QUÍMICA BIOLÓGICA - 2004 ESPECTROFOTOMETRÍA

QUÍMICA BIOLÓGICA - 2004
ESPECTROFOTOMETRÍA
1) El coeficiente de extinción del NADH a 340 nm es de 6.22 mM-1.cm-1. Calcular las concentraciones de las
soluciones de NADH cuando los valores de absorbancia obtenidos son: a) 0.6; b) 0.15. Exprese los
resultados en nM y mM.
2) La citosina posee un coeficiente de extinción molar de 6.103 M-1.cm-1 a 270 nm a pH 7.0. Calcule la
absorbancia y el porcentaje de transmitancia de soluciones 10 nM y 1 mM en cubetas de 1 cm y 1 mm.
3) Una solución que se encuentra en una cubeta de 1 cm de espesor contiene 2 g/l de una sustancia absorbente
de luz y transmite el 75 % de la luz incidente a una determinada longitud de onda. Calcular la absorbancia
de una solución que contenga a) 4 g/l; b) 1 g/l. Si el peso molecular del compuesto es 250, calcule el
coeficiente de extinción molar.
4) Una solución de proteína (0.3 ml) fue diluida con 0.9 ml de agua. A 0.5 ml de esa solución diluida se le
agregaron 4.5 ml del Reactivo de Biuret y se esperó hasta que se coloreó. La absorbancia de la mezcla a 540
nm fue de 0.18 en un tubo de ensayo de 1 cm de diámetro. Una solución standard (0.5 ml conteniendo 4 mg
de proteína/ml) a la que se agregaron 4.5 ml del Reactivo de Biuret dio una absorbancia de 0.12 en un tubo
de ensayo de iguales características. Calcular la concentración de proteína en la solución desconocida.
5) Calcular las concentraciones de los compuestos A y B en una solución dada si la absorbancia de esta
solución en una cubeta de 3 cm de espesor es 0.62 a 450 nm y 0.54 a 485 nm.
Los coeficientes de extinción molar de los compuestos son:
Compuesto A
 (450 nm) = 12000 M-1.cm-1 y  (485 nm) = 4000 M-1.cm-1
Compuesto B
 (450 nm) = 5000 M-1.cm-1 y  (485 nm) = 11600 M-1.cm-1.
6) El ácido pirúvico puede determinarse colorimétricamente por conversión en su 2,4-dinitrofenilhidrazona
seguido de la adición de álcali. La reacción se llevó a cabo en un volumen final de 3 ml, con soluciones que
contenían diversas cantidades de ácido pirúvico, obteniéndose los siguientes resultados:
Ac. pirúvico (µg)
Lecturas
20
0.130
40
0.257
60
0.390
80
0.515
100
0.628
125
0.750
150
0.855
Se analizaron por este método una serie de soluciones desconocidas de ácido pirúvico y una solución patrón
conteniendo 50 µg de ácido pirúvico. Las lecturas obtenidas para las soluciones desconocidas fueron:
a) 0.280; b) 0.555; c) 0.690; d) 0.773; e) 0.919 y para la solución patrón la lectura obtenida fue 0.325.
Grafique la curva de calibración con los resultados mostrados en la tabla. Calcule la concentración de las
soluciones desconocidas usando la curva previamente realizada y el valor de la solución patrón como único
dato. Compare los resultados.
7) El envenamiento por plomo provoca un aumento de la excreción diaria de coproporfirina que puede medirse
fluorométricamente en orina (excitación a 450 nm, medida de fluorescencia a 595 nm). Una muestra de 0.5
ml de orina (diuresis 24 hs = 800 ml) de un caso sospechoso de envenenamiento por plomo fue tratada
adecuadamente y diluida hasta 25 ml para medir fluorescencia. Se obtuvieron los siguientes datos: Id = 40;
Ib = 5; Is = 80. Como standard interno se usó 1.25 µg de coproporfirina/25 ml. ¿Cuál es la excresión diaria
de coproporfirina del paciente (valor normal 75 a 300 µg/día).
Ib: Intensidad de fluorescencia del blanco; Id: Intensidad de fluorescencia de la solución desconocida más
el blanco; Is: Intensidad de fluorescencia del standard interno más la solución desconocida más el blanco.
1
AMINOÁCIDOS
1) Cada uno de los grupos ionizables de un aminoácido tiene dos estados posibles de ionización: cargado y no
cargado (por ejemplo, -COOH, -COO-). Por lo tanto una molécula con n de tales grupos tiene 2n estados
posibles de ionización. a) Escriba los cuatro estados posibles de ionización del aminoácido Ser. b) A simple
vista, indique cuál estado de ionización predomina a valores de pH=1, pH=3, pH=pI, pH=7, pH=11.
2) a) Una mezcla de los siguientes aminoácidos se somete a electroforesis en papel a pH=3,9: Ala, Ser, Phe,
Leu, Arg, Asp, e His. ¿Cuál irá hacia el ánodo (positivo)? ¿Cuál irá hacia el cátodo (negativo)? b) A
menudo los aminoácidos con cargas idénticas se separan ligeramente durante la electroforesis en papel: por
ejemplo la Gly se separa de la Leu. ¿Puede sugerir una explicación para esto?
3) El grupo -amino de la Lys tiene un pKa de 10,5. a) ¿Qué fracción de estos grupos estará protonada (es
decir, -NH3+ en vez de -NH2) en una solución diluida de Lys a pH=9,5? b) ¿A pH=11.0? c) Explique por qué
el pKa del grupo -amino es mayor que el de un grupo -amino.
4) Una gota de solución conteniendo Gly, Ala, Glu, Lys, Arg, His, se colocó en el centro de papel para
electroforesis y se secó. El papel se impregnó con buffer a pH=6 y se aplicó un campo eléctrico. ¿Qué
aminoácidos se moverán al ánodo, cuáles al cátodo y cuáles no se moverán?
