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GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS
INGENIERÍA GENÉTICA 2016
Estudio de una vía de señalización de MAPK
a nivel poblacional y de células individuales
Equipo docente
Lic. Daiana Sapochnik
Lic. Gustavo Vasen
Lic. Nicolás Nieto Moreno
Dra. Luciana Giono
Cronograma
2
Introducción
El objetivo de este trabajo práctico es estudiar una vía de señalización
prototípica de MAP quinasas (Mitogen-Activated Protein Kinase, MAPK) tanto a nivel
de la respuesta promedio de la población como de células individuales. Como
modelo de trabajo se trabajará con la levadura Saccharomyces cerevisiae dado que
presenta varias ventajas a la hora de trabajar en la mesada de un aula de docencia:
tiempos cortos de trabajo, fácil obtención de cepas genéticamente modificadas,
condiciones de crecimiento y manipulación sencillas. S. cerevisiae presenta cinco
cascadas de MAPK. En particular, estudiaremos la vía que se activa en respuesta a
alta osmolaridad, cuya MAPK es Hog1, homóloga a p38 en mamíferos. Frente a un
shock hiperosmótico, Hog1 se activa por fosforilación, se trasloca al núcleo y
promueve la transcripción de genes necesarios para re-establecer el volumen celular
y adaptarse al nuevo medio extracelular.
La respuesta a alta osmolaridad en S. cerevisiae.
Las células presentan una determinada presión de turgencia. En el caso de las
levaduras, esta presión la ejerce la membrana plasmática contra la pared celular.
Esta presión es muy útil para las levaduras, que la usan como ayuda para poder
crecer. Cuando la célula flexibiliza la pared en la zona de crecimiento, la presión
ayuda a su expansión en esa zona.
El aumento de la osmolaridad externa causa la salida de agua y la
consiguiente caída en la presión de turgencia (Pτ). Para adaptarse a esta nueva
situación, las levaduras activan una vía de respuesta que se conoce como HOG (High
Osmolarity Glycerol).
La respuesta consiste en aumentar la producción de glicerol (que es muy
poco permeable a través de la membrana plasmática) y en reducir su escape hacia
afuera de la célula cerrando el canal Fps1. El consecuente aumento de la
concentración de glicerol intracelular hace que aumente la osmolaridad interna y
que, por consiguiente, el agua vuelva a entrar a la célula y ésta recupere la turgencia
normal (Figura 1A). A su vez, juntamente con esta respuesta rápida, se induce la
expresión de un set de proteínas necesarias para la adaptación a este nuevo
ambiente.
3
Figura 1. A, Respuesta fisiológica de una levadura frente a un shock hiperosmótico.
B, Vía de señalización de respuesta a alta osmolaridad.
Como se puede ver en la Figura 1B, existen dos ramas de activación de la
cascada: la rama de Sho1 y la de Sln1. En ambas, sensores de membrana activan una
cascada de MAPK. Las MAPKKK son respectivamente Ste11 y Ssk2. En el siguiente
paso de la cascada, Pbs2, la MAPKK y también proteína de andamiaje del sistema,
integra la información de ambos caminos y activa finalmente a Hog1, la MAPK. Hog1
fosforilado ejecuta la respuesta que consiste en: activar las enzimas de síntesis de
glicerol presentes, reducir la pérdida de glicerol (cerrando canales como Fps1) y, a su
vez, inducir la expresión tanto de enzimas como de canales relacionados con la
síntesis y entrada de glicerol (Figura 3).
4
Figura 3. Respuestas ejecutadas por Hog1 frente a un aumento en la osmolaridad
extracelular. Pττ, presión de turgencia; DHAP, dihidroxiacetona fosfato.
La biología de sistemas postula que con ayuda de modelos matemáticos se
pueden capturar y “explicar” los comportamientos dinámicos que exhiben los
procesos biológicos, en los que en general participan grupos relativamente
numerosos de componentes. Por ello, requiere de una combinación de matemática,
computación y observación experimental cuantitativa. En particular, la filosofía de
esta disciplina muchas veces implica pensar a las células como sistemas que
responden frente a un INPUT, ofreciendo una variedad de OUTPUTs como resultado,
donde no sólo importa cuáles son estos outputs sino también cuánto se
produce/activa de cada uno. En la respuesta a alta osmolaridad en levaduras, se
puede considerar como INPUT el shock hiperosmótico. ¿Qué posibles OUTPUTs se
pueden medir y por qué técnica se podría realizar su cuantificación (Tabla 1)?
OUTPUT
Técnica de
cuantificación
Poblacional o
Células
individuales
Microscopía/
Citometria de flujo
Células
individuales
………………………………………………..…
………………………………………………..…
………………………………………………..…
………………………………………………..…
………………………………………………..…
………………………………………………..…
………………………………………………..…
Reducción del volumen celular
Tabla 1. Posibles Outputs de la respuesta a alta osmolaridad.
5
Para un estudio completo de una vía de señalización es clave poder
determinar la variabilidad de la respuesta. No todas la células responden de la
misma manera y no siempre el comportamiento promedio de una población refleja
lo que ocurre en cada célula. En una población, existen diferencias preexistentes
entre los distintos individuos, por ejemplo, el momento en el ciclo celular, el tamaño,
etc. Ésta es una fuente importante de “variabilidad” (entendida como la varianza con
respecto a la media de un posible output) en el comportamiento. Pero, a su vez,
existe otra fuente de variabilidad que se debe a la estocasticidad inherente a los
procesos moleculares que orquestan la respuesta celular (“ruido”). Para determinar
la variabilidad de la respuesta, es importante que el método de medición elegido
para un dado output pueda arrojar valores confiables de cada célula. Por ello, en la
Tabla 1 se pueden clasificar las técnicas según si son aptas para mediciones
poblacionales o de células individuales.
