BOLILLA N° 4: INOCULACIÓN DE LOS DIFERENTES MEDIOS

INOCULACIÓN DE LOS DIFERENTES MEDIOS DE
CULTIVO
Definición: Se denomina siembra ( o inoculación de un medio de cultivo9, al
procedimiento mediante el cual se deposita sobre un medio de cultivo apropiado los
microorganismos con el objetivo de obtener un desarrollo posterior de los mismos. Para
que el o los microorganismos se multipliquen el medio debe poseer los ingredientes ( o
componentes) que los microorganismos requieren. Hay bacterias que exigen para su
desarrollo medios complejos, en cambio otras requieren medios sencillos. No solamente
es suficiente el medio, sino que la temperatura debe ser la adecuada, al igual que la
tensión de oxígeno y anhídrido carbónico, humedad, etc. De ahí que de acuerdo a las
exigencias nutritivas de los microorganismos, etc se opte por uno u otro medio de
cultivo.
Según la temperatura óptima de desarrollo podemos clasificar a los microorganismos en
3 grandes grupos:
 Psicrófilos: desarrollan a temperaturas que varían entre 5-15°C.
 Mesófilos: desarrollan a temperaturas que varían entre 25-40°C.
 Termófilos: desarrollan a temperaturas que varían entre 45-70°C.
Dentro del grupo de los mesófilos se encuentran la gran mayoría de las bacterias
patogénicas. En el laboratorio se acostumbra tener una estufa de incubación a 37,5°C, y
otra a 28-30°C.
Las bacterias que requieren la presencia de oxígeno para su desarrollo son denominadas
aerobias, mientras que las que crecen en su ausencia son denominadas anaerobias. Las
bacterias que crecen bajo tensiones de CO2 del 5-10% (como Brucella abortus y
Brucella ovis) son denominadas Capnófilas.
Finalidades de la siembra
Las finalidades de la siembra son 2:
1) Aislamiento. Tiene por objeto como lo dice su nombre aislar bacterias.
En la naturaleza es difícil obtener colonias en estado de pureza, de
ahí que cuando se requiera obtenerlas en estado puro recurrimos a las técnicas de
aislamiento. A veces para realizar estudios e identificación de bacterias debemos
partir de materiales en los cuales existe más de una especie bacteriana por lo que
debemos recurrir a métodos de aislamiento que nos permiten obtener esa bacteria en
estado de pureza.
2) Transplante o repique. Es una siembra realizada a partir de un cultivo puro. Los
motivos por los cuales recurrimos a ello son:
 Conservar una cepa en el laboratorio. Periódicamente hay que
transplantarlos a un medio nuevo para que permanezcan viables.
 Para estudiar distintas propiedades de las bacterias (morfológicas,
culturales, bioquímicas, etc.).
 Multiplicación para la obtención de vacunas, etc.
La manera de manipular un medio de cultivo es muy importante, no solamente para
evitar la contaminación de los medios, sino también para evitar la contaminación del
ambiente y del operador. Una vez preparado el medio de cultivo el mismo es depositado
más comúnmente en: cajas de Petri y en tubos de ensayo, los cuales serán
posteriormente sembrados. Para ello preocedemos de la siguiente forma:
A) Medio de cultivo en caja de Petri. El agar se incorpora al medio
líquido llevándolo a fusión a 100°C. La placa de Petri se carga
con el agar cuando este está todavía líquido a una temperatura
de alrededor de 45°C. La carga de la Placa debe hacerse en un
lugar de trabajo libre de bacterias, mediante el uso del mechero
de Bunsen con llama intensa. Se flamea el cuello del tubo de
ensayo (o botella) en que está contenido el medio, y se levanta
la tapa de la Caja de Petri lo suficiente como para permitir que
el medio escurra sobre la base de la misma. Es importante
evitar la formación de burbujas, pero en el caso de que éstas se
formen, se eliminan pasando la llama del mechero de Bunsen
sobre la superficie del medio antes que el mismo se solidifique.
(ver figura 1).
B) Medio de cultivo en tubo de ensayo (agar en pico de flauta)
Una vez preparado el medio (matraces, balón, etc.) procederemos a su colocación en
tubos de ensayo. Para ello flameamos en el mechero la boca del recipiente que contiene
el medio de cultivo que previamente fue llevado al estado líquido, y vertimos en el tubo
de ensayo hasta aproximadamente 1/3 (7cm) y se tapa su boca con algodón. Se lleva al
autoclave para esterilizar. Luego de esterilizado se funde, y se deja enfriar en posición
casi horizontal; se puede o no dejar culote. (fig. 2)
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La siembra se hace partiendo de materiales patológicos como: pus, exudado, etc; o de
materiales no patológicos como: sangre, orina, heces, líquido peritoneal, etc.
