Teórica CSK 2016-seg parte.pdf

• Hay regulación a nivel actividad GTPasa de
la beta-tubulina?
GPCRs y proteínas G triméricas
Schappi et al., BBA 2014
Citoesqueleto (CSK) y morfología celular
Microfilamentos (8 nm): polímeros
bicatenarios de actina, forman
cordones lineales y arreglos “geles”
bi- o tri dimensionales.
-definen la morfología superficie
celular (filopodios, lamelipodios)
-pueden estar anclados a la
membrana plasmática.
Microtúbulos (25 nm): cilindros (13
cadenas) de a y b tubulina. Más rígidos
que los microfilamentos con un extremo
asociado a un centrosoma (MTOC:
centro organizador de microtúbulos)
-definen la forma celular global
Filamentos intermedios (10 nm):
proteínas fibrosas que proporcionan
resistencia mecánica a la célula.
Suelen estar anclados a la membrana
plasmática.
Citoesqueleto (CSK) y organización intracelular
Interacción CSK -I. organelas con membrana
- II. maquinaria traduccional
ER
mitocondria
Golgi
mitocondria
lisosomas
mitocondria
mitocondria
microtúbulos
Cos-7 o/n anti-CSK drugs
nocodazol
Golgi
Microtubulos
Distintas organelas están asociadas al CSK
•distribución en el citoplasma (homogénea o no)
•herencia durante división celular
Microtúbulos (MT) y microfilamentos (MF),
según tipo celular
.ER, Golgi: MT
.herencia de cloroplastos: MF
.distribuciòn de mitocondrias: MT en eucatiotas superiores
.distribucion y mov de mitocondrias en levaduras: MF (“cables” de actina)
II-Maquinaria traduccional
circa MCMLXX
Extracción detergentes
SOLUBLE
no-iónicos (TX-100
0.01-0.1%,1-10 min) (90 % proteína
celular)
CITOESQUELETO
75 % total polyA RNA + ribosomas
RELEVANCIA FUNCIONAL???
(SUGERIR EXPERIMENTOS!!!)
II-Maquinaria traduccional
circa MCMLXX
Extracción detergentes
SOLUBLE
no-iónicos (TX-100
0.01-0.1%,1-10 min) (90 % proteína
celular)
CITOESQUELETO
75 % total polyA RNA + ribosomas
-síntesis de proteínas es dependiente de la integridad de los MICROFILAMENTOS (Penman, 1986)
Citoesqueleto (CSK) y adhesión celular
ACTINA
TIAR
control
cytochalysin B
Control
MF:
MT:
OK
OK
Cyto B
caput!
OK
Colchicine
OK
caput!
Los MF contribuyen a la adhesión a la matriz
extracelular (ECM): adhesion focal
Adhesion focal en migración celular
1 min
5 min
10 min
-Adhesion naciente: “fija” el avance de la membrana
-adhesión focal: permite movimiento contráctil
Microfilamentos y uniones entre células (uniones adherentes)
MF de células
adjacentes
conectado
(cinturón de
adhesión)
Permite la
coordinación del
movimiento de
las células en un
tejido y cambios
morfológicos (ej:
invaginación de
un epitelio)
Filamentos intermedios (keratina) se anclan a
desmosomas y semidesmosomas
El CSK en uniones celulares:
tipo de unión
proteína de membrana
involucrada en la adhesión
ligando
(extracelular)
proteína ancladora
(intracelular)
tipo de filamento
adherente
(célula-célula)
cadherina
cadherina
(en la otra célula)
alfa y beta cateninas
vinculina
alfa –actinina
placoglobina
(gama-catenina)
MICROFILAMENTOS
Desmosoma
(célula-célula)
cadherinas
desmogleins
y otras
desmoplakinas
placoglobina
FILAMENTOS
INTERMEDIOS
Adhesión
focal (ECM)
integrinas
ECM
talina, vinculina,
alfa-actinina
filamina
MICROFILAMENTOS
Hemidesmosoma
(ECM)
integrinas
ECM
plectina, BP230
FILAMENTOS
INTERMEDIOS
Interacciones de microfilamentos y filamentos
intermedios con la membrana plasmática:
-colabora en la señalización intracelular