En este trabajo práctico, el objetivo es medir distintos outputs de la vía de
señalización de HOG. Algunos de ellos brindarán información cuantitativa
poblacional y otros, además, información de células individuales. Estos datos podrán
ser utilizados para cuantificar las fuentes de variabilidad en distintos puntos de la
respuesta.
6
1. SEMANA 1: Plásmidos a utilizar
1.1 REPORTERO TRANSCRIPCIONAL
Manejo de plásmidos en la plataforma ApE
El ApE es un editor de secuencias de ADN. Es un software libre (“open source”). Es
sencillo y bastante versátil.
Se puede bajar desde http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/ o del
campus de IG.
Formatos: el formato “universal” de plásmidos es genebank (.gb o gbk). Todos los
editores de plásmidos lo leen. Además de la secuencia, tienen identificados los
“features” presentes.
Secuencias de uso común se pueden generalmente encontrar en formato genebank
del BLAST o de repositorios como www.addgene.org.
LOCUS
2014
pFA6a_YFP_HIS3MX
FEATURES
gene
4729 bp ds-DNA
circular
15-SEP-
Location/Qualifiers
1406..2059
/note="HIS5"
/label=HIS5 (S.pombe)
/ApEinfo_fwdcolor=#008040
/ApEinfo_revcolor=green
/ApEinfo_graphicformat=arrow_data {{0 1 2 0 0 -1} {} 0}
width 10 offset 0
rep_origin
complement(2625..3307)
/label=ColE1 origin
/ApEinfo_fwdcolor=gray50
/ApEinfo_revcolor=gray50
/ApEinfo_graphicformat=arrow_data {{0 1 2 0 0 -1} {} 0}
width 10 offset 0
CDS
complement(3405..4064)
/label=AmpR
/ApEinfo_fwdcolor=yellow
/ApEinfo_revcolor=#ff8000
/ApEinfo_graphicformat=arrow_data {{0 1 2 0 0 -1} {} 0}
width 10 offset 0
ORIGIN
7
1 GAACGCGGCC GCCAGCTGAA GCTTCGTACG CTGCAGGTCG ACGGATCCCC GGGTTAATTA
61 ACATGAGTAA AGGAGAAGAA CTTTTCACTG GAGTTGTCCC AATTCTTGTT GAATTAGATG
121 GTGATGTTAA TGGGCACAAA TTTTCTGTCA GTGGAGAGGG TGAAGGTGAT GCAACATACG
(...)
4681 TAATACATAA CCTTATGTAT CATACACATA CGATTTAGGT GACACTATA
//
…
Ejercicio 1: Anotar un plásmido en blanco
Descarguen la secuencia del plásmido “Promotor STL1-TdTomato LEU2.ape”
El esquema del plásmido se encuentra en la Figura 1. El ejercicio consiste en
encontrar las distintas partes en la secuencia de ADN. El objetivo final es identificar
con qué enzima de restricción conviene cortar para integrar el plásmido en un
locus determinado.
Figura1. Plásmido Promotor-STL1-TdTomato LEU2.
El programa viene con una pequeña biblioteca de secuencias reconocidas
(“features”). Uno puede incorporar a esta biblioteca nuevas “features” para empezar
a personalizar el programa.
1) Vayan a Features>Annotate features using library o presionen Control+K.
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Se anotan elementos comunes como orígenes de replicación y sitios de unión a
primers universales con su Nombre, Dirección (>>>>, en la hebra cuya secuencia
figura, <<<<<, en la que no figura), Tipo de “feature” y su posición en bp.
2) Generen un mapa del plásmido a medida que lo van anotando en
Enzyme>Graphic Map o Control+Y o con el botón correspondiente.
3) Ahora encuentren el marcador, LEU2, y la proteína fluorescente, tdTomato. Para
ello tienen que encontrar ORFs lo suficientemente grandes. Vayan a ORFs>Search
Strands>Both, luego pongan el cursor al inicio de la secuencia y vayan ORFs>Find
Next… o Control+>.
Cuando encuentren un ORF lo suficientemente largo y en la orientación correcta
según el esquema de la Figura 1, copien la secuencia o su reverso-complementario
(Edit>copy o copy reverse-complement, o right-click, etc).
a) En el BLAST directamente: busquen la secuencia en el BLAST
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). usando el programa Nucleotide Blast
(blastn, en base de datos nucleotídica) o el blastx (que traduce la secuencia y busca
en la base de datos de proteínas).
b) Con el BLAST desde ApE: apretar Control+0 (cero) para abrir la consola. Ir a
Tools>Blast sequences at NCBI…, clickear la opción Selection Onl(y) y elegir el
programa a usar (blastn o blastx)
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4) Una vez identificado, anótenlo como una nueva “feature”, Feature>New Feature
o Control+. (punto). Elijan el color, nombre y tipo. Para que quede registrado en la
bilblioteca tienen que elegir la opción New feature in library.