PÉPTIDOS
1) ¿Cuál de los siguientes oligopéptidos es más soluble en agua?
a) Phe20 o Gly20; b) Asp20 o Glu20 a pH = 6.0; c) Phe20 o Tyr20
2) Escriba en fórmulas el pentapéptido Phe-His-Met-Leu-Asp. Sometido el mismo a una electroforesis, ¿hacia
qué electrodo migrará, a pH = 7? y a pH = 2? Considere los siguientes valores de pKa: -NH2 = 10.0 ; -COOH =
2.3 ; His = 6.0 ; Asp = 4.0.
3) Escriba en fórmulas el hexapéptido Tyr-Ala-Arg-Pro-Glu-Ile. Calcule su punto isoeléctrico. Indique en cada
caso si el aminoácido es polar, apolar, ácido, básico, alifático, aromático, etc. Considere los siguientes
valores de pKa: -NH2 = 9.5; Tyr = 10.0; Arg = 12.5; Glu = 4.2; -COOH = 2.2.
4) Un tetrapéptido de punto isoeléctrico 7,7 posee un único aminoácido cargado en su estructura. Considere los
siguientes valores pKa COOH :2,3; NH2 :9,5. a) Prediga el pKa del grupo lateral de dicho aminoácido;
b) En base al dato anterior deduzca de qué aminoácido se trata y escriba su fórmula estructural; c) Enuncie
qué propiedad especial tiene el aminoácido en cuestión.
Escisión específica de cadenas polipeptídicas
H H
H H
N C C N C C
R1 O
R2 O
Aminoácido 1
Método
Tripsina
Quimotripsina
Termolisina
Bromuro de cianógeno
V8
Carboxipeptidasa
Aminoácido 2
Enlaces peptídicos escindidos
Aminoácido 1 = Lys o Arg
Aminoácido 1 = Phe, Trp o Tyr
Aminoácido 2 = Leu, Ile o Val
Aminoácido 1 = Met
Aminoácido 1 = Glu o Asp
Aminoácido 2 = COO- terminal libre
2
5) Considere el péptido cuya estructura primaria aparece en la figura: a) ¿Qué fragmentos son producidos por la
digestión con tripsina? b) ¿Qué fragmentos son producidos por la digestión con tripsina después de la
reducción y la alquilación del enlace disulfuro? c) ¿Qué fragmentos son producidos por la digestión con
termolisina?
Ala-Val-Lys-Leu-Phe-Arg-Cys-Tyr
|
S-S
|
Glu-Met-Lys-Val-Trp-Gly-Cys-Ala
6) Ud. aísla un péptido del cerebro que posee la propiedad de unirse a receptores del opio. Su intención es
encontrar la estructura primaria del péptido aislado. Para ello recurre a métodos utilizados en la química de
péptidos y encuentra que: a) Luego de la hidrólisis ácida del péptido, la composición en aminoácidos es:
Arg(1) Phe(2) Gly(2) Met(1) Tyr(1). b) El tratamiento del péptido con quimotripsina generó un aminoácido
libre, Phe y dos péptidos cuya composición en aminoácidos resultó: Gly(2) Tyr(1) y Arg(1) Phe(1) Met(1).
c) El tratamiento del péptido con Bromuro de cianógeno, seguido de separación cromatográfica de los
productos, arroja la presencia de dos péptidos cuya composición en aminoácidos resulta ser: Arg(1) Phe(1)
Met(1) y Gly(2) Phe(1) Tyr(1). Cuando ambos péptidos fueron tratados con Cloruro de dansilo, solamente
se encontró Phe dansilada. Deduzca Ud. la secuencia del péptido.
7) En base a los datos que se detallan, determine la estructura de un antibiótico polipeptídico del Bacilus brevis.
Este antibiótico forma complejos con iones metálicos y aparentemente destruye el transporte iónico a través
de las membranas, matando a ciertas especies bacterianas. En el análisis de la estructura Ud. encuentra que:
a) La hidrólisis ácida completa del péptido seguida del análisis de aminoácidos dio cantidades
equimoleculares de Leu, Pro, Phe, Orn, Val. b) La medida del PM dio 1200 aprox. c) No se hidrolizó con
Carboxipeptidasa. d) El tratamiento del péptido con Fluorodinitrobenceno seguido de hidrólisis completa y
cromatografía no generó ningún derivado dinitrofenilado en N alfa. e) La hidrólisis parcial del péptido
seguida de separación cromatográfica y secuenciación generó los péptidos siguientes:
Deduzca la secuencia del péptido
Leu-Phe
Phe-Pro
Val-Orn-Leu
Phe-Pro
Orn-Leu
Phe-Pro-Val
Val-Orn
Pro-Val-Orn
8) En el análisis de la estructura de un péptido Ud. encuentra que: a) La hidrólisis ácida total seguida del análisis
de aminoácidos dio la siguiente composición: Arg, Met(2), Lys, Val, Glu, Asp, Phe, Tyr(2). b) La reacción
de dansilación dio negativa. c) El tratamiento del péptido con tripsina, seguido de separación cromatográfica
de los productos arroja la presencia de dos péptidos cuya composición en aminoácidos resulta ser: Arg, Met,
Phe, Glu, Asp y Met, Tyr(2), Val, Lys. d) La hidrólisis del péptido con quimotripsina generó tres péptidos
de composición: Tyr, Val; Glu, Lys, Asp, Phe y Met(2), Arg, Tyr. e) El tratamiento con V8 seguido de
hidrólisis completa y cromatografía generó Asp libre y Arg, Met(2), Tyr(2), Val, Glu, Phe, Lys. f) Por
último la hidrólisis con bromuro de cianógeno aportó dos péptidos cuya composición fue la siguiente: Met,
Arg, y Tyr(2), Val, Lys, Glu, Asp, Phe, Met. Deduzca la secuencia del péptido.
