Teórica de apoptosis.pdf

Apoptosis (vs supervivencia - respuesta a estrés celular )
Año 2016
!
Apoptosis: muerte celular programada
-en 1972 Kerr et al. describen un tipo de muerte celular
distinto de necrosis: apoptosis
- Hipócrates de Cos (460-370 AC) describe las gangrenas
asociadas a dislocaciones.
a p o p t w s i s : “desprendimiento de los músculos de los
huesos”
Cuando es necesario que las células decidan “suicidarse”?
-en adultos, para mantener tamaño de los tejidos
-durante el desarrollo, para permitir cambios morfológicos
Daño en el DNA
alteraciones en ciclo celular
estrés celular letal
(fuerza o duración)
NECROSIS
vs
APOPTOSIS
respuesta celular a
una agresión aguda:
diversidad de estímulos:
-la célula se “hincha
y explota”
-colapsa el citoesqueleto
-inflamación local
daño a otras células
la célula se encoge y condensa
-se disuelve la envoltura
nuclear
-se fragmenta el DNA
-la membrana celular cambia
indicando a las células vecinas
que puede ser fagocitada
-no hay daño a células vecinas
-reciclado de componentes
Las moléculas efectoras de la apoptosis son las
CASPASAS
Cisteína en el sitio activo
ASPártico es el sitio que atacan con su actividad de
proteASA
Basal: procaspasas (cerca
de 20) inactivas
Apoptosis: i) las caspasas
efectoras (3, 6 , 7)
son activadas por
proteólisis mediada por
caspasas iniciadoras (2,
4, 8,
9, 10, 12)
Cómo se activan las caspasas?
1. mecanismo de activación extrínseco
(receptores de membrana)
2. mecanismo de activación intrínseco
(mitocondria)
puede actuar en forma sinérgica con (1)
Familia Bcl-2 (B-cell linfoma-2) (25 genes):
-Bcl-2 homology (BH) domains (BH1, BH2, BH3 and BH4),
- dominos transmembrana (MOM, ER).
- Forman homo-heterodímeros/oligómeros y se activan/inhiben mutuamente
Mecanismo de Activación Intrínseco
Se activa por daño o disfunciones celulares
Ejemplos?
Apoptosis disparada por daño al DNA
UV
Kinasas “sensoras”
(ATM ; ATR)
Kinasas “efectoras”
(CHK1; CHK2)
p53
Factor
transcripcional
genes
pro-apoptóticos
de la familia Bax
Apoptosis y arresto de ciclo celular por daño al DNA
UV
Kinasas “sensoras”
(ATM ; ATR)
Kinasas “efectoras”
(CHK1; CHK2)
p53
1) p21: genes
de arresto
ciclo celular
Factor
transcripcional
2) genes
pro-apoptóticos
de la familia Bax
Apoptosis y arresto de ciclo celular por daño al DNA
UV
p53
Arresto ciclo
celular
CANCER
Apoptosis
mecanismo de activación intrínseco (mitocondria)
Paso 1: liberación de citocromo C
Proteínas de la
familia de BCL-2
Bax (asociada a
organelas), Bak (interior
mit): traslocación a la
MOM: poros!!!
BCL2: protege
membrana mitocondrial
Citocromo C
Apoptotic
Paso 2: activación de caspasa iniciadora 9
Protease
Activating
APOPTOSOMA
Factor (APAF-1)
Paso 3: amplificación
APOPTOSIS
1. mecanimo de activación extrínseco
Ligandos específicos (solubles o no) se
unen a receptores de membrana de la
familia del receptor de TNF
(superfamilia de receptores “death”,
50 miembros)
Ejemplos: FAS (CD95) y FASL
Trail-R y Trail;
TNFR1 y TNF
Activación de Receptor
DEATH
por ligando específico
Receptor oligomeriza
y recluta
proteínas adaptadoras
FADD (Fas Associated Death Domain)
se une al domino death del receptor
Unión de Receptor
DEATH
por ligando específico
Receptor oligomeriza
y recluta
proteínas adaptadoras
DISC: Death Inducing Signaling
Complex
Procaspasa 8
(iniciadora) se encuentra
inactiva
Unión de Receptor
DEATH
por ligando específico
Receptor oligomeriza
y recluta
proteínas adaptadoras
DISC: Death Inducing Signaling
Complex
FADD une moléculas
de procaspasa 8,
agregándolas.