5) Falta identificar el promotor. En este caso, ya sabemos que está 972 bp río arriba
del ATG de tdTomato. Pero en una situación desconocida, para encontrar tenemos
que bajar la secuencia del locus STL1 (Hacerlo…)
Ir a http://www.yeastgenome.org/, buscar STL1 y obtener la secuencia de DNA +/1kb. Descargar en formato .fsa y abrir el archivo desde ApE (Guardenlo como STL1
Locus.ape). Busquen el ORF de STL1 y anotenlo, como ya saben hacerlo.
6) Usen la herramienta Tools>Align two sequences… para encontrar la secuencia
compartida entre el plásmido y el locus. Seleccionen los archivos a comparar y denle
OK.
Una vez realizado el alineamiento, seleccionen la parte inicial con 100% de
identidad, cópienla y búsquenla en la secuencia del plásmido (al derecho o en revcom según como esté orientado) con Edit>Find o Control+F. Pueden elegir la opción
Highlight All para que se seleccione. Anoten el promotor.
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7) Por último, necesitamos el mapa de restricción para elegir la enzima a utilizar para
integrar tanto en el locus de STL1 como en el de LEU2. Enzymes>Enzyme Selector o
Control+E. Seleccionen Unique (1) y six cutter (enzimas más comunes) y luego
“Select”. Finalmente, Graphic Map.
Subir el mapa final al campus en la sección Plásmido por grupo.
En el nombre de archivo indicar en número de grupo.
1.2 GENERACIÓN DEL FRAGMENTO DE PCR PARA RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA.
Ejercicio 2: Diseño de primers para fusionar YFP a Hog1.
La estrategia y los plásmidos a utilizar son derivados del paper de Longtine (1998)
(Búsquenlo en el campus).
La estructura de los primers tiene que ser:
40nt de homología
20nt de apareamiento con el
plásmido
Las secuencias de homología tienen que ser:
-Primer Forward: los últimos 40nt de la secuencia codificante de Hog1 sin el codón
STOP.
-Primer Reverse: los 40nt que se encuentran a continuación del codón stop.
Buscar las secuencias en www.yeastgenome.org para SLT1.
Los 20nt de apareamiento los tienen que elegir en el plásmido molde cuyo esquema
se encuentra en la Figura 2.
11
“Cassette” de selección
HIS3MX6
Figura 2. Esquema del plásmido pFA6-YFP-HIS3MX6.
-Tienen que tener 20nt (se pueden sintetizar primers de hasta 60nt por la técnica
común, si no ya es más complicado).
-Las Tm de ambas secuencias deben rondar los 60°C y ser similares entre sí.
La Tm se puede ver directamente en el mismo ApE al seleccionar la secuencia o bien
en https://www.neb.com/tools-and-resources/interactive-tools/tm-calculator donde
se puede seleccionar la polimerasa a utilizar.
-En lo posible la base 3’ tiene que ser una G o una C.
-Verificar que la secuencia de Hog1 y YFP queden en fase. Para ello, usen la
herramienta ORF>Translate…. Resuelvan si quieren o no incorporar un linker de
algunos aminoácidos y cuáles pueden ser.
¿Qué tamaño en pb tiene que tener el producto de PCR?
Subir las secuencias finales (en orientación 5’->3’) al campus en la sección Primers
por grupo. Indicar el número de grupo.
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2. SEMANA 2: PCR y DIGESTIÓN
2.1 PCR.
Para obtener Hog1 fusionado a YFP nos valdremos de la alta eficiencia de
recombinación por homología en levaduras. Al transformar levaduras con un
fragmento de DNA lineal como el que se generó en la sección anterior que presenta
homología con secuencias genómicas, las levaduras recombinan dicho fragmento y
lo incorporan a su genoma. Mediante algún método de selección (ya sea utilizando
una auxotrofía o un antibiótico) se puede aislar clones modificados genéticamente.
Para recombinar YFP en el locus de Hog1 y obtener una proteína de fusión, debemos
obtener un producto de PCR que incluya 40 bp de la secuencia del locus de Hog1 en
los extremos y la proteína YFP completa, utilizando primers como los que diseñaron
en el ejercicio 2 de la clase pasada. Además, dicho producto debe tener el ”cassette”
HIS3MX6 que revierte la auxotrofía de histidina para poder seleccionar levaduras
recombinantes.
Cada grupo realizará la reacción de PCR utilizando como molde el plásmido pFA6aYFP-HIS3MX6.
La composición final de la mix de PCR es la siguiente:
Buffer de PCR 1x, dNTPS 0,2 mM, MgCl 1,5 mM, primers Fw y Rev 0,5 μM cada uno,
Taq 0, 5 U, DNA molde 10 ng. Volumen final 20 μL. Al calcular el volumen de H2O que
deben agregar a la “mix”, recuerden considerar el volumen de DNA molde que
deberán agregar.
Deberán preparar “mix” para 3 tubos: para realizar una reacción con molde, un
control negativo sin molde y un tubo sobrante para compensar la imprecisión de las
pipetas.
“Mix” de PCR
Buffer 10x
dNTPs (2 mM)
MgCl2 (15 mM)
Primer Fw (10 µM)
Primer Rv (10 µM)
Taq (5U/µL)
H 2O
C o Cantfinal
1x
0,2 mM
1,5 mM
0,5 µM
0,5 µM
0,5 U
55.5 M
Plásmido (5 ng/µL)
Total
10 ng
x1 (µ
µL)
x3 (µ
µL)
20 µL
1U de Taq equivale a la cantidad de enzima que incorpora 15nmoles de dNTPs a 75°C
13
Una vez preparada la “mix”, alicuotar en un tubo de PCR el volumen de DNA molde
necesario (y agua en el caso del control negativo). Agregar la mix de PCR a cada
tubo.
