Bioquímica de Proteinas

Bioquímica de Proteinas.
1er. Cuatrimestre de 2012.
Programa Teórico
I.
Las proteínas en Biotecnología. La Proteómica y su importancia como continuación de los Proyectos
Genoma.
II. Purificación de proteínas. Estrategias generales. Obtención del extracto libre de células: ruptura y
extracción del material, clarificación, concentración. Diálisis. Métodos cromatográficos basados en la
carga (intercambio iónico, cromatoenfocado), en la hidrofobicidad, en la formación de quelatos metálicos o
uniones covalentes, o en la adsorción. Cromatografía de afinidad. Filtración por gel.
Problemas especiales: Purificación de proteínas en gran escala o para usos terapéuticos. Purificación de
proteínas de membrana. Uso de detergentes. La separación de fases con Triton X-114.
Criterios de pureza: Electroforesis en gel de poliacrilamida. Electroforesis bidimensional (2D-PAGE)
III. Caracterización de las proteínas: Determinación de la masa molecular por ultracentrifugación analítica
o en gradiente, espectrometría de masa y filtración por gel.
Secuenciación de las proteínas: la reacción de Edman. Estrategias adicionales de purificación para
secuenciación. Secuenciación directa del N-terminal. Secuenciación de péptidos internos: digestión
enzimática o fragmentación química seguida de separación por HPLC o electroforesis.
Digestión
enzimática in situ en el gel electroforético.
Aplicaciones de la espectrometría de masa a la determinación de secuencias.
IV.
Estructura de las proteínas: Niveles primario, secundario, terciario y cuaternario. Motivos y
dominios.
Determinación de la estructura
tridimensional
de las proteínas.
Dicroísmo circular.
Cristalografía de Rayos X. Resonancia Magnética Nuclear (NMR).
Predicción, modificación y diseño de estructuras proteicas.
Modelado computacional de
estructuras.
V. Modificaciones post-traduccionales de las proteínas en eucariotes. Puentes disulfuro, O- y Nglicosilación, fosforilaciones, sulfatación, prenilación, acilación. Anclas de
glicosil fosfatidil inositol.
Procesado proteolítico: péptidos señal y dominios pro. Precursores hormonales y poliproteínas virales.
Proteinasas de procesamiento. Inteínas.
VI.
Plegamiento de las proteínas. Estados desplegado, plegado y de glóbulo fundido. Métodos de
estudio del plegamiento. Enzimas que participan en el plegamiento: protein disulfuro isomerasa y
peptidil-prolil cis-trans isomerasa. Chaperonas moleculares y su función en el plegamiento.
Importancia del plegamiento de las proteínas en Biotecnología. Cuerpos de inclusión: estructura y
propiedades. Factores que afectan su formación. Purificación de cuerpos de inclusión. Solubilización,
purificación y renaturalización de la proteínas recombinantes.
VII.
La degradación proteolítica de las proteínas y su prevención.
Proteinasas:
clasificación y
nomenclatura. Estructura y propiedades de serin proteinasas, cistein proteinasas, aspartil proteinasas y
metaloproteinasas. El proteasoma. Inhibidores: reactivos químicos, derivados de péptidos e inhibidores
proteicos naturales. Su uso para evitar la proteólisis no deseada de proteínas naturales o recombinantes
durante su purificación.
Programa práctico
1) Purificación de proteínas:
Teórico-Práctico: Obtención de extracto libre de células, precipitación con sulfato de amonio. Diálisis.
Práctico: Cromatografía de afinidad en columna con lectinas inmobilizadas: ConA Sepharosa.
Práctico: Cromatografía de intercambio iónico: FPLC en columna Mono Q, y Explicación de Filtración
por gel: FPLC en columna de Superdex 75.
Teórico-Práctico: Elaboración de los datos de purificación. Tabla de Purificación.
2) Criterios de pureza de proteínas:
Práctico:
Electroforesis en geles de poliacrilamida.
Tinciones con plata y con Coomassie Blue.
Transferencia a membrana: Western blot.
Mostración de 2D-PAGE.
3)
Secuenciación de proteínas:
Teórico-Práctico: Digestión de proteínas in gel. Separación por HPLC en fase reversa.
La clase teórica sobre secuenciación de péptidos y espectrometría de masa en el LANAIS-Pro incluye una
demostración del uso del secuenciador automático y el espectrómetro de masa.
Bibliografía
1) E. L.V.Harris and S. Angal: Protein purification methods: a practical approach. IRL Press, Oxford,
1989.
2) E. L.V.Harris and S. Angal: Protein purification applications: a practical approach. IRL Press, Oxford,
1990.
3) P. Matsudaira: A practical guide to protein and peptide purification for microsequencing. Academic
Press Inc., New York, 1993.
4) T. E. Creighton (Ed.): Protein Structure. A practical approach. 2nd. Edition. IRL Press, Oxford, 1997.
