes sin intrones
Remover secuencias heterólogas en región 5’ no
codificante
Buen contexto para el codón ATG (A a -3)
No son necesarias secuencias para poliA
Secuencias TAAG o CTTA dentro de la secuencia
del gen de interés pueden ser perjudiciales
El uso de codones parece tener poca influencia
Emplear secuencias de secreción comprobadas
Baculovirus vs. otros sistemas
de expresión de proteínas
eucariotas
Rapidez
Trangénicos
Bajo Costo Trangénicos
Glicosidación
Bacterias
Plantas
Células de
mamiferos
Levaduras
Plegamiento
Bacterias
Levaduras
Células de
mamiferos
Plantas
Baculovirus
Baculovirus
Plantas
Baculovirus
Levaduras
Levaduras
Bacterias
Bacterias
Trangénicos
Células de
mamiferos
Baculovirus
Plantas
Trangénicos
Células de
mamiferos
Sistemas de expresión
Baculovirus
Display en cápside o superficie
recombinantes
Gene delivery
Control biológico de plagas
Antiviral/Inmunomodulador
Expresión de proteínas a partir de células infectadas
con el baculovirus Ac3AB1pol+:
clon 1
clon2
clon 1 clon 2 AcNPV MPM
AcNPV MPM
47,5 Kda
47,5 Kda
32,5 kDa
32,5 kDa
25 kDa
Tinción con azul
de Coomassie
poliedrina
3AB1
3AB1
25 kDa
Western blot
Reconocimiento de la proteína no estructural 3AB1
por sueros de animales infectados con VFA
Sueros bovinos
Sueros positivos
infectados VFA
Sueros bovinos
VFA
Sueros negativos
negativos VFA
A
C
Sueros
Sueros
bovinos
vacunados
vacunados
contra VFA
O
Western blot de extractos de
células infectadas
ELISA para diferenciar animales vacunados
de infectados con FMDV
Producción de VLPs de rotavirus
(coexpresión de VP2 y VP6) en larvas y
células
Display de la glicoproteína gD de BHV-1 en
la superficie de baculovirus
AcSup-gD
• Exposición en sup. de gp64-gD
• Competencia por el receptor celular:
plegamiento similar a la proteína nativa
• Inducción de Ac seroneutralizantes
gD
Microscopía electrónica
y marcación (específica
para gD) con oro
Display de OVA en cápside
vp39
vp39OVA
Se agrega una copia extra de
vp39 fusionada a la secuencia
del antígeno OVA.
Los BV que transportan OVA en
la cápside son eficientemente
internalizados por DCs y
presentan OVA en la vía MHC I
Molinari et al. 2011
Los BV inducen
maduración de BMDCs
Molinari et al. 2011
BV-OVA induce activación
de células CD8 T
Molinari et al. 2011
Respuesta CTL anti-OVA en
ratones inyectados con BV-OVA
Molinari et al. 2011
B
V
O
VA
C
ap
N
V
O
VA
ap
SD
C
Su
p
B
V
O
eu
VA
tr
al
C
A
iz
G
ad
o
co
n
V1
B
V
O
VA
O
VA
B
V
B
V
B
% specific lysis
(in vivo killing)
Sup vs Cap vs Transd
100
Transd
75
50
25
0
Cap
SD
Molinari et al. 2011
La respuesta citotóxica protege
contra la implantación de tumores
Molinari et al. 2011
Respuesta inmune innata de
ratones inyectados con BV
Abe et al. 2005
Respuesta inmune innata de
ratones inyectados con BV
Molinari et al. 2011
Transducción de células de mamífero
BHK (uv) A11 moi180
Efecto antiviral
Muchas gracias