El programa de PCR es el siguiente:
5’ 94°C
[20” 94°C
20” 60°C
2´ 72°C]
[ ]x30 ciclos
5’ 72°C
∞ 16°C
Tapa a 105°C
Finalizada la PCR correrán un gel de agarosa 1% para visualizar los productos de
amplificación.
2.2 DIGESTIÓN
Para integrar la proteína fluorescente TdTomato en levaduras por recombinación
homóloga, deberán digerir el plásmido Promotor-STL1-TdTomato-LEU2 para
linealizarlo con las enzimas que eligieron en el punto 7 del ejercicio 1 de la clase
anterior. Algunos grupos integrarán TdTomato en el locus de Stl1, mientras que
otros lo harán en el locus de Leu2.
Deberán preparar una “mix” de digestión que contenga la enzima, en el buffer
correspondiente en concentración 1x y DNA.
“Mix” de digestión
Buffer 10x
Enzima (10 U/µL)
H 2O
C o Cantfinal
1x
2U
55.5 M
Plásmido
200 ng
Total
El protocolo de digestión es el siguiente:
x1 (µ
µL)
20
1. Preparar la mix de digestión.
2. Agregar el DNA a digerir.
3. Incubar 15 minutos a 37°C.
4. Inactivar la enzima de restricción 5 minutos a 65°C
5. Correr 100 ng en un gel de agarosa 1% para visualizar los productos de digestión.
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3. SEMANA 3: TRANSFORMACIÓN
3.1 Cepas a transformar.
Cepa
Cepa parental
Genotipo relevante
ACL 379
W303
ura3 ade2-1 leu2-3,112 trp1-1 his3-11,15 bar1
YLD 3341
ACL379
pSTL1:: pSTL1-YFP-URA3 prm1::Cherry-hphMX4
3.2 PREPARACIÓN DE LEVADURAS COMPETENTES
Cada grupo recibirá un cultivo de 50mL de la cepa ACL 379 o la cepa YLD 3341 luego
del paso 2). Se debe trabajar en esterilidad bajo mechero durante todo el protocolo.
1) A partir de un cultivo ON en YPD, diluir en 50mL YPD a OD600=0,2 en erlenmeyer
de 250mL preferentemente.
2) Crecer a 30°C por 3-4hs hasta OD=0,6-0,8.
3) Transferir a tubo falcon de 50mL y centrifugar 5’ a 3500rpm.
4) Descartar el sobrenadante por volcado y resuspender con 25mL de H2Od estéril.
Vortexear.
5) Centrifugar 5’ a 3500rpm, descartar el sobrenadante y resuspender en 1mL de
LiTE. Transferir a un tubo eppendorf.
6) Centrifugar 20” a máxima, volcar el sobrenadante y resuspender en 300µL de LiTE
(Vf=500µL).
15
3.3 TRANSFORMACIÓN DE LEVADURAS.
1) Hervir ssDNA 5’ y mantener en hielo.
2) Mezclar:
Tubo
1
Reportero STL1
pSTL1-TdTomatoLEU2
DNA
(plásmido
integrativo)
Células
competentes
50ng
YLD 3341
50µL
5µL
ssDNA
2
3
4
Control
viabilidad
Hog1-YFP
Control +
YFP-HIS3MX6
(Producto de
PCR)
pRS413
(plásmido
replicativo)
-
10µL
ACL 379
150µL
15µL
50ng
ACL 379
50µL
5µL
YLD 3341
50µL
-
400µL
400µL
VORTEX
Incubar a 42°C por 45’
Centrifugar 20” a 8000rpm
SC
SC
1000µL
50µL
SC
50µL
VORTEX
PEG 40% en
LiTE
400µL
Resuspender
en
SC
50µL
Incubar 30’ a
30°C
No
1000µL
Sí
No
No
Centrifugar 20” a 8000rpm. Descartar el sobrenadante por volcado.
Resuspender en el volumen residual
Plaquear en
-LU
-H
-H
YPD
3) Incubar 2-7 días a 30°C.
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4. SEMANA 4: Aislamiento de clones.
4.1 EFICIENCIA DE TRANSFORMACIÓN
Calcular la eficiencia de transformación en UFC/µg DNA.
Contar las colonias manualmente o bien usando el OpenCFU (en las compus o en el
campus). Para ellos, se debe sacar una foto a cada placa de transformación.
4.2 AISLAMIENTO
Cada grupo recibirá dos placas donde deberán re-estriar sus clones positivos:
-1 placa –H: para colocar 5 de sus clones de Hog1-YFP de la placa de transformación
correspondiente.
-1 placa SC-Glicerol 2%: para estriar 5 de los clones de pSTL1-TdTomato que
crecieron en la placa de transformación –LU.
Para aislar los clones, con un escarbadientes estéril tocar la parte superior de una
colonia y estriarla en forma de raya o parche en la placa correspondiente. Numerar
los clones en ambas placas.
5. SEMANA 5: “SCREENING”
El “screening” de Hog1-YFP se hará por “Colony PCR” y el de pSTL1-TdTomato por
microscopía.