Cuando partimos de medios de cultivo para siembra, podemos hacerlo ya sea a partir de
medios sólidos o líquidos, los cuales pueden sembrarse en medios líquidos,
semilíquidos, semisólidos y sólidos.
SIEMBRA A PARTIR DE MEDIOS LÍQUIDOS
Cuando se parte de medios líquidos el INOCULO se toma con el ASA DE PLATINO,
siempre y cuando se siembren pequeñas cantidades. Ej: cuando sembramos tubo a tubo.
Si vamos a sembrar volúmenes grandes de medio de cultivo emplearemos PIPETAS (ya
sean graduadas o la pipeta de Pasteur).
Junto al material de siembra debemos también contar con los siguientes elementos: una
PROBETA CON SOLUCIÓN ANTISÉPTICA (hipoclorito, etc.), donde se sumergirán
las pipetas utilizadas; PISETA CON SOL. ANTISÉPTICA (alcohol yodado) para
nuestras manos y DESINFECTANTES (espadol) para la mesa. Debemos recordar que
siempre previa a la siembra debemos aflojar los tapones rotando el tubo ligeramente
hacia el cuerpo del operario, porque puede suceder que en el momento de la siembra (si
no se toma esta precaución) el tapón esté adherido al vidrio y el forcejeo puede producir
la contaminación del operario, etc.
A. Siembra de medio líquido a líquido
Cuando sembramos en un medio líquido: CALDO, además de lo enumerado
anteriormente necesitaremos:
- una gradilla con tubos a nuestra izquierda;
- un soporte con asas y espátula a nuestra derecha.
Ya dijimos que para la siembra de pequeñas cantidades de líquidos utilizaremos el
ASA. La técnica de la siembra es la siguiente:
1) Tomamos el ASA DE PLATINO, la esterilizamos al rojo sobre
el mechero de Bunsen y flameamos el mango de Kolle. Con la
mano derecha.
2) Tomamos el tubo (del cual vamos a extraer el inóculo) con la
mano izquierda, destapamos con el meñique de la mano
derecha, manteniéndolo lo mas horizontal posible y flameamos
la boca del tubo.
3) Introducimos el asa, la dejamos enfriar en las paredes del tubo,
y luego la sumergimos en el medio líquido. Retiramos el asa
(con el inóculo) sin tocar las paredes del tubo, flameamos la
boca del tubo y tapamos. Lo colocamos nuevamente en la
gradilla.
4) Tomamos el tubo donde efectuaremos la siembra (siempre con
la mano izquierda), lo destapamos con el meñique, flameamos
la boca e introducimos el asa en el tubo, depositando el inóculo
en la pared opuestas al líquido, que al volver a la posición
vertical quedará incluido en el medio de cultivo. Flameamos y
tapamos. Recalcamos que en el momento de la siembra el tubo
se mantiene en posición casi horizontal y que el inóculo es
depositado en la pared opuesta al medio.
5) Secamos el asa de platino en el calor de la llama del mechero,
para después introducirlo directamente en la llama, hasta
llevarla al rojo. Flameamos el mango y lo depositamos sobre el
soporte.
6) Identificamos el tubo (con marcador de tinta indeleble) con el
nombre de la cepa, la fecha, y en algunos casos la hora de la
siembra.
7) Llevamos a estufa a 37°C durante 24-48hs. (figura 3).
La siembra del medio de Koser es un caso particular, en el que partiendo de un medio
líquido en lugar de usar el asa, la pipeta graduada o la pipeta Pasteur, utilizaremos el
hilo de platino o la espátula. Este medio es transparente como el agua, y el crecimiento
de bacterias en el mismo está indicado por el enturbiamiento del mismo. Este medio
como vimos anteriormente contiene carbono en forma inorgánica y se emplea para saber
si una bacteria es capaz de utilizarlo o no.
B. Siembra en medio líquido en sólido
a. En este caso sembraremos en un tubo que contiene agar
en pico de flauta, o agar inclinado.