PROTEÍNAS
1) Mientras la mayoría de las bacterias mueren a temperaturas superiores a 50 °C, algunas especies termofílicas
sobreviven entre 70 y 80°C. ¿De qué modo(s) general(es) esperaría que las proteínas de las bacterias
termofílicas difieran de las proteínas análogas de las bacterias comunes?
2) Un análisis cuantitativo de aminoácidos revela que la Albúmina Sérica Bovina (BSA) contiene 0,62% en
peso de triptófano. PM Trp: 204. a) Calcular el PM mínimo de la BSA asumiendo que hay un solo residuo
de Trp por molécula de proteína; b) Considerando que el PM de la BSA determinado por cromatografía de
3
exclusión molecular fue 66 kDa, indique el número de residuos de Trp que contiene cada molécula proteica.
3) Suponga que le han dado cantidades pequeñas de tres proteínas desconocidas, A, B y C. Su instructor de
Bioquímica le informa que una proteína es predominantemente hélice alfa, otra hoja beta y la tercera de
triple hélice de colágeno. Su laboratorio está equipado con un analizador de aminoácidos.
Proteínas
Residuos no polares
Residuos polares
Glicina
Prolina + Hidroxiprolina
A
35
20
45
--
B
16
59
8
1
C
17
25
33
22
Asigne la estructura más probable para cada una de las tres proteínas.
4) Como parte de un proyecto de laboratorio de Bioquímica de pregrado, Ud. purificó tres polipéptidos de
aproximadamente igual peso molecular, a partir de plasma humano. Usando varias técnicas físicas Ud.
estableció que en sus estados nativos uno de los polipéptidos es monomérico (una molécula en forma de
cigarro), el segundo es monomérico y casi esférico y el tercero es la subunidad de un tetrámero de
subunidades idénticas. Su compañero de laboratorio determinó las composiciones aminoacídicas de las tres
proteínas. Sin embargo, cuando le trae los datos indicados en la TABLA, Ud. descubre que él no anotó la
posición correspondiente a cada proteína. Su profesor le dice que Ud. debería deducir cuál es cuál,
simplemente a partir de las mismas composiciones de aminoácidos. ¿Qué composición le asignaría a cada
proteína y por qué?
Proteína
Residuos polares
Residuos no polares
Glicina
Prolina + Hidroxiprolina
A
131
54
9
8
B
59
118
9
13
C
99
88
8
10
5) Un analista determinó la concentración de una solución pura de una proteína desconocida empleando el
método del Biuret y la absorbancia de 280 nm, utilizando para ambos procedimientos una solución de
albúmina sérica bovina de 0,5 mg/ml como patrón. Los resultados que obtuvo se muestran en las tablas
siguientes:
Método del Biuret
Alícuota
Cubeta(paso de luz)
Blanco de Rvos.
Lectura
Testigo(patrón)
50 µl
1 cm
0,080 UA
0,550 UA
Muestra Incógnita
40 µl
1 cm
0,080 UA
0,350 UA
Absorbancia a 280 nm
Cubeta (paso de luz)
Lectura
Testigo
0,5 cm
0,310 UA
Muestra Incógnita
0,5 cm
0,285 UA
a) Calcule la concentración proteica por ambos métodos. b) Interprete los resultados considerando errores
experimentales inferiores al 10 %.
6) El análisis del PM de una proteína suministra la siguiente información:
4
Solvente
Buffer
Cloruro de Guanidina
Cloruro de Guanidina + 2-Mercaptoetanol
PM
200.000
100.000
25.000 + 75.000
Teniendo en cuenta que el cloruro de guanidina es un agente caotrópico (desnaturalizante) y el 2mercaptoetanol es un agente reductor, caracterice la estructura cuaternaria de esta proteína.
7) El desplegado de la hélice alfa de un polipéptido para formar un ovillo al azar está acompañado por un gran
descenso de la rotación específica de la luz polarizada. Estudiando a los péptidos poliglutamato y polilisina
se obtuvo la siguiente gráfica:
a) Asigne cual de los gráficos corresponde a cada péptido. Prediga las conformaciones de la poliLys y el
poliGlu a pH 2 y 12. b) Explique el efecto de los cambios de pH en la conformación de los péptidos. c) ¿Por
qué las transiciones conformacionales ocurren en un rango tan estrecho de pH?
8) Un investigador purifica una proteína monomérica estructural de músculo a homogeneidad. Con el objeto de
determinar la concentración de la solución obtenida, aplica el método de Sedmark y Grossberg sobre 0.5 ml
de la solución proteica y sobre 0.1 ml de un testigo de albúmina, obteniendo valores de absorbancia
(Abs620/Abs465) de 0.2 y 0.3, respectivamente. La solución de albúmina usada como testigo presentó un
valor de absorbancia a 280 nm de 0.05 (280 = 6.65 (g%)-1 cm-1). a) Exprese la concentración de la proteína
purificada por el investigador en µM, sabiendo que el PM de la misma es 25.000 Da. b) Alícuotas de 1.0
ml de la solución proteica purificada son sometidos a oxidación o reducción, y luego incubadas con un
reactivo específico de restos sulfhidrilos (-SH) (Eosin-5-maleimida, 523 = 85.000 M-1 cm-1), que reacciona
en relación estequiométrica 1:1 con los mismos. Luego de que las alícuotas reaccionan totalmente con el
reactivo, se las dializa y se realizan medidas de absorbancia a 523 nm, obteniéndose valores de absorbancia
de 0.034 (proteina oxidada) y 0.105 (proteína reducida). Indique cuántos moles de residuos de cisteína
reaccionan por mol de proteína. ¿A qué se debe la diferencia de absorbancia obtenida en las distintas
condiciones?.