5.1 SCREENING Hog1-YFP.
1. Agregar a cada tubo 50µL de NaOH 10mM y picar con un tip estéril un poco
de levaduras de la estría correspondiente a cada colonia en cada tubo
correctamente rotulado. Entre 5-6 clones más el control positivo (HOG-GFP) y
el negativo (ACL379)
2. Incubar 5 minutos a 100°C
3. Centrifugar 5 minutos a máxima velocidad
4. Preparar la “mix” de PCR según la siguiente tabla
“Mix”
Buffer 10x
dNTPs (10mM)
MgCl2 (50mM)
Primer Fw (10µM)
Primer Rv (10µM)
Taq (5U/µL)
H 2O
x1 (µ
µL)
2
0.4
0.6
1
1
0.25
13.75
Total
19
x10
17
5. Alicuotar 19 µL de la mix en los tubos de PCR o “strips” y agregarle a cada
uno 1µL del sobrenadante de extracción del genómico.
6. Poner la PCR en el termociclador. El programa es el siguiente:
5’ 94°C
[20” 94°C
20” 60°C
2´ 72°C]
[ ]x30 ciclos
5’ 72°C
∞ 16°C
Tapa a 105°C
7. Finalizada la PCR correr un gel de agarosa 1% para visualizar los productos de
amplificación.
Primers
5'->3'
P-Fw
ACCTCAAAGCGCTTCGTCATGG
P-Rv
AGTGTTGGCCATGGAACAGG
5.2 “SCREENING” pSTL1-TdTOMATO.
1. Preparar 6 tubos con el número de clon correspondiente y un tubo para la
cepa parental. Agregarle 200µL de medio SC.
2. Con un tip estéril picar de la estría de cada clon (una punta del tip
cruzando la estría perpendicularmente) y resuspender en el tubo correspondiente.
3. Pasar 20µL de cada tubo a un pocillo de la placa de microscopía de 384
wells.
4. Dejar que las células se asienten.
5. Ir al microscopio.
6. Re-estriar en una placa –LU los clones positivos.
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6. SEMANA 6: Experimento 1: Fosforilación de Hog1.
6. 1 PREPARACION DE MUESTRAS PARA WESTERN BLOT
1) Cada grupo recibirá:
-un cultivo en –LU de un clon positivo de la cepa con el doble reportero pSTL1.
-un cultivo en –H de un clon de Hog1-YFP.
2) Mezclar:
1
2 (NaCl 0.2M)
Cepa
Doble-STL1
Doble-STL1
Cultivo
H2Od
NaCl 4 M
900 µl
100 µl
-
900 µl
50 µl
50 µl
3 y 4 (NaCl 0.4M)
Doble-STL1 y
Hog1-YFP
900 µl
100 µl
VORTEX
5 min RT (estrictos)
NaOH 10 M:
βMSH 14 M (9:1)
100 µl
100 µl
100 µl
150µL
150µL
VORTEX
5 min RT
Ác. Tricloroacético
100%
150µL
VORTEX
10 min en hielo
Centrifugar 10 min a máx. velocidad
Descartar el sobrenadante.
¡¡¡HAY QUE SACAR TODO EL SOBRENADANTE!!!
500µL
500µL
500µL
Sc. Acetona (-20°°C)
5 min en hielo.
Centrifugar 2 min a máx. velocidad.
Descartar el sobrenadante y dejar secar.
Buffer
25 µL
25 µL
25 µL
resuspensión
Incubar a 65°C 10 min (vortex de vez en cuando).
Centrifugar 10 min a máx. Velocidad.
Pasar sobrenadante a epp. nuevo (dejar el pellet detrás)
Cracking Buffer 5x
6 µL
6 µL
6 µL
3) Conservar las muestras a -20°C.
SOLUCIONES
βMSH: βMercaptoetanol.
Sc. Acetona: 70% v/v de acetona en Tris-HCl 100 mM pH 6,8.
Buffer de resuspensión: Tris-HCl 100 mM pH 8.8, 3% SDS.
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7. SEMANA 7: SDS-PAGE y Western blot
7.1 PRINCIPIOS
El protocolo de Western implica la transferencia (o blotting) de las proteínas
desde un gel desnaturalizante a una matriz denominada membrana. Esta membrana
puede ser de distintos materiales, siendo la nitrocelulosa y el polivinilidenofluoruro
(PVDF) las más utilizadas.
Una vez terminada la corrida electroforética, las proteínas son transferidas
desde el gel a la membrana mediante una corriente eléctrica. Como se observa en la
Figura 3, se arma un “sandwich” en el cual el gel y la membrana quedan en íntimo
contacto para que, al aplicar una diferencia de potencial, las proteínas migren desde
el gel a la membrana (recuerden que las proteínas siguen cargadas negativamente
por el SDS y el pH del buffer).
Figura 1. Armado de la transferencia. Se esquematiza el orden de ensamblado de los distintos
componentes necesarios para transferir las proteínas de un gel a una membrana y la dirección de la
corriente eléctrica.
Una vez que las proteínas se encuentran en la membrana (específicamente
en su superficie), la misma es sometida secuencialmente a distintas incubaciones:
bloqueo, anticuerpo primario y anticuerpo secundario. Este último suele estar
acoplado a alguna enzima de manera de permitir el revelado de las bandas
específicas por medio de una reacción enzimática. Las enzimas más utilizadas son la
fosfatasa alcalina y la peroxidasa. El acoplado de anticuerpos secundarios a
fluoróforos también es una herramienta para el revelado de Western blot. En este
caso, la señal se analiza mediante herramientas de detección de fluorescencia en
distintas longitudes de onda (acorde al fluoróforo al que se encuentre acoplado).