-coordina el CSK de distintas células
-contribuye a la polaridad de la membrana (asimetrías en
la composición de lípidos y proteínas)
-brinda soporte mecánico a uniones celulares
Regulación del citoesqueleto (dinámica y
composición):
1. Proteínas asociadas al citoesqueleto:
MAPs (Microtubule Associated Proteins)
ABPs/FAPs (Actin /Filament Associated Proteins)
IFAPs (Intermediate Filament Associated Proteins)
2. Modificaciones post-traduccionales de actina, tubulina y
componentes de filamentos intermedios
Proteínas asociadas al citoesqueleto:
ABPs
MAPs
IFAPs: -conexión IF con núcleo y membrana plasmática
-entrecruzamiento de IF (keratinas por filaggrin)
-resistencia mecánica: importante en tejidos,
Permiten coordinación de los distintos sistemas de fibrillas
(plakinas une FI a MT y MF)
MAPS: Microtubule Asociated Proteins:
Co-purifican con MT polimerizados in vitro
Hay MAPs que “revisten” la superficie del MT
MAP1A
MAP1B
MAP2 a
POLARIDAD
b
NEURONAL
c
Tau
MAPs que controlan estabilidad de los MTs:
Clip 170 (favorece rescate)
EB1, EB3, APCs: unen extremo + y modulan crecimiento
STOP (Stable Tubule Only) (estabiliza)
Stathmin (aumenta catástrofes)
Kiensinas específicas (KIFs) que depolimerizan
MAPs controlan estabilidad
CLIP 170 (cytoplasmic linker protein)
(KIF)
KIFs especìficas (KIF:
familia de kinesinas)
-Interior celular: crecimiento sostenido
-periferia: crecimiento y depolimerización intermitentes
alfa, beta, gama, delta tubulina
beta
y variantes de éstas.
C-terminal expuesto en la superficie
del MT
alfa
Modificaciones post-traduccionales (PTMs) de tubulinas
•De-tyrosinación reversible C-terminal de alfa tub (Caputo, BBRC 1974)
marca estabilidad (no es causa, sino consecuencia de)
Pierde tirosina el MT, se re-tirosina el dímero por acciòn de Tubulin Tyrosin Ligase
(TTL) (mas importante en SNC, no en otros tejidos)
•MT estables están detirosinados.
•MT tyrosinados unen CLIP170
•MT detyrosinados unen Kinesina 1
Δ2 Tubulin: pierde también glutámico C-terminal, no reversible, específico de neuronas
Modificaciones post-traduccionales de tubulinas
•De-tyrosinación reversible C-terminal de alfa tub (Caputo, BBRC 1974)
marca estabilidad (no es causa, sino consecuencia de)
Pierde tirosina el MT, se re-tirosina el dímero por acciòn de Tubulin Tyrosin Ligase
(TTL) (mas importante en SNC, no en otros tejidos)
•MT estables están detirosinados.
•MT tyrosinados unen CLIP170
•MT detyrosinados unen Kinesina 1
•Poliglutamilación: adición de 1-6 ácido glutámico en C-terminal de alfa1A
tub(Glu445) y beta3 tub(Glu438).
Específica de SNC (50% està polyGlutamilada!!!). PolyGlu-T interactúa con
MAPs y kinesina dependiendo de la longitud. Binding de Tau es óptimo con 3E.
Modificaciones post-traduccionales de tubulinas
•De-tyrosinación reversible C-terminal de alfa tub (Caputo, BBRC 1974)
marca estabilidad (no es causa, sino consecuencia de)
Pierde tirosina el MT, se re-tirosina el dímero por acciòn de Tubulin Tyrosin Ligase
(TTL) (mas importante en SNC, no en otros tejidos)
•MT estables están detirosinados.
•MT tyrosinados unen CLIP170
•MT detyrosinados unen Kinesina 1
•acetilación reversible de Lys 40 de alfa tub (lumen)(ausente en beta tub)
marca estabilidad (no es causa, sino consecuencia de)
(acMT unen kinesina 1)
•Poliglutamilación: adición de 1-6 ácido glutámico en C-terminal de alfa1A
tub(Glu445) y beta3 tub(Glu438).