Unión de Receptor
DEATH
por ligando específico
Receptor oligomeriza
y recluta
proteínas adaptadoras
DISC: Death Inducing Signaling
Complex
La moléculas de
procaspasa 8 se
activan por proteólisis
Unión de Receptor
DEATH
por ligando específico
Receptor oligomeriza
y recluta
proteínas adaptadoras
DISC: Death Inducing Signaling
Complex
Caspasa 8 activada
actúa sobre pro-caspasa 3
(efectora)
Unión de Receptor
DEATH
por ligando específico
Receptor oligomeriza
y recluta
proteínas adaptadoras
DISC: Death Inducing Signaling
Complex
La Caspasa 8
activada cliva y
activa caspasa 3
Amplificación
Unión de Receptor
DEATH por ligando específico
(TNF, FasL, etc)
Receptor oligomeriza
y recluta
proteínas adaptadoras
DISC: Death Inducing Signaling
Complex
Se dispara la etapa efectora de la
apoptosis:
Ej: Caspasa 3 actúa sobre iCAD
(Inhidor de Caspase- Activated DNase)
Hay interacción entre la vía
intrínseca y la extrínseca ?
Fas + FASL
Proscaspasa 8
caspasa 8
APOPTOSIS
(se inserta en MOM)
Bid
tBid (clivage y reclutamiento en MOM)
Bax
Bax oligomérico
liberación de Citocromo C
activación caspasa 9
APOPTOSIS
Cómo mantener “silenciados” los factores apoptóticos?
Pro-Caspasas:
AIPs (Familia
Apoptosis Inhibitor Protein)
Bad, Bax, etc:
miembros anti-apoptóticos
de la familia bcl-2
XIAP y IAP/AIP (inhibitor of apoptosis)
(familia de prot, pueden ser inducidas por virus)
-unen procaspasas e impiden su activación
-unen caspasas e impiden su actividad
-HSPs: muchas de las proteínas inducidas por estrés son antiapoptóticas.
-La vía intrínseca puede ser activada o silenciada por estímulos
externos (varias vías de señalización)
-la mitocondria y el ER sensan daño y señalizan apoptosis
-hay señalización cruzada entre las vías externa e interna
Qué cambios se observan en una
célula apoptótica?
La amplificación de la respuesta
lleva a altos niveles de caspasas
efectoras. En la fase efectora, la
apoptosis es irreversible y se
observan cambios morfológicos y
moleculares
RUPTURA del ADN
Caspasa 3 cliva
ICAD,
Se dispara la
fragmentación
del ADN
Lesiones en ADN activan PARP: la (auto)poly-ADP
ribosilación de PARP (múltiples cadenas de polyADPribosa)
alertan la maquinaria de reparación de ADN
Caspasas clivan PARP e impiden la reparación
Cómo visualizar ruptura del ADN?
“escaleras” de escalones de 200 nt, tamaño del nucleosoma
TUNEL:
Terminal deoxynucleotidyl transferase
dUTP Nick End Labeling
Apoptosis durante la metamorfosis en insectos
La membrana plasmática es asimétrica
intravesicular / espacio extracelular
citosol
-glicolípidos
-fosfatidilcolina
-esfingomielina
-fosfatidilserina (carga -)
-fosfatidiletanolamina
difusión lateral
cambio de lado
“flip-flop”
fexión
rotación
difusión lateral
X
cambio de lado
“flip-flop”
fexión
rotación
La membrana plasmática es asimétrica
espacio extracelular
-glicolípidos
-fosfatidilcolina
-esfingomielina
-fosfatidilserina (carga -)
-fosfatidilserina (carga -)
-fosfatidiletanolamina
citosol
Apoptosis: fosfatidilserina se expone en el lado
extracelular (activación transportador)
MW (kD)
10
Molécula
FUNCION ???