Bloqueo. Dado que la membrana une proteínas de forma inespecífica, es preciso
bloquear los lugares de unión que han quedado libres tras la transferencia. En caso
contrario, el anticuerpo (de naturaleza peptídica) empleado en la detección podría
20
unirse a ellos, dificultando la identificación del complejo antígeno-anticuerpo. En el
bloqueo se incuba la membrana con una solución de proteínas, típicamente
de albúmina de suero bovino o leche en polvo, junto con una pequeña cantidad de
detergente, como Tween-20 o Tritón X-100 (típicamente entre 0,05 y 0,2%). Las
proteínas y el detergente en solución se unirán a todos aquellos lugares de unión de
la membrana que no estén ya ocupados por las proteínas transferidas desde el gel.
De este modo, el anticuerpo sólo podrá unirse a su antígeno específico, reduciendo
así el ruido de fondo.
Incubación con anticuerpos. Típicamente en un Western blot se utilizan
secuencialmente dos anticuerpos: el primario que reconoce específicamente la
proteína que se quiere detectar; y el secundario que reconoce al anticuerpo primario
y nos da la posibilidad de “revelar” la presencia del complejo proteína de interésanticuerpo primario. Las incubaciones de la membrana con las soluciones de
anticuerpo son un punto clave para un resultado exitoso a la hora de realizar un
Western blot. Las mismas se hacen en una solución buffer que consiste en Tris-HCl y
NaCl (TBS, por Tris-buffered saline) o fosfato y NaCl (PBS, por phosphate-buffered
saline). La dilución del anticuerpo, el tiempo y la temperatura de la incubación, junto
con la cantidad y duración de los lavados entre incubaciones, son parámetros que
dependen de cada complejo antígeno-anticuerpo. Es una práctica común de las
empresas que comercializan los anticuerpos, adjuntar una hoja indicando el
protocolo optimizado para el anticuerpo comprado.
Revelado. Una vez realizadas las incubaciones, existen complejos ternarios antígenoanticuerpo 1rio-anticuerpo 2rio. En el sistema de revelado más utilizado, el anticuerpo
2rio está asociado covalentemente a la enzima peroxidasa la cual, en presencia de
peróxido de hidrógeno, cataliza la oxidación del sustrato luminol generando así
emisión de luz. De esta manera, la luz generada será captada por una placa
radiográfica revelando la presencia del antígeno.
Las principales desventajas de este sistema son las variaciones de la actividad
enzimática en función del tiempo así como el rango lineal de detección de la placa
radiográfica, el cual no es muy amplio y es fácilmente saturable. Así, no es sencillo
obtener conclusiones cuantitativas y, por lo tanto, se deberían tomar recaudos como
por ejemplo curvas de dilución internas para conocer el rango lineal de detección del
sistema. Si bien la aparición de equipos electrónicos que permiten la detección de
quimioluminiscencia presenta una mejora en cuanto a la sensibilidad en
comparación a las placas radiográficas, no deben dejar de tenerse en cuenta las
desventajas que implican el revelado con un método enzimático (cinética,
concentraciones de sustrato y producto, etc). Recientemente se ha desarrollado un
nuevo sistema de detección que mejora algunas de las desventajas de los sistemas
basados en reacciones enzimáticas:
21
El equipo Odyssey® Infrared Imaging System es un escáner capaz de producir
imágenes a partir de excitación y emisión de moléculas fluorescentes en el rango
infrarrojo cercano (IR). El equipo está constituido por un sistema de dos canales de
detección independientes: un canal de 700 nm y otro de 800 nm de longitud de
onda. Esta característica permite la detección simultánea de dos blancos en la misma
membrana o en las mismas células utilizando dos anticuerpos (uno acoplado a un
fluoróforo que emite a 680nm y otro a 800nm).
Aplicaciones: Detección por anticuerpos 2rios infrarrojos (IRDye) de proteínas, ADN,
ARN, etc.Las aplicaciones más comunes son i) detección de proteínas totales en gel,
tipo coomassie, gracias al IRDye blue protein stain, ii) Westerns, iii) detección de
ácidos nucleicos totales, tipo bromuro de etidio, gracias a los colorantes SYTO
(Invitrogen) o bien de secuencias particulares (tipo Southern o Northern) gracias al
uso de una sonda biotinilada y un IRDye-Streptavidina y iv) visualización de sección
de tejidos o de pequeños animales (como ratas o ratones).
Ventajas por sobre la detección por quimioluminisencia:
•
Mayor sensibilidad: las membranas y los plásticos pueden producir una alta
señal de ruido en el espectro visible debido a la autofluorescencia y a la
dispersión de luz de los materiales. Esto limita la sensibilidad de la
fluorescencia visible y complica la detección de proteínas poco abundantes.
•
Mayor relación señal:ruido en comparación a la quimioluminisencia.
•
No se requieren sustratos, soluciones reveladoras ó películas fotográficas.
•
La señal de los anticuerpos 2rios infrarojos (IRDye) es muy estable por lo que,
si la membrana se almacena correctamente, puede ser visualizada tiempo
después. De manera similar, el tiempo no influye en la intensidad de la señal
a diferencia de la quimioliminiscencia, donde es una variable a tener en
cuenta dado que la intensidad de la señal no es constante.
•
Detección simultánea de dos anticuerpos marcados con fluoróforos distintos.