5) C. Branden and J. Tooze: Introduction to protein structure. Garland Publishing Inc., New York and
London, 1991.
6) R. H. Pain: Mechanisms of protein folding. IRL Press, Oxford, 1994.
7) R.J. Beynon and J.S. Bond: Proteolytic enzymes: a practical approach. IRL Press, Oxford, 1989.
Cronograma de la asignatura Bioquímica de Proteinas, 2012
Clases Teóricas (Miercoles y Jueves de 14 a 17 hs., Marzo y Abril)
Tema
Docente
Fecha
Introducción. Purificación de proteínas I.
Purificación de proteínas II.
Purificación de proteínas III.
Homogeneidad. Masa molecular.
Estructura 1a. Secuenciación de péptidos.
Modificaciones post-traduccionales:
Modificaciones post-traduccionales: glicosilación
Visita LANAIS-Pro
Estructura 3a. NMR
Estructura 3a. Cristalografía.
Proteinasas I
Estructura 2a. Dicroísmo circular
Proteinasas II.
Plegamiento de las proteínas.
Proteinasas III.
J.J. Cazzulo/ V.E. Alvarez Mi
V.E. Alvarez
Ju
V.E. Alvarez
Mi
J.J. Cazzulo
Ju
J.J.Cazzulo
Mi
J.J. Cazzulo
Ju
J.J. Cazzulo
Mi
S. Linskens
Ju
R. Rasia
Mi
G. Paris
Ju
J.J. Cazzulo
Mi
J.M. Delfino
Ju
J.J. Cazzulo
Mi
J. Caramelo
Ju
J.J. Cazzulo
Mi
7/3
8/3
14/3
15/3
21/3
22/3
28/3
29/3*
11/4
12 /4
18 /4
19 /4
25 /4
26 /4
2/ 5
*La visita al LANAIS-Pro durará en total 6 hs. (previstas para los Jueves como horario de TPs), con los
alumnos divididos al menos en dos grupos, dependiendo del número.
Trabajos Prácticos y Exámenes Parciales
Miércoles y Jueves, 14 a 18 hs
Exámenes Parciales
Miércoles o Jueves, 14 a 18 hs
Fechas a modificar, en reunión con los Prof. Adjuntos y los JTPs:
Purificación I (Extracto crudo y sulfato de amonio)
Purificación II (ConA Sepharosa)
Purificación III (MonoQ)
HPLC en fase reversa de péptidos
SDS-PAGE I (Tinción Coomasie y plata)
Jueves
Miércoles
Jueves
Miercoles
Jueves
3/5
9/5
10/5
16/5
17/5
Primer Parcial Teórico (Temas I a IV)
Miércoles
23/5
Revelado I – Análisis de purificación
SDS-PAGE II (Actividad en gel y western blot)
Revelado II – Análisis de Purificación
Jueves
Miércoles
Jueves
24/5
30/5
31/5
Segundo Parcial Teórico (Temas V a VII)
Miércoles
6/6
Filtración por gel – Análisis de purificación
Mostración de 2D-PAGE
Jueves
Miércoles
7/6
13/6
Parcial de Trabajos Prácticos
Recuperatorio de parciales
Jueves
Jueves
14/6
21/6
Docentes auxiliares:
1. Purificación: Dr. Gastón Paris - Alejandra Frasch - Paula Iribarren? .
2, 3 y 4. SDS-PAGE y Western Blot: Dr. Gaston Paris - Paula Iribarren? – Alejandra Frasch
Profesor a cargo de Bioquímica de Proteínas:
Prof. Tit. Dr. Juan José Cazzulo. 10 CTs de 3 hs., 30 hs. totales.
Prof. Adj. Dr. Carlos Labriola 9 TPs de 6 hs., y 2 Examenes Parciales de 4 hs., 58 hs. totales.
Prof. Adj. Dra. Vanina Alvarez 3 Cts, 9 TPs de 6 hs., y 2 Examenes Parciales de 4 hs., 66 hs. totales.
Profesores Invitados:
Lic. Susana Linskens y Farm. Carlos Pavan.
Dr. José María Delfino.
Dr. Rodolfo Rasia.
Dr. Julio Caramelo
1 Clase teórico-Práctica de 6 hs. 6 hs. totales.
1 Clase Teórica de 3 hs. 3 hs. totales.
1 Clase Teórica de 3 hs. 3 hs. totales.
1 Clase Teórica de 3 hs. 3 hs. totales.
Jefe de Trabajos Prácticos:
Dr. Gaston Paris
Horas de docencia de los Docentes Auxiliares de Bioquímica de Proteínas:
JTP Dr. Gastón París. 1 CT de 6 hs.y 4 TPs de 6 hs. 30 hs. totales.
Bioq. Alejandra Frasch 3 TPs de 6 hs. 24 hs. totales.
Bioq. Paula Iribarren
3 TPs de 6 hs. 24 hs. totales.