Hsp10
Constitutivas, abundantes
Hsp27 mantiene entramado de microfilamentos de actina
Alfa-beta crystallin interfiere activación de caspasa 3. Secuestra
factores apoptóticos Bax and Bcl
20-30
10 especies en
mamif, ej Hsp27
40
Hsp40
60
Hsp60
(Importación a mitocondrias y cloroplastos)
Mantiene integridad de membranan mitocondrial. También es proapoptótica! (se une y contribuye a activar pro-caspasa3)
70
Hsc70, Hsp71,
Hsp72, Grp78,
BiP
Plegado de proteínas. Importación a mitoc y cloroplastos
Siempre es inducida por estrés. Fiebre. Manipuleo de muestras in
vivo!!! Antiapoptótica: Activa NFKb (anti apoptótico), inhibe JNK
(SAPKS)
Impide traslocación de Bax a la mitocondria, libetración de citocromo
c, formación del apoptosoma, acticavión de pro-caspasas iniciadoras.
Mantiene integridad de membrana lisosolam:impide liberación
catepsina
(………..también tiene rol pro-apoptótico)
90
Hsp90, Grp94
La mas abundante en condiciones basales. (receptores
esteroides y factores de transcripción)
Antiapoptótica: varios pasos en la activación de NFKB
(activación de IKK=inhibición de IKB)
100
Hsp104, Hsp110
Tolerancia a temperaturas extremas
Balance entre dos respuestas antagónicas:
Stress
response
Apoptosis
-HSPs: hsp 70 inhibe APAF, caspasas, AIF, etc, etc.
(Algunas HSPs tienen rol pro-apoptótico)
-Regulación traduccional: IRES y uORF
traducen genes anti y pro-apoptóticos
Balance entre dos respuestas antagónicas:
Supervivencia
Muerte
Bajos niveles de caspasa 3/7 pueden NO terminar en apoptosis
supervivencia vs apoptosis durante
ER-Stress
(Peter Walter)
Activación de PERK, IRE 1
ATF4 (transcription factor)
IRE1: endonucleasa que
inicia el splicing
citoplasmático de
XBP1/HAC1.
IRE1 media la
degradación vía RIDD
(regulated Ire1dependent decay): se
degradan transcriptos
traducidos en el ER.
Activación transcripcional
de BIM (BCL2 pro-apop)
XBP1 /HAC1: transcription factor :
el mRNA “no-spliceado” está en el citosol
La actividad endonucleasa de IRE1 se activa (al igual
que en PERK) por liberación de BIP y
autofosforilación en trans. Formación de Ire-1 foci
(seminario!!!)
Activación de IRE1, PERK y ATF6
ATF6: tercer rama
de la respuesta a
proteínas mal
plegadas.
ATF4 (transcription factor)
Se activa cuando
BIP la libera (llega
hasta Golgi y se
cliva liberando p50
al citosol)
p50 es un factor
transcripcional
P50 y XBP1/HAC1 controlan
+ y - varios genes
IRE-1 y PERK: como contribuyen a la supervivencia y a la
apoptosis disparadas por estrés de retículo
PERK quimera activable por
AP20187
(mediante dimerización de
dominios KFBP)
(P. Walter Plos One 2009)
IRE-1 activable por 1NM-PP1
tg, thapsigargin: inhibe CERCA (bomba de Calcio del ER), desregulando Ca en el ER
y afectando chaperonas (Calnexina, calreticulina). Esto induce estrés de retículo.