Esto es muy útil para revelar en un paso proteína total y modificaciones posttraduccionales y proteínas distintas de pesos moleculares similares.
•
Mejor respuesta cuantitativa dada la ausencia de detección enzimática que
suele aumentar la sensibilidad en detrimento de la linealidad de la detección.
Links:
• Western blot: http://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/WB-beginner.pdf
22
•
Odyssey:
http://www.licor.com/bio/products/imaging_systems/odyssey_selection.jsp
7.2 PREPARACIÓN DE GELES Y CORRIDA
Acrilamida %
7%
10%
12%
15%
1.
Rango de PM donde
resuelve
50 kDa - 500 kDa
20 kDa - 300 kDa
10 kDa - 200 kDa
3 kDa - 100 kDa
Grosor del gel
Vol. del Stacking gel
0.75mm
1.0mm
1.5mm
2mL
3mL
4mL
Vol. Del Resolving
gel
4mL
6mL
8mL
Se prepararán, cada 3 grupos, 1 gel de poliacrilamida desnaturalizante (12%)
de acuerdo con los números que se muestran a continuación.
Para 10ml de Resolving Gel
Acrilamida %
H2 O
Acrilamida/BisAcrilamida
(30%/0.8% m/v)
1.5 M Tris-HCl (pH=8.8)
10% (m/v) SDS
10% (m/v) Persulfato de amonio
(APS)
TEMED
12%
3,3 mL
4 mL
2,5 mL
100 μL
100 μL
10 μL
Para 5ml de Stacking Gel
Acrilamida %
H2 O
Acrilamida/Bis-
5%
3,3mL
830μL
23
Acrilamida
(30%/0.8% m/v)
1.0 M Tris-HCl (pH=6.8)
10% (m/v) SDS
10% (m/v) Persulfato de amonio
(APS)
TEMED
Se van a utilizar peines de 15 calles.
750μL
50μL
50μL
5μL
1. Armar el dispositivo y llenar la cuba con buffer de corrida.
2. Sembrar el contenido de cada tubo (30ul) en cada calle. En la calle que le
indiquen los docentes sembrar 2ul del marker de proteínas.
3. Correr 60V durante 30 minutos y luego a 200V hasta que caiga el frente de
corrida (entre 45 minutos y 1 hora).
4. Luego de la corrida sumergir el gel en buffer de transferencia (!).
5. Cortar membrana de nitrocelulosa del tamaño del gel (8,5 x 5,5 cm).
6. Armar un sandwich sumergido en buffer de transferencia en el siguiente orden
(de abajo hacia arriba, sobre la parte negra del sandwich).
ENTRE CADA CAPA SACAR LAS BURBUJAS UTILIZANDO UNA PIPETA O VARILLA
DE VIDRIO COMO RODILLO.
•
•
•
•
•
•
1 esponja tipo ScotchBrite embebida en buffer de transferencia.
2 hojas de papel filtro Whatman 3MM embebidas en buffer de
transferencia.
Gel.
membrana de nitrocelulosa.
2 hojas de papel filtro Whatman 3MM embebidas en buffer de
transferencia.
1 esponja tipo ScotchBrite embebida en buffer de transferencia.
IDENTIFICAR CADA MEMBRANA!!!!
7. Se ensambla en el cartucho de transferencia y se coloca dentro de la cuba de
electrotransferencia (Biorad) que luego se llena de buffer de transferencia. Se
agrega el recipiente refrigerante, se coloca la tapa y se conecta a una fuente de
poder. La transferencia se hace a un voltaje constante de 100 V durante 1 hora.
24
(!)
TENER ESPECIAL CUIDADO AL MANIPULAR METANOL: Producto inflamable. Tóxico por
inhalación o ingestión. Conservar alejado de las llamas o fuente de chispas. Evitar el
contacto con la piel.
En caso de ingestión beber etanol 40% y acudir a un médico. Usar guantes.
SOLUCIONES
Tris-Glicina 10X: Tris base 30,3 g, Glicina 144,0 g. Llevar a 1 litro con agua deionizada
Buffer de corrida: 100 ml Tris-Glicina 10X + 10ml SDS 10%% + 890 ml H2O ml
Buffer de transferencia: 100 ml Tris-Glicina 10X + 200ml metanol + 700ml H2O
8. SEMANA 8: Revelado del Western Blot
8.1 INCUBACIÓN CON ANTICUERPOS
1. Incubar la membrana con solución de bloqueo 1 hora a temperatura ambiente
con agitación.
2. Incubar con el anticuerpo primario durante toda la noche a 4°C con agitación,
según detalla la siguiente tabla:
Anticuerpo
Companía
Dilución
Especie
α-Hog1
Santa Cruz
1:1000 en solución de
bloqueo
Goat
α-pp38
Cell Signalling
1:1000 en solución de
bloqueo
Mouse
3. Recuperar los anticuerpos (ya que son muy caros y pueden reutilizarse).
25
4. Lavar la membrana 3 veces con TTBS durante 10 minutos a temperatura
ambiente con agitación.
5. Incubar con el anticuerpo secundario anti-IgG para la especie correspondiente
diluído 1:15.000 en solución de bloqueo durante 60 minutos a temperatura
ambiente con agitación. Se cuenta con los siguientes anticuerpos secundarios:
¿cuáles utilizará para la doble marcación?
1
2
3
4
5
6
7
No.