SEPARACIÓN DE BIOMOLÉCULAS
1) Mezclas de aminoácidos son analizadas separándolas en una resina de poliestireno conteniendo residuos
sulfonato. Considerando que las causas determinantes de la retención son: a) interacción iónica;
b) interacción hidrofóbica entre los grupos laterales hidrocarbonados de los aminoácidos y la resina. ¿Cuáles
aminoácidos eluirán primero para cada par descripto al lavar con buffer pH = 7?
1) Asp - Lys; 2) Arg - Met; 3) Gly - Leu
2) La cromatografía de filtración en gel o de tamiz molecular es un método de separación proteica basado en
sus tamaños (o, más precisamente, en sus radios efectivos en solución, los cuales son proporcionales, para
proteínas esféricas, a la raíz cúbica del peso molecular). Una solución proteica se coloca en una columna
empacada con pequeñas esferas de polímeros suficientemente hidratados y entrecruzados (Sephadex). Las
proteínas de tamaños diferentes varían en su capacidad de penetrar los poros hidratados de las esferas. Las
5
proteínas más pequeñas penetran mas rápidamente estos poros y a medida que bajan en la columna lo hacen
más lentamente que las proteínas de mayor tamaño. Una segunda técnica de separación de proteínas es la
electroforesis en gel de poliacrilamida donde las proteínas se someten a un campo eléctrico. Cuando se lleva
a cabo la electroforesis en presencia de un agente desnaturalizante, el dodecil sulfato de sodio (SDS), las
moléculas proteicas se separan por tamaño, las más pequeñas migran más rápidamente. (El SDS
desnaturaliza las proteínas uniéndose a ellas en forma no específica y dándoles una relación constante de
carga/masa).
Ambos procedimientos separan las proteínas con base en el tamaño y utilizan polímeros entrecruzados como
medio de soporte. ¿Cómo es posible que en la filtración en gel, las moléculas pequeñas se retardan con
respecto a las mayores, mientras que en electroforesis en gel de poliacrilamida ocurre lo contrario?
3) Usted tiene una mezcla de tres proteínas A, B, C, con pI de 3.5, 6.5 y 10 respectivamente y quiere separarlas
por una columna de DEAE-celulosa. Teniendo en cuenta que el grupo DEAE tiene un pK = 9,5. ¿Qué pH
usaría para la separación? ¿Qué orden de elución esperaría encontrar eluyendo con un gradiente de KCl
entre 0 a 1 M?
4) La Carboximetilcelulosa es una resina de intercambio catiónico con un pKa de 4.5. Ud. tiene tres proteínas
A, B y C de pI 5, 8 y 10 (no estrictamente en ese orden). Al sembrarlas en esta resina y eluir con un
gradiente de pH de menor a mayor eluyeron en el siguiente orden: B A C. Estas mismas proteínas, en una
columna de Sephadex G-100 eluyeron cómo de un peso molecular 50.000, 100.000 y 75.000 y en el
siguiente orden: A, B y C. En un gel con SDS A y C presentaron una única banda de PM 50.000 y B
presentó dos bandas de PM 50.000 y 25.000. Identifique A, B y C.
5) Un péptido aislado de cerebro tiene la siguiente secuencia:
Lys-Ser-His-Glu-Leu-Asp-Pro-Tyr-Glu-Gly
a) Determine la carga neta de la molécula a pH=3, 8 y 12. b) Estime el punto isoeléctrico del péptido. c) Se
somete al péptido a la acción de la termolisina. Escriba la fórmula estructural de los péptidos resultantes.
d) Los péptidos obtenidos en el item anterior se someten a una cromatografía de intercambio iónico en
carboximetil-celulosa. Si la columna está equilibrada a pH=6, ¿qué péptido eluirá y cuál quedará retenido?
¿Cómo haría para eluir este último?
Considere los siguientes valores de pKa: Glu: 4.25; His: 6.0; Tyr: 10.7; Lys: 10.5; Asp: 3.9; -NH2: 9.5; COOH: 2.0
6) Tres proteínas de puntos isoeléctrico 5,2 ;7,3 y 6,3 se denominaron con las tres primeras letras del alfabeto
griego según su posición en un isoelectroenfoque, siendo alfa la más cercana al ánodo y gamma la más
cercana al cátodo. a) ¿Cuál es el pI de cada uno? b) ¿Cuál de las proteínas eluirá primero durante una
cromatografía en carboximetilcelulosa a pH 6? ¿Por qué? c) Si alguna proteína quedara retenida, ¿cuál o
cuáles serían y cómo las eluiría? d) Durante una electroforesis en poliacrilamida a pH 8, beta presentó la
mayor movilidad electroforética. ¿Es posible? ¿Por qué?
7) El cromatograma de una muestra de proteínas en Sephadex G-200 fue el siguiente:
Gliceraldehído
Las proteínas marcadoras fueron las siguientes:
3-P-Deshidrogenasa
Concentración
de proteína
en el eluído
Aldolasa
Mioglobina
Catalasa
Ovoalbum.
175
213
234
244
285
Proteína
Aldolasa
Catalasa
Ovoalbúmina
Mioglobina
PM (x104)
16
6
4
1.6
N° de fracción
175
213
234
285
N° fracción
Se recogieron fracciones de 1,6 ml. y el volumen vacío de la columna previamemte determinado con azul de
dextrano fue de 200 ml. VT = 500 ml. Se quizo determinar el PM de gliceraldehído-3-P-dehidrogenasa.