(P. Walter Plos One 2009)
Activación prolongada de
PERK induce muerte celular
(P. Walter Plos One 2009)
Activación prolongada de
PERK induce apoptosis
PERK permite traducción de ATF4, factor de transcripción de CHOP:
CHOP es un factor transcripcional que permite la expresión de BIM
(miembro pro-apop de la familia de BCL2) (transcripto y proteína
inestable)
TRAF2
TRAF2: requerido para la activación del receptor de TNF alfa,
(vía extrínseca)
TRAF2
-TRAF2 también participa en la apoptosis disparada por estrés de retículo
Se asocia al ER vía el dominio citosólico de IRE1 (sensa ER-stress):
-une y oligomeriza caspasa 12 (se cliva y activa)
UPR
apoptosis
Balance entre dos respuestas antagónicas:
Stress
response
Apoptosis
-HSPs: hsp 70 inhibe APAF, caspasas, AIF, etc, etc.
(Algunas HSPs tienen rol pro-apoptótico)
-Regulación traduccional: IRES y uORF
traducen genes anti y pro-apoptóticos
-SGs: secuestro de factores pro-apoptóticos
Proteínas pro-apoptóticas que van a SGs: TRAF2, otras
Críticas a este tipo de experimentos ????????
Ar
HS
FCCP
normal
Infección
viral
respuesta
antiviral
(interferón, etc)
Los SGs son
antivirales
(varios virus
inhiben su
formación)
Los avSGs son
una plataforma
para la respuesta
antiviral
Yoo JS, Takahasi K, Ng CS, Ouda R, Onomoto K, et al. (2014) DHX36 Enhances RIG-I Signaling by Facilitating PKR-Mediated Antiviral Stress
Granule Formation. PLoS Pathog 10(3): e1004012. doi:10.1371/journal.ppat.1004012
http://journals.plos.org/plospathogens/article?id=info:doi/10.1371/journal.ppat.1004012
Cuerpos de silenciamiento:
~ “gotas líquidas” que condensan
en el citosol
“Getting RNA and Protein in Phase”
Weber & Brangwynne, Cell 2012
Los SGs están relacionados con agregados de proteínas
anómalas involucrados en neurodegeneración
Mutantes patogénicas de TDP43 or FUS/TLS inducen SGs
TIAR
TDP43
Benseñor et al., Curr Chem Biol 2011
Thomas et al, Cell Signal 2011
Diferencias y similitudes entre SGs y agregados proteicos
SGs
•Inducidos por diversos tipos
de estrés (ISR)
•Inducidos por inhibición de
proteosoma o autofagia
•Agregación de PRDs
modulada por HSP70
•Proteínas ubiquitinadas
•O-glicosilación
•Requieren dineina
•Altamente dinámicos
•Reversibles
•acompañan la normal ISR,
son protectivos
Agregados proteicos / agresomas
•Presentes en diversas patologìas
(ER-stress y/o OE)
•Su disolución requiere degradación
por proteosoma o autogafia
•Agregación proteínas “mal plegadas”
modulada por chaperonas
•Contienen ubiquitina
•O-glicosilación (ej. Tau)
•Requieren dineina
•Son muy poco dinámicos
•Irreversibles
•Presentes en condiciones patológicas
(protectivos o patogénicos?)
Se investiga actualmente la relevancia funcional (mecanismos de
protección celular) y la dinámica de formación y disolución de SGs
RNAi screen: 37 novel regulators of SG dynamics in
Drosophila S2R+ cells
Z-Score > 2
Our screen
mammalian
130
fly
2
33
2
3
Ohn et al.,
Nat Cell Biol 2008
Score = SGs per celldsRNA / SGs per cellcontrol
Screens independientes
identificaron nuevos pathways
Wippich et al.,
Cell 2013
yeast
101
Buchan et al.,
Cell 2013