Las etapas 1, 2 y 3 son iguales que para el caso anterior. A
continuación, o sea el paso 4 se realiza llevando el asa hasta
el fondo, apoyándola sobre el medio y deslizándola
suavemente (en zig-zag) hacia la boca del tubo de ensayo. Las
restantes etapas son similares al caso visto con anterioridad.
Este método es denominado siembras en estría.
Cuando se retira el tapón de algodón de los tubos, se hace
siempre girando hacia el lado de adentro, pero en caso de
emplear tubos con tapones de rosca, son retirados con el
meñique rotando el tubo hacia fuera.
Los tubos con medio de cultivo, al igual que los matraces en
el momento de ser manipulados para retirarles el tapón deben
disponerse en forma casi horizontal; esta es una precaución
que se toma para evitar la contaminación de los medios de
cultivo a partir de partículas de tierra y polvo que caen sobre
el lugar que se está trabajando. De manera que, reduciendo al
mínimo la superficie de sección (la abertura) disminuiremos
también la posibilidad de contaminación. Además, de esa
manera, cuando se hace el flameado de la boca, las partículas
que estén o que hayan podido caer en la boca, serán
esterilizadas al esterilizar la boca del tubo.
b. Cuando se han de sembrar cantidades mayores, por ej
para sembrar medios líquidos en un matraz, sembramos
con pipeta de Pasteur. En el laboratorio de Bacteriología
se trabaja con material que es peligroso para el hombre,
por lo tanto siempre hay que tomar todas las precauciones
que sean posibles para evitar contaminaciones.
Partimos de un medio líquido: tubo, al cual se le quitó el
capuchón de papel Kraft, tomamos una pipeta y
flameamos su extremo bucal como precaución (para
proteger al operador), cortamos elo extremo capilar y lo
flameamos 3 o 4 veces. Dejamos enfriar en las paredes del
tubo del que tomaremos el inóculo, absorbemos (tomando
primeramente la temperatura con los labios mojados) y
tomamos el volumen que deseamos sembrar, manteniendo
obturada la pipeta con la punta de la lengua, y la punta de
la pipeta cerca de la llama, hasta que se deposite el
inóculo sobre el medio de cultivo elegido. Luego de
usadas las pipetas se llevan a una probeta que contiene
una solución antiséptica.
Siempre que trabajemos con pipetas es conveniente tener
cerca algodón y alcohol yodado por si caen gotas en la
mesa, por descuidos del operador, accidente, etc.
c. La siembra con medios líquidos a caja de Petri suele
hacerse para recuentos de bacterias viables de un cultivo.
Se debe trabajar con cantidades conocidas, empleando
para ello pipetas graduadas. Se toma 1 cc, y en otros casos
0,1 cc. Depositamos 1/10, 2/10, etc y después hacemos los
cálculos. Ellos nos determinarán la cantidad:
concentración de bacterias en un antígeno, en una
suspensión, etc.
Cuando se hacen antibiogramas se requieren densas capas
de cultivo, las cuales se logran con hisopo. La técnica
consiste en impregnar el hisopo en el líquido (ya sea en el
caldo donde se cultivó la bacteria o en la suspensión que
se hace con suero fisiológico) de la cepa que se quiere
probar su sensibilidad, y sembrando masivamente.
También se puede sembrar una caja de Petri, depositando
1,2, o 3 gotas con pipetas Pasteur sobre la superficie y
luego con el asa distribuirlas en toda la superficie.
Otro medio de siembra de la caja de Petri es solamente con
el asa de Platino (muy usado). Procedemos primeramente
a esterilizar el asa llevándola a la llama del mechero de
Bunsen, la cual queda al rojo vivo. Flameamos el mango,
enfriamos el asa en las paredes del tubo del que retiramos
el inóculo, sumergimos el asa en el medio líquido y
retiramos, quedando una gota en el asa (por tensión
superficial), la cual será depositada sobre la mitad de la
caja de Petri que contiene el medio de cultivo, en una capa
muy delgada sobre una pequeña área de su superficie. Las
técnicas de siembra son múltiples, pero en general se parte
del inóculo y se lo hace correr en franjas desde un área
hasta el resto de la placa, siguiendo siempre un patrón
determinado. Las franjas deben correr solo en un sentido,
evitando tocar la otra franja ya esparcida, para pasar a la
siguiente. Ver Figura 5.