Utilizando la misma columna, en las mismas condiciones se observó que la enzima apareció en la fracción
244.
Indique el peso molecular de la misma. Cómo procedería experimentalmente si quisiera estudiar la
estructura cuaternaria de dicha proteína?.
6
8) Una alícuota de 0.1 ml de una mezcla (5 ml) de triglicéridos y una proteína pura se agitó en benceno:agua
(3 ml:2 ml). a) En que fases se distribuyen los distintos componentes de la mezcla? Se sembró una alícuota de
la fase que contenía la proteína en una columna de Sepharosa 6-B previamente equilibrada. La curva de
calibración resultante se muestra a continuación. Se recogieron fracciones de 2 ml. Las proteínas marcadoras
fueron: A , B, C, D y E con pesos moleculares de 160, 90, 60, 40, 16 kDa, respectivamente. El valor de Kav
de la muestra se calculó en 2.8. Además, se corrió una electroforesis con SDS en las siguientes condiciones: I)
la proteína se hirvió previamente con DTT (agente reductor), II) la proteína se hirvió sin agente reductor. El
patrón electroforético se muestra en la Fig 2. b) Indique el peso molecular de la proteína nativa. c) Infiera la
composición cuaternaria de la proteína. Por otro lado se determinó la concentración de proteína por
absorbancia a 280 nm, utilizando un testigo de BSA de 0.5 mg / ml, con una alícuota de 1 ml y una cubeta de
0,5 cm de paso. Se obtuvo una Abs. de 0,4 para el testigo y de 0,295 para la muestra. d) Teniendo en cuenta
que toda la proteína pasó a la fase correspondiente, determine la concentración de la misma en la mezcla
original.
kDa
90
PM
II
I
60
2.4
2.2
40
2.0
Lo
g 1.8
PM
1.6
1.4
16
1.2
1.0
0.25
0.3
0.35
K av
0.40
0.45
Log PM (x 1000)
9) A) Usted copurificó 2 enzimas ( y ) que catalizan la misma ABS.
280 nm.
Con Glicerol
reacción (isoenzimas) y con el fin de separarlas utiliza una
Sin glicerol
columna de exclusión molecular en las siguientes condiciones:
i) en presencia de glicerol 20 % (un estabilizante de la
estructura cuaternaria) y ii) en ausencia de éste. Usted
determina el perfil de elución de estas proteinas a través de
absorbancia a 280 nm.
V. elución
3
Esta columna fue previamente
19
27 (ml)
7
calibrada con diferentes proteinas
generando la siguiente curva de calibración. a) Prediga cuál sería el peso
2
molecular y la probable estructura de ambas isoenzimas, sabiendo que  es la de
mayor peso molecular. b) ¿Qué otra técnica
1


utilizaría para confirmar este resultado o bien pH
para obtener más información? Explique.
9
0
0
10
20
30
Ve (ml)
8
Siembra
B) Ud. realiza un isoelectro-enfoque de las proteínas puras  y  7
determinando los puntos isoeléctricos de ambas proteínas. Usted sabe por 6
bibliografía que , tiene un rango de estabilidad de pH entre 6 y 11. 5
a) Como paso alternativo en la purificación de ambas proteínas ¿podría
usarse una columna de CM-celulosa (pKa=3.9) para separar ambas
proteínas? Si es así, explique qué pH usaría para equilibrar esta columna. b) ¿Cómo haría para eluírlas?
7
Abs 280 nm
10) Se purificó una proteína estructural a partir de dos bacterias (A y B) aislados
A
B
de diferentes fuentes. Con las proteínas purificadas se corrió una
+
+
electroforesis de poliacrilamida en presencia de SDS en las siguientes
condiciones, (+): la proteína se hirvió 10 minutos en presencia de 210
2-mercaptoetanol, (-): la proteína se hirvió 10 minutos sin agente reductor.
Luego de la corrida electroforética, el gel se tiño con Coomassie Blue y se
observó el patrón indicado. Por otro lado, las preparaciones proteicas se
sembraron en una columna de exclusión molecular. La masa molecular de 70
50
los marcadores utilizados para calibrar esta columna fueron: 30, 100, 210 y 30
440 kDa. El cromatograma obtenido es mostrado abajo. La proteína de
interés eluyó en ambos casos en la fracción 133. Se recogieron fracciones de
1,5 ml. a) Indique la masa molecular nativa de las proteínas aisladas.
b) Infiera la estructura de ambas proteínas c) considerando las estructuras propuestas en el ítem anterior, y
teniendo en cuenta que una de las bacterias fue extraída de una fuente termal, prediga cuál proteína fue
aislada de cada bacteria.
117
142
156
190
N° de Fracción
PROBLEMAS SUPLEMENTARIOS
1) El grupo g-carboxilo del Glu tiene un pKa de 4,3. a) ¿Qué fracción de estos grupos podría estar no protonada
(es decir -COO- en vez de -COOH) en una solución diluida de Glu a pH=5,0? b) ¿A pH=3,8? c) Explique
por qué este pKa es mayor que el grupo -carboxilo.
2) Escriba en fórmulas el siguiente péptido: Ile-Asn-Gly-His-Lys-Pro-Phe-Ala-Cys. Calcule su punto
isoeléctrico e indique cuáles de sus grupos R son alifáticos, aromáticos, ácidos, básicos, polares e
hidrofóbicos. Considere los siguientes valores de pKa: -NH2 = 9.5; His = 6.0; Lys = 10.5; Cys = 8.3; -COOH
= 1.7
3) Escriba la fórmula del pentapéptido Pro-Glu-Asp-Trp-Ser. Calcule su pI. Indique hacia qué electrodo
migrará cuando se lo someta a electroforesis a pH = 7 y pH = 2. Considere los siguientes valores de pKa: NH2 = 9, Glu = 4, Asp = 4, -COOH = 2
4) Ud. aisló de un homogenado de cerebro un péptido con actividad de encefalina (opioide). Estos se unen a
receptores localizados en el cerebro, que unen drogas derivadas del opio (morfina) que disminuyen el dolor.