Específica de SNC (50% està polyGlutamilada!!!). PolyGlu-T interactúa con
MAPs y kinesina dependiendo de la longitud. Binding de Tau es óptimo con 3E.
Primer E: gama carboxilo,
siguientes: alfa carboxilo
(TTL-like, 14 genes)
-Glutamilación en alfa precede a modific en beta,
con o sin Tyr
-Distribución diferencial en axón y dendritas
Fukushima et al., J Neurochem 2009
Acetilación:
-Enriquecida en la región proximal del axón
-presente en neurita destinada a axón
-inhibicón de HDAC6: estimula transporte por kinesina 1
Selvaraj B T et al. J Cell Biol 2012;199:437-451
Las PTMs muestran distinta distribución subcelular
Axón: AcTub/TyrTub (cantidad
de acetilada relativa a tirosinada)
Fukushima et al., J Neurochem 2009
Modificaciones post-traduccionales (PTMs) de actina
Arginilación
N-acetilación
3 metil histidina (His 73)
fosforilación
OXIDACIÔN catalìtica de Metionina (SEMINARIO!!!)
Arginilación de beta-actina:
N-acetilación permite arginilación en Asp3 (40 % in vivo)
-no afecta estabilidad
-afecta polimerización: sin Arg forma agregados
filamentosos, lamelipodios defectuosos
Modelo molecular:
Cargas positivias voluminosas de arg evitan agregación,
Permite formación de una red relajada
Karakozova et al., , Science 2006
MICROFILAMENTOS
-haces (fibras de estrés),
-estructuras bidimensionales, geles tridimensionales,
-filamentos entrecruzados
fibras de estrés
(contractiles,
antiparalelos)
(fibroblasto-falloidina)
50 um
Proteínas de unión a actina (...60...100…) CH domains (calponin homology)
SPECTRINA: Redes corticales,
anclada a membrana, union a F.I.
FIMBRINA
Microvellosidades
Cables de actina
ACTININA
Filopodios,
lamelipodios,
Fibras de stress,
FILAMINA
Filopodios,
pseudopodios
cortex
Fibras de estres
(estabilza filamentos ramificados por ARP2/3)
haz antiparalelo
contractil
haz paralelo
no contractil
STORM: microscopía óptica de reconstrucción estocástica
Resolución STORM: 10-20 nm (como se compara con el grosor de un microfilamento?
Resolución confocal: 200 -500 nm
Tamaños promedio:
membrana plasmática: 4-10 nm
Prot globulares: 2-8 nm
Ribosoma: 10-20 nm
Intervalo: 182 +/- 16 nm
Xu et al., Science 2013. “Actin, spectrin, and associated proteins
form a periodic cytoskeletal structure in axons.”
-Canal de Sodio (potenciales de acción)
posicionado por ankyrin G.
-Resistencia mecánica: C. Elegans
mutantes en B-espectrina:
axones quebradizos en animales en
movimiento
Regulación del citoesqueleto.
Microfilamentos se regulan fundamentalmente por :
-polimerización/ depolimerización , en respuesta a señales extracelulares
-Proteínas de unión a F-actina (entrecruzan, arman haces, estrictamente
reguladas)
- modificaciones post-traduccionales
-Regulación a nivel transcripcional es poco importante.
Microtúbulos se regulan mediante:
-inestabilidad dinámica (elongación y acortamiento del extremo +), distinta
en distintas regiones celulares.
-proteínas de unión a microtúbulos, que se unen lateralmente. Distintos tipos
celulares presentan distintos tipo de MAPs. MAPs son reguladas fuertemente
(ej: mitosis, varias kinasas controlan la interacción de MAPs a MT afectando
su estabilidad)
-modificaciones post-traduccionales: son consecuencia de la estabilidad y
afectan transporte por motores moleculares y binding de MAPs
Filamentos intermedios son poco regulados, pero son muy variables de
célula a célula. Regulación: IFAP y Fosforilación de cabezas globulares.
… y la gama tubulina en la zona
apical???