Uno de los métodos más usados es el que se representa en
la Figura 6, realizándose la inoculación según la siguiente
técnica:
1). Quitamos el tapón de algodón del tubo de ensayo con
el medio líquido, aplicamos la llama sobre el borde y
tomamos el inóculo (o semilla).
2). Trabajando siempre al abrigo de la llama, se toma la
caja de Petri con la mano izquierda de modo tal que la
base quede sobre la palma de la mano y la tapa pueda
manipularse (abrir o cerrar) con los dedos pulgar y medio
de la mano izquierda.
3. Levantando la tapa, se coloca el inóculo con el borde
opuesto y se hacen las estrías de un lado a otro, trazando
líneas paralelas que cubran aproximadamente una cuarta
parte de la placa. (A)
4. Luego se tapa la caja y se flamea el asa con la que se
hizo la inoculación.
5. Se gira la caja de Petri aproximadamente ¼ de vuelta y
con el asa fría se toca la superficie de uno de los extremos
de las estrías recién hechas y se hace un segundo grupo de
estrías, teniendo cuidado de no cruzar los originales. (B)
6. Se repiten estos pasos 2 veces más. ©
d..Siembra en botellas de Roux. Se utiliza para la
preparación de vacunas, antígenos, etc. La siembra se
realiza en botellas de Roux con un medio sólido en una de
sus caras. Se realiza la siembra con la ayuda de un
colaborador. Primero se toman de 5-10 cc de caldo, se
vierten sobre el medio, se tapa y luego se distribuye (por
movimientos a la botella) de manera que el inóculo cubra
la superficie del medio. Dejamos la botella con el medio
hacia abajo por lapsos de tiempo que varían entre 25
minutos y 3-4 horas. A continuación incubamos con el
medio hacia arriba. Antes de levantar el cultivo se debe
eliminar el líquido o inóculum por medio de pipetas (o
bomba de vacío), o flameando la boca de la botella y
dejando caer el líquido en exceso sobre una solución
antiséptica. Se agregan posteriormente 30 cc de suero
fisiológico y luego se extrae con pipetas.
e.. Siembra del Medio de Löeffler. Es un medio sólido
para Corynebacterium diphteriae. Se prepara en tubos y
pico de flauta. La solidez del medio se obtiene por
coagulación (del suero que pose) en baño de arena. La
siembra se realiza con asa de platino. Se toma del medio
líquido del cual partimos una gota, y sembramos en estrías
en la parte media del pico de flauta (ver Figura 7), sin
abarcar todo el ancho.
En este medio se estudian propiedades proteolíticas de las
bacterias; si las mismas poseen enzimas proteolíticas,
aparece un surco, debido a que el medio se ha licuado.
CUANDO TRABAJAMOS CONMYCOBACTERIUM
TUBERCULOSIS, BRUCELLA ABORTUS, BACILLUS
ANTHRACIS (BACTERIAS MUY PATÓGENAS) HAY
QUE TENER MUCHAS PRECAUCIONES CUANDO
SE ESTERILIZA EL ASA. LA MISMA CONVIENE
ESTERILIZARLA DENTRO DE UN TUBO FUERTE
DE VIDRIO PIREX DENTRO DE LA CUAL ES
INTRODUCIDA EL ASA Y LLEVADA AL ROJO
VIVO POR EL CALOR DEL MECHERO DE BUNSEN,
EVITÁNDOSE ASÍ LAS PROYECCIONES DE
BACTERIAS.
SIEMBRA A PARTIR DE MEDIOS SÓLIDOS:
Cuando sembramos partiendo de medios sólidos (del cual extraeremos el inóculo),
utilizaremos el hilo de platino. El mismo no es ni mas ni menos que un trozo de alambre
de platino o de cromo níquel en forma de aguja, y sostenido por el mango de Kolle, y la
espátula de platino, que es igual al anterior, pero con el extremo distal achatado.
A. Siembra de medio sólido a sólido
En este caso partiremos de un medio sólido (tubo en pico de flauta) y le
sembraremos en otro medio sólido (tubo en pico de flauta).
Técnica: tomamos la espátula, la esterilizamos al rojo en el mechero de Bunsen y
flameamos el mango. Se toma el tubo con la mano izquierda, se quita el tapón
(girando siempre el tubo hacia nosotros) con el dedo meñique y la palma de la
mano, se flamea la boca del tubo e introducimos la espátula en su interior, dejando
que se enfríe entre la pared del tubo y el medio de cultivo. El cultivo está en la
superficie del pico de flauta; con la espátula fría tocamos la superficie del medio de
cultivo en forma suave.