Al analizarlo encuentra que: a) La hidrólisis completa en HCl 6 M, 110°C seguida del análisis de
aminoácidos indica la presencia de Gly, Leu, Phe y Tyr en una relación 2:1:1:1. b) El tratamiento del
péptido con 2,4-dinitrofluorobenceno seguido de hidrólisis completa y cromatografía indicó la existencia de
Tyr-DNP. No se encontró Tyr libre. c) La hidrólisis con quimotripsina seguida de cromatografía indicó la
presencia de Leu y Tyr libres, y un péptido cuya composición en aminoácidos indicó la presencia de Gly y
Phe en una relación 2:1. Determine la secuencia de esta encefalina.
5) Al analizar la estructura de un péptido se hallaron los siguientes datos: a) La reacción con fenilisotiocianato
no generó ningún derivado ferniltiocarbamilado. b) La hidrólisis con tripsina arrojó dos péptidos cuya
secuencia fue la siguiente: Cys-Thr-Asp-Ala-Arg y Ser-Met-Cys-Glu-Gly-Lys. c) El tratamiento con V8 y
posterior secuenciación de los péptidos formados arrojó: Ala-Arg-Ser-Met-Cys-Glu y Gly-Lys-Cys-ThrAsp. d) Cuando se trató el péptido con bromuro de cianógeno seguido de hidrólisis y cromatografía se
encontró un péptido con la siguiente composición: Cys(2), Met, Glu, Ser, Gly, Arg, Lys, Ala, Asp, Thr.
8
Deduzca la secuencia.
6) La escisión de un péptido con quimotripsina y termolisina rindió los péptidos cuya secuencias determinadas
por degradación de Edman se detallan a continuación:
Quimotripsina:
Gly-Leu-Ser-Pro-Phe
His-Thr-Asp-Val-Ser-Ala-Ala-Trp
Gly-Glu-Val-Gly-Ala-His-Leu-Gly-Glu-Trp
Gly-Ala-Glu-Ala-Thr-Glu
Termolisina:
Gly
Leu-Ser-Pro-Phe-His-Thr-Asp
Val-Ser-Ala-Ala-Trp-Gly-Glu
Val-Gly-Ala-His
Leu-Gly-Glu-Trp-Gly-Ala-Glu-Ala-Thr-Glu
En base a los datos, determine la secuencia del péptido original.
7) Suponga que desea purificar por cromatografía de intercambio iónico una enzima del metabolismo del ADN,
cuyo sustrato es ADN. ¿Seleccionaría una resina de intercambio aniónico o catiónico? ¿Por qué?
8) Al aumentar el gradiente salino, indique el orden de elución de las proteínas indicadas a partir de las
siguientes columnas de intercambio iónico: a) Citocromo c (pI = 10.5), lisozima (pI = 11), albúmina de
huevo (ovoalbúmina, pI = 4.6), mioglobina (pI = 7), de una columna de intercambio aniónico. b) Citocromo
c (pI = 10.5), pepsina (pI = 1), ureasa (pI = 5.0) y hemoglobina (pI = 6.8) de una catiónica. Explique sus
respuestas.
9) Se aisló el siguiente péptido con actividad biológica a partir de una cepa de un bacilo.
Leu-Asp-His-Phe-Met-Glu-Ile-Arg-Pro-Ala-Tyr
Se trató el péptido con BrCN y quimiotripsina. a) Indique que productos de hidrólisis se obtienen.
b) Escriba en fórmulas el péptido originado que contenga el COOH terminal del péptido original. c) Si los
péptidos obtenidos se someten a electroforesis, hacia que electrodo migrarán a pH 7. Considere los
siguientes valores de pKa: -NH2 10.0, -COOH 2.3, Asp 4.0, His 6.0, Glu 4.2, Arg 12.5, Tyr 9.5.
Posteriormente a la hidrólisis con BrCN y quimiotripsina, se trató con tripsina. Si los péptidos obtenidos se
someten a cromatografía de intercambio aniónico, ¿en qué orden eluirán si se aumenta la fuerza iónica a pH
7?
10) Las proteínas denominadas histonas juegan un papel clave en el empaquetamiento del DNA: éste se enrolla
alrededor de las histonas para formar los nucleosomas, partículas engarzadas como las cuentas de un collar.
Una mezcla de tres proteínas globulares, entre ellas la histona H4, presenta la siguiente composición de
aminoácidos:
Proteína
A
B
C
Asp y Glu
90
50
6
Número de Residuos
Arg, Lys e His
5
10
27
Otros AA
105
60
69
Mediante un isoelectroenfoque se determinaron los puntos isoeléctricos de las tres proteínas obteniéndose
los siguientes valores: 3,0; 5,5 y 9,5 (no respectivamente). Los pesos moleculares obtenidos por
cromatografía de exclusión molecular fueron de 15 kD, 11,3 kD y 21,5 kD. a) lndique el punto isoeléctrico,
el peso molecular y el orden de elución de la columna cromatográfica de las tres proteínas. b) ¿En qué
consiste la cromatografia de exclusión molecular y cómo se pueden obtener pesos moleculares a partir de
ella? c) En base a sus conocimientos, ¿podría decir cuál de las tres proteínas sería H4? Fundamente su
respuesta.