Fluoróforo
926-32211
926-32210
926-32229
926-32212
926-32213
926-68074
926-68073
800CW
800CW
680RD
800CW
800CW
680RD
680RD
Hecho
en
Goat
Goat
Goat
Donkey
Donkey
Donkey
Donkey
Reconoce
Type
anti-Rabbit
anti-Mouse
anti-Rat
anti-Mouse
anti-Rabbit
anti-Goat
anti-Rabbit
IgG
IgG
IgG
IgG
IgG
IgG
IgG
6. Los anticuerpos que se utilizan para revelar en el Odyssey están acoplados a un
fluoróforo.
PRESTAR ATENCIÓN AL ANTICUERPO SECUNDARIO
QUE LE CORRESPONDE A CADA MEMBRANA.
7. Lavar la membrana 3 veces con TTBS durante 10 minutos a temperatura
ambiente con agitación.
8. Lavar la membrana 1 vez con TBS durante 10 minutos a temperatura ambiente
con agitación.
SOLUCIONES
TBS 10X: Tris-HCl 0,25 M pH 7,4, NaCl 1,5 M. Mezclar 30,28 g de Tris base con 87,7 g
de NaCl
Ajustar pH a 7,4 y llevar a 1 litro con H2O deionizada
TTBS: TBS 1X + Tween 20 0,1%
Solución de Bloqueo: Leche en polvo descremada 5% (0% grasa) en TBS cuyas
fosfatasas fueron inactivadas por incubación a 65°C por una hora.
26
8.2 ESCANEO DE LA MEMBRANA
El revelado del Western blot será realizado mediante el sistema Odyssey. Este es un
lector de fluorescencia que posee 2 canales, uno para longitudes de onda de 700nm
y otro para longitudes de onda de 800nm. Los anticuerpos utilizados para el revelado
están acoplados a un fluoróforo que emite a 680nm o a un fluoróforo que emite a
800nm.
Para el revelado, colocaremos la membrana en un scanner lector de fluorescencia y
se analizarán los resultados usando ImageJ.
8.3 CUANTIFICACIÓN DEL WESTERN BLOT
El instructivo se subirá al campus en el momento correspondiente.
9. SEMANA 8: Experimento 2: Relocalización nuclear de Hog1YFP
1) Incubar placa de 384 wells con 50 µL/well de Concanavalina A (ConA, 1mg/mL)
durante 30 min. La ConA es una lectina que une glicanos de la pared celular de las
levaduras. Se utiliza para inmobilizar a las celulas a la hora de hacer seguimiento por
microscopía.
2) Lavar con H2Od estéril 2 veces con 80µL/well.
3) Sonicar un cultivo de la cepa a estudiar de una OD=0,05 durante 30 seg a 10% de
potencia. Esto permite separa a las células entre sí.
4) Plaquear 20 µL de células por well. Cada grupo utiliza 4 wells.
5) Centrifugar 1 min a 4500 rpm en centrífuga de placas.
6) Sacar el sobrenadante con una pipeta desde una punta y agregar 20 µl de medio
SC por well por la punta opuesta.
7) En el microscopio, primero se guardan las posiciones a estudiar y luego se agrega
el estímulo:
Condición:
NaCl 0.15M
NaCl 0.3M
NaCl 0.6M
Sin estimular
-
NaCl 0.1M
40 µL
-
NaCl 0.2M
40 µL
-
NaCl 0.4M
40 µL
27
8) Realizar el análisis de datos siguiendo el instructivo de cuantificación de
relocalización nuclear.
10. SEMANA 12: Experimento 3: Análisis de la expresión del
doble reportero transcripcional.
10.1. SHOCK HIPEROSMÓTICO
1) A partir de un cultivo ON en –LU de un clon positivo de cada grupo, diluir y crecer
a 30°C por hasta OD=0,05. Diluir a 0,025.
2) Sonicar durante 30 seg a 10% de potencia.
3) Mezclar:
Células
NaCl 4 M
H2O miliQ
Cicloheximida
(10x =25µg/mL)
1
180 µL
20 µL
20 µL
2 (NaCl 0.1M) 3 (NaCl 0.2M)
180 µL
180 µL
5 µL
10 µL
15 µL
10 µL
VORTEX
Incubar a 30°C 45 min
20 µL
20 µL
4 (NaCl 0.4M)
180 µL
20 µL
-
20 µL
VORTEX
Incubar a RT 90 min
Pasar 60µL/well a una placa tratada con ConA
4) Capturar las imágenes en el microscopio.
10.2 ANALISIS DE DATOS
1) Análisis de imágenes usando Cell-ID
2) Análisis de la variabilidad célula-célula a partir de los datos recolectados.
28
Para cada concentracion de NaCl tienen que calcular:
1. Calcular las variables sin el background:
f.total.*=f.tot.*-a.tot⋅f.bg.*
*:
f.tot.y= YFP
f.tot.r= tdTomato
2. Calcular las variables normalizadas por la media por concentración.
3. Calcular el ruido intrínseco y el extrínseco de a pares según:
2
int
η =
( y − c )2
2
2
η ext
= yc − 1
4.Gráficos:
-Media±SD de f.total.* en función de [NaCl]
-Histogramas de f.total.* en función de [NaCl]
-Gráficos de puntos de f.total.* SIN normalizar de los pares (yc, cr, yr) para las distintas NaCl
en un mismo par de ejes
-Gráficos de puntos de f.total.* normalizadas de a pares (yc, cr, yr) para las distintas NaCl
-Ruido intrínseco y extríseco en función de [NaCl]
29