Se retira la espátula cargada, se flamea la boca del tubo y se tapa. Tomamos el tubo
donde haremos la siembra y hacemos la siembra, con un tratamiento similar, y
sembramos, llevando la espátula hasta el fondo del tubo en pico de flauta haciendo
5-6 estrías lineales paralelas a lo largo de la superficie del medio. Flameamos la
boca del tubo y la cerramos. Llevamos la espátula al calor de la llama y pasados
unos segundos la introducimos en la llama esterilizando al rojo, depositándola
posteriormente a nuestra derecha en el soporte colocado a tal efecto, etc.
B. Siembra por punción en picadura.
Esta técnica es empleada para sembrar los siguientes medios: gelatina nutritiva y SIM
(Sulfhídrico-Indol-Motilidad).
Empleamos para ello el hilo de platino (en su defecto podemos usar la espátula), y por
las manipulaciones ya vistas extraemos el inóculo. El tubo de gelatina o el SIM se
mantiene en forma vertical (con la boca hacia abajo) u horizontal, haciéndose la punción
en el centro del medio, y hundiendo el hilo hasta las 2/3 partes del medio (Nunca hasta
el fondo del medio). Retiramos el hilo, etc.
Se incuba a temperatura ambientes (20°C).
C. Siembra por técnica de punción y estrías. (MIXTA)
Por esta técnica se siembra el medio TSIA (Three-Shugar-Iron-Agar), con el cual se
estudian las propiedades fermentativas de algunas bacterias (enterobacterias Gram
negativas) y formación de H2S.
El medio se prepara en tubo en pico de flauta, pero dejando un fondo de por lo menos
una pulgada. Se utiliza la espátula de platino, la cual se carga masivamente y se
siembra. La parte de la columna por punción, se retira y se hacen estrías en la superficie
del pico de flauta. Tapamos, esterilizamos, etc.
Otro medio de cultivo que se siembra igual al anterior (o sea por técnica mixta de
punción y estrías) es el AGAR UREA DE CHRISTIANSEN. Es un medio que se utiliza
para saber si una bacteria ataca o no a la urea.
Otras siembras.
Siembra del medio de Tarozzi: es un medio de cultivo para bacterias anaerobias.
Este medio está constituido por pequeños trozos de tejido y una parte líquida. Previo a
la siembra conviene calentar el medio al baño María durante algunos minutos para
producir la eliminación del aire (que pudiera contener el medio después de un período
de preparado), método que es conocido con el nombre de “rejuvenecimiento del medio
de Tarozzi”. Para sembrar partiendo de un medio líquido usamos la pipeta Pasteur, la
cual debe ser previamente flameada, se toma el inóculo y se deposita en la parte central
del medio Tarozzi, junto a los pequeños trozos de tejidos, cuya composición ya vimos al
estudiar la práctica 3: MEDIOS DE CULTIVO.
Luego de sembrados, todos los medios de cultivo deben ser llevados a la estufa para
su incubación.
En este período donde se producirá el desarrollo bacteriano (siempre que el material
usado como inóculo posea microorganismos). La temperatura a la que se cultivan las
bacterias patógenas es de 37°C (temperatura óptima de incubación). Los hongos se
cultivan a una temperatura menor: 20-25°C. Las leptospiras a una temperatura de 2830°C.
El período de incubación es de 24-48 hs mas o menos, pero hay ciertas bacterias que
requieren más tiempo, como lo es el caso de Mycobacterium tuberculosis. Además el
período de incubación depende del tipo de Mycobacterium, ya que el aviar se cultiva
más rapidamente que el humano, y éste a su vez más rápido que el M. bovino.
NOTA IMPORTANTE
1) Los medios que se utilizarán para siembra deben ser previamente controlados en
su esterilidad, para lo cual se les lleva a estufa por un lapso de 48 hs,
eliminándose las que presentan contaminación.
2) Cuando vamos a sembrar varios tubos, previamente deberemos aflojar todos los
tapones para facilitarnos el manejo posterior.
3) Cuando se trabaja no se debe hablar y deben evitarse las corrientes de aire.
4) Los recipientes que contienen las soluciones antisépticas (en las cuales se
depositan las pipetas una vez utilizadas) deben tener en el fondo del recipiente
algodón, para evitar la ruptura de las puntas del material de vidriería.