9
PROBLEMAS INTEGRADORES
1) Se aisló un peptido con actividad biologica a partir de una cepa de un bacilo:
Tyr-Gly-Arg-Ala-X-Val
a) Escriba la fórmula del aminoácido X si el pI del péptido es 6,7. b) Determine a que pH no migraría en
una electroforesis para X = Ser. c) Indique que fragmentos obtendria por digestion con: i)Termolisina para
X = Leu, ii) Quimotripsina para X = Phe. d) Los péptidos obtenidos en el item anterior (en ambas
digestiones) se ecuentran en una mezcla con un 3er péptido (Péptido A con pI = 5) Mediante que método
separaría el péptido A. Explique.
Aminoácido  Carboxilo  Amino Grupo R
Alanina
2.3
9.9
Glicina
2.4
9.8
Fenilalanina
1.8
9.1
Serina
2.1
9.2
Valina
2.3
9.6
Aspartico
2.0
10.0
3.9
Glutamico
2.2
9.7
4.3
Histidina
1.8
9.2
6.0
Cisteina
1.8
10.8
8.3
Tirosina
2.2
9.1
10.9
Lisina
2.2
9.2
10.8
Arginina
1.8
9.0
12.5
2) Usted recibe en su laboratorio una solución conteniendo el siguiente péptido:
Glu – Cys – Lys – Phe – Cys – Ala – Gli
S S
Para corroborar que realmente se trata de dicho péptido y para
chequear su pureza, decide realizar un isoelectroenfoque Aminoácido
Alanina
empleando 4 alícuotas que fueron sometidas a distintos
Glicina
procedimientos: A) en medio oxidante débil; B) en medio
reductor; C) en presencia de tripsina (escinde enlaces Fenilalanina
peptídicos del lado carboxilo de Lys o Arg); D) en presencia Glutamico
de tripsina en medio reductor. En base a estos datos prediga
Cisteina
cuales serán los resultados obtenidos al sembrar las 4 alícuotas
Lisina
en un gel de isoelectroenfoque y esquematice el patrón de
bandas que observaría finalizada la corrida electroforética en cada caso.
Justifique su respuesta.
 Carboxilo  Amino
2.3
9.9
2.4
9.8
1.8
9.1
2.2
9.7
1.8
10.8
2.2
9.2
Grupo R
4.3
8.3
10.8
3) La concentración de una solución de proteína purificada fue determinada por Absorbancia a 280 nm y por
Biuret, utilizando en ambos casos albúmina sérica bovina como testigo. Se obtuvieron valores de 3,2 y 4,1
mg/ml, respectivamente. Como el investigador sabía de la presencia de dos átomos de Fe en la estructura de la
molécula, sobre una alícuota de 5 ml, midió la presencia de 9,8 g de metal. Indique el PM más probable de
la proteína en estudio considerando que el átomo de Fe tiene un P atómico de 56. Justifique su respuesta.
4) Una nueva deshidrogenasa aislada de una bacteria termofílica presenta un porcentaje en peso de triptofano
de 0,8870,001. Si la masa molecular aproximada observada en geles de poliacrilamida desnaturalizantes
fue de 120.000, podría Ud. indicar un peso molecular más exacto conociendo los siguientes pesos atómicos:
C=12, H=1, O=16, N=14.
5) Una proteína de PM=30.000 Da aproximadamente estimado por cromatografía de exclusión molecular, no
reacciona con el reactivo de grupos SH iodoacetamida. Sin embargo si se realiza una electroforesis en gel en
condiciones desnaturalizantes luego de calentar la proteína en presencia de mercaptoetanol y SDS, muestra
10
una banda estimada en 18.000 Da. Curiosamente no presenta residuos de metionina, mientras que el análisis
elemental había indicado un contenido de azufre (PA= 32) de 0,39%. a) Sugiera un PM más aproximado
para la proteína nativa. b) Indique una posible estructura de la misma.
6) Una proteína bacteriana purificada y de PM conocido se sometió a una filtración por gel. Se recogieron
fracciones de 2,5 ml y la proteína eluyó en la fracción 8. Previamente se determinó que las proteínas
marcadoras de 6, 35 y 250 KD eluyeron en las fracciones 5, 10 y 14. El Vo determinado con azul de
dextrano fue de 1,8 ml, y el Vt de 45 ml. a) ¿Cuál es la masa aparente de la proteína bacteriana purificada? .
b) Para determinar la concentración de la proteína pura se diluye 1:100 la muestra y se ensaya una alícuota
de 20 l por el método de Bradford dando una absorbancia de 0,25 descontado el blanco. Como testigo se
utilizaron 40 l de BSA 1mg/ml (PM 66 kDa) y se obtuvo una absorbancia de 0,85. Exprese la
concentración en g/l de la proteína en la muestra. c) La proteína se digiere con bromuro de cianógeno y se
purifica un decapéptido por cromatografía en fase reversa de composición: Met(1); Glu(2); His(1); Ala(3);
Gly(2); Ser(1). Determine su punto isoeléctrico e indique que método podría utilizar para separarlo de otro
péptido de punto isoeléctrico igual a 10. Considere pKaGlu=4.3; pKa(His)=7.3; pKa(COO)=4.0;
pKa(NH2)=9,2.
FIG 2
LogPM(KDa)
7)
1.7cm
3.7cm
6cm
Le han entregado una muestra
Distancia PH
desde
supuestamente pura de la proteína
el ánodo
monomérica lactato deshidrogenasa.
