Influencia de diferentes antibióticos aminoglicósidos sobre la regeneración de hojas de albaricoquero C. Petri, N. Alburquerque y L. Burgos Departamento de Mejora y Patología Vegetal, CEBAS-CSIC. Apdo. 4195, 30.080 Murcia Palabras clave: estreptomicina, geneticina, kanamicina, paromomicina, Prunus armeniaca, yemas adventicias Resumen Se estudia el efecto de diferentes antibióticos de tipo aminoglicósido sobre la regeneración adventicia en hojas de albaricoquero (Prunus armeniaca).Se han evaluado los antibióticos kanamicina, estreptomicina, geneticina y paromomicina a concentraciones comprendidas entre 0 y 50 µM. Mientras que la kanamicina tuvo un efecto estimulador, con respecto al control, a bajas concentraciones, la paromomicina y la estreptomicina produjeron una disminución progresiva de la regeneración al aumentar la concentración de antibiótico. La geneticina, por otro lado, fue letal a todas las dosis estudiadas. La kanamicina cuando se aplicó a bajas concentraciones tuvo un efecto adicional incrementando la velocidad de aparición de las yemas. El estudio ha permitido conocer las concentraciones mínimas de antibióticos que inhiben la regeneración con el fin de utilizar estas en futuros experimentos de transformación para seleccionar brotes transformados. INTRODUCCIÓN Se ha desarrollado en nuestro Departamento un método de regeneración adventicia a partir de hojas de albaricoquero (Prunus armeniaca L), habiéndose estudiado diferentes factores que afectan la regeneración de nuevos brotes a partir de hojas obtenidas de plantas cultivadas in vitro (Pérez-Tornero et al., 2000; Burgos y Alburquerque, 2003). Entre estos factores se ha evaluado el efecto de diferentes antibióticos aminoglicósidos sobre la regeneración de hojas de albaricoquero que son ampliamente utilizados en protocolos de transformación como agentes de selección ya que el gen marcador de la neomicina fosfotransferasa (nptII) confiere resistencia a estos antibióticos. El objetivo de este trabajo ha sido comparar el efecto de diferentes antibióticos sobre la regeneración para seleccionar el que pudiera ser más adecuado como agente selectivo en los experimentos de transformación. MATERIAL Y MÉTODOS Se utilizaron brotes del cv. Helena cultivados in vitro. ‘Helena’ es una selección del programa de mejora de albaricoquero del ARS (USDA) amablemente cedida in vitro por el Dr. Craig Ledbetter. Mantenimiento de los brotes in vitro Los brotes se mantuvieron y multiplicaron en las condiciones descritas previamente (Pérez-Tornero y Burgos, 2001). Brevemente, los brotes se subcultivaron cada 21 días en medio de multiplicación a 22 + 1ºC con un fotoperiodo de 16 h y una intensidad luminosa de 55 µmol m-2 s-1. El medio de multiplicación consiste en los macronutrientes de Q&L y micronutrientes, vitaminas y componentes orgánicos de DKW, 3% sacarosa y 0.7% agar (HispanLab, Cat. nº 1812). El pH se ajustó a 5.7 antes de esterilizar el medio en un autoclave a 121ºC durante 20 minutos. Protocolo de regeneración Para regenerar yemas adventicias a partir de hojas de albaricoquero se ha descrito previamente un protocolo (Burgos y Alburquerque, 2003) que es el que se ha utilizado. Brevemente, se utilizó el mismo medio de cultivo que durante la multiplicación pero con diferentes reguladores del crecimiento (TDZ 9.0 µM y NAA 4.0 µM), la adición de tiosulfato (STS) 60µM y como agente gelificante “Pure Agar” (Hispanlab, Cat. nº 1806.00) al 0.7%. 1. Descripción de tratamientos. Se comprobó el efecto de los antibióticos kanamicina, estreptomicina, geneticina y paromomicina a concentraciones comprendidas entre 0 y 50 µM sobre la regeneración. Efecto de la kanamicina sobre el momento de aparición de yemas. Asimismo, se evaluó el efecto de 8.6 µM kanamicina sobre el momento de aparición de las yemas y la consistencia de los resultados de experimentos independientes, y se comparó con otros tratamientos que también estimulan la regeneración como los inhibidores del etileno. 2. Análisis estadístico. Se calculó la media y el error estándar para cada dato cuando se compararon los distintos antibióticos. Asimismo, se realizó un análisis de varianza para comparar el efecto de los tratamientos, realizando una transformación angular para los datos porcentuales previa al análisis de varianza. Cuando se obtuvo una F significativa, las medias se separaron por el test de Tukey. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Los cuatro antibióticos estudiados han tenido un efecto muy diferente sobre la regeneración en hojas de albaricoquero (Fig. 1). Mientras que la kanamicina tuvo un efecto estimulador, con respecto al control, a bajas concentraciones, la paromomicina y la estreptomicina produjeron una disminución progresiva de la regeneración al aumentar la concentración de antibiótico. La geneticina, por otro lado, fue letal a todas las dosis estudiadas, incluso a dosis muy bajas (0.75 µM). Las concentraciones inhibitorias de los otros tres antibióticos también variaron ampliamente, siendo (en µM) de 20 en el caso de la paromomicina, 40 para la estreptomicina y para la kanamicina, que aun a concentraciones de 25 y 35 permitió la aparición de algunas yemas. El caso de la kanamicina merece un estudio detallado por el incremento inducido en la regeneración a la concentración de 8.6 µM pero también por inducir una aparición más rápida de las yemas adventicias. La figura 2 muestra las frecuencias acumuladas de yemas aparecidas desde la 3ª a la 8ª semana desde el inicio de los experimentos. Se puede observar que en los tratamientos en los que se incluyó kanamicina a bajas concentraciones, la mayoría de las yemas (más del 75%) habían aparecido 4 semanas después de comenzar el experimento, mientras que en el resto de tratamientos, al igual que en el control (condiciones de cultivo estándar como se describen en Pérez-Tornero et al., 2000) niveles similares se alcanzan, al menos, una semana más tarde. Otros factores que estimularon la regeneración, como son los inhibidores o competidores del etileno (aminovinilglicina y tiosulfato de plata, respectivamente) cuando se utilizaron en ausencia de kanamicina no producen el mismo efecto de adelanto de la aparición de yemas adventicias (Fig. 2). Como conclusión, de los antibióticos ensayados solo la geneticina tiene un efecto excesivamente letal para ser utilizado como agente de selección. La kanamicina presenta una serie de ventajas a bajas concentraciones que podrían ser una dificultad a la hora de utilizarlo como agente de selección en experimentos de transformación. Estudios adicionales después de transformar las hojas son necesarios para poder determinar el antibiótico más adecuado. Agradecimientos Esta investigación ha sido financiada por el proyecto CICYT AGL2002-01556. Referencias Burgos, L. and Alburquerque, N. 2003. Low kanamycin concentration and ethylene inhibitors improve adventitious regeneration from apricot leaves. Plant Cell Rep. 21:1167-1174. Pérez-Tornero, O. and Burgos, L. 2000. Different media requirements for micropropagation of apricot cultivars. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 63: 133-141 Pérez-Tornero, O., Egea, J., Vanoostende, A. and Burgos, L. 2000. Assessment of factors affecting adventitious shoot regeneration from in vitro cultured leaves of apricot. Plant Sci. 158:61-70. Tabla 1. Porcentajes de regeneración obtenidos de diferentes experimentos independientes con kanamicina (Km) y tiosulfato (STS). Tratamiento Control1 Km (8.6µM) STS (60µM) Km + STS 1 1 34,3a 77,1b 57,1ab 60,0b Experimentos independientes2 2 3 4 5 21,4a 26,5a 74,3b 80,0b 27,3a 17,6a 77,1b 82,8b 35,7a 51,4ab 77,1b 51,4a 17,1a 37,5b 77,1c 65,7c 6 7 28,6a 30,1a 48,6b 57,1b 46,4a 42,5a 57,1a 54,3a Condiciones de regeneración en el control según Pérez-Tornero et al. (2000). En cada columna, letras diferentes a continuación de las medias indican diferencias significativas a P=0,05. 2 60 50 Kanamicina Paromomicina 40 30 Regeneración (%) 20 10 0 50 Estreptomicina Geneticina 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40 0 10 20 30 40 50 Concentración de antibióticos (M) Fig. 1. Efecto de diferentes antibióticos sobre la regeneración en albaricoquero. Las barras verticales indican el error estándar. Frecuencias acumuladas (%) 100 80 60 40 20 0 Control STS Km STS + Km Tratamientos Fig. 2. Frecuencias acumuladas de aparición de yemas adventicias (semanas 3 a 8) obtenidas con kanamicina (Km) y tiosulfato (STS).