(cm)
Para establecer su PM inyecta la
2
6
8.5
muestra en una columna de Sephacryl
5.5
8.0
(exclusión molecular) y obtiene un
5.0
7.6
único pico a un Ve de 34 ml, el cual es
4.5
7.1
comparado con los datos obtenidos
1
SDS-PAGE
4.0
6.4
para las proteínas marcadoras
IEF
3.5
6.0
FIG 1
Ve (ml)
(fig1). Como paso siguiente realiza
3.0
5.6
una electroforesis en dos dimensiones de la muestra y
2.5
5.4
luego de tinción por azul de Coomassie para proteínas totales, obtiene el resultado indicado
2.0
4.5
en la fig 2. Para calcular el pI grafica los valores de pH del gel en función de la distancia 1.5
4.0
desde el ánodo según los datos de la tabla. En base a estos experimentos: a) Exprese el PM 1.0
3.4
aparente de la proteína. b) ¿A qué puede deberse el resultado obtenido en base al gel 2D. 0.5
3.0
¿Qué puede decir acerca de su muestra?. ¿Podría calcular el pI de la lactato deshidrogenasa?
Calcule un valor probable. c) ¿Agregaría algún paso en la purificación de la lactato deshidrogenasa? ¿Cúal?
24
26
28
30
32
34
36
38
40
8) Se aislaron 2 isoenzimas (A y B) a partir de 2 bacterias provenientes de distintas fuentes. Con el fin de
caracterizarlas se llevó a cabo una columna de exclusión molecular en presencia y ausencia de glicerol. En
ambas condiciones la proteína A presentó un volumen de elución (Ve) de 16 ml, mientras que la proteína B
presentó Ve de 16 ml y 26 ml en presencia y ausencia de glicerol, respectivamente. La curva de calibración
obtenida con diferentes marcadores de masa molecular se indica en el gráfico. Además, se corrió un gel de
poliacrilmida en presencia de SDS en las siguientes condiciones: 1) hirviendo las proteínas con DTT (agente
reductor), 2) sin DTT. El patrón electroforético obtenido se muestra en la figura. Con todos los datos
obtenidos determine las posibles estructuras cuaternarias de ambas isoformas.
La concentración de proteína determinada por Bradford considerando la masa molecular nativa fue de
0,25 µM para ambas preparaciones. Alícutas de 1,5 ml de las soluciones proteicas fueron sometidas a
oxidación y reducción, y luego se incubaron con Eosin-maleimida (compuesto que reacciona en relación
estequeométrica 1:1con grupos SH-, 523= 85000 M-1 cm-1). Luego de que las alicuotas reacionan totalmente
con el reactivo, se las dializa y se realizan medidas de absorbancia. Las medidas de absorbancia a 523 nm de
las formas nativas de las enzimas fueron 0,042 para A y 0 para B. Mientras que las formas reducidas de
ambas proteinas presentaron un valor de absorbancia de 0,085. Indique el estado redox de las Cys presentes
en cada proteína y la posible disposición de los puentes disulfuro.
11
+DTT
A
2.4
2.2
-DTT
B
A
B
9
0
6
0
0
4
0
2.0
1.8
Log PM
1.6
1.4
1.2
1
6
1.0
0
10
20
30
Ve
40
9) Ud. recibe una muestra pura de proteína y procede a determinar su concentración por el método de
Bradford. Prepara 2 ml de un testigo de albúmina pesando 2 mg de la misma. Toma 5 l de esta solución y
la diluye hasta 500 l de agua destilada y utiliza 150 l de esta solución como testigo obteniendo una
absorbancia a 610 nm de 0,22. Para 25 l de la solución proteica en estudio se obtiene una abs de 0,25.
Cuando se realiza una electroforesis en condiciones nativas se obtiene un PM de 600.000 daltons, mientras
que cuando se prepara la muestra con cloruro de guanidina se obtiene una única banda de 150.000 daltons.
El mismo resultado es obtenido si, además, la muestra se trata con 2-mercaptoetanol. Una alícuota de 1,2
ml de la solución proteica se incubó con eosinmaleimida (reacciona con grupos -SH, 523= 85.000 M-1 cm-1
) obteniéndose, luego de diálisis exhaustiva, un valor de absorbancia a 530 nm de 0,0384. Posteriormente,
se trató una alícuota de 1,5 ml de la proteína con un agente reductor y luego con eosinmaleimida,
obteniéndose, en este caso, un valor de absorbancia a 530 nm de 0,1153 luego de diálisis exhaustiva de la
muestra. a) Exprese la concentración de la proteína en M. b) Indique la estructura cuaternaria de la
proteína señalando el estado de óxido-reducción de cada Cys y el número de Cys por molécula.
10) Una mezcla de dos proteínas se sembró en una columna cromatográfica y se obtuvo el perfil de elución
mostrado. Las dos fracciones correspondientes a los máximos de los dos picos (n° 10 y 26) se sometieron a
ensayos de Gornall (0,2 ml muestra + 0,8 ml de H2O + 4 ml de reactivo) y Bradford (0,1 ml muestra + 0.4
ml de H2O + 0,5 ml de reactivo) para medir la concentración de proteínas, dando los resultados mostrados
en la tabla.
0.4
Gornall (Abs
530nm)
0.01
0.6
10
26
0.35
Bradford (Abs
595nm)
0.2
1.2
Abs 280 nm
Fracción
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
0
5
10
15
20
25
30
35
N fracción
a)Utilizando las siguientes curvas de calibración calcule las concentraciones de proteínas en mg/ml de las
dos fracciones mencionadas. Si esto no fuera posible, explique como procedería experimentalmente para
determinar la concentración de proteínas en dicho caso. b)La muestra con mayor concentración de
proteínas es la que presenta mayor absorbancia 280nm? Explique esta aparente contradicción.
Bradford
Gornall
0.30
0.5
0.25
0.4
Abs 595
Abs 530
0.20
0.3
0.2
0.15
0.10
0.1
0.05
0.00
0.0
0
500
1000
1500
2000
2500
0
3000
5
10
15
20
proteina (g)
proteina (g)
12
25
30
35