ANEXO PRÁCTICA NÚM

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE
BIOTECNOLOGÍA
ANEXO PRÁCTICA NÚM. 1
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA METODO DE MICROKJELDAHL
FUNDAMENTO DEL METODO
La muestra se disuelve en ácido sulfúrico concentrado y se calienta con la
finalidad de que la materia carbonosa se libere en forma de CO 2, los minerales se
sulfaten y el nitrógeno se transforme en sulfato de amonio.
Como catalizador se utiliza CuSO4, puede usarse sales de Hg, Zn, Se, pero estos
dos últimos son muy caros y el Hg es tóxico. El K 2SO4 sirve como elevador de la
temperatura de ebullición (no es catalizador), por cada 10o C de elevación de la
temperatura, la velocidad del reacción se duplica.
El ataque finaliza cuando la solución se torna de un color verde-esmeralda
límpido. En este proceso de digestión o taque de la muestra, se libera en la
digestión la grasa, fibra, carbohidratos presentes en la muestra en forma de CO 2;
la parte oxigenada de la proteína también se libera, sólo queda la parte
nitrogenada de la proteína. Al final del ataque, se tiene en la solución H 2SO4
sobrante, sales sulfatadas de los minerales disueltos y el sulfato de amonio.
En el proceso de destilación, se añade al balón de Kjeldhal 500 ml de agua con la
finalidad de diluir al ácido sulfúrico remanente, a la vez que el sulfato de potasio,
sulfato de cobre y sulfato de amonio disueltos precipiten, dejando libre en la parte
superior el H2SO4 sobrante es decir hay formación de dos fases. Luego se añaden
algunas granallas de zinc con la finalidad de evitar la ebullición tumultuosa
creando núcleos de vaporización. Inmediatamente después de este paso se
adiciona la soda cáustica por los bordes del balón para evitar una reacción
violenta con el ácido sulfúrico remanente y el (NH4)2SO4. La adición de la soda
neutraliza la acción del ácido sulfúrico sobrante, favorece la liberación del
amoníaco en forma de NH4OH que será recibido en el vaso erlenmeyer que
contiene la solución de ácido bórico.
Inicialmente al producirse el calentamiento desaparecen las dos fases, se forma
una solución de color celeste-oscuro, luego al ebullir se torna color marrón debido
a la presencia de un complejo cúprico, que desaparece a medida que se libera el
amoníaco. El amoniaco es captado por la solución de H3BO3, que forma un
complejo estable, esto se observa debido al cambio de color que experimenta la
solución progresivamente, a medida que es captado por el ácido bórico; esto es
visible gracias al indicador rojo de metilo, pudiéndose usar otro indicador según el
rango de viraje.
MANUAL DE PRÁCTICAS DE
FISIOLOGIA DE LA NUTRICIÓN
Posteriormente, se determina por titulación con HCL 0.1 N hasta cambio de color,
en este caso, amarillo a rojo-grosella, el volumen gastado de ácido y se procede
con los cálculos.
Este método de análisis es aplicable a todo tipo de alimento en general, si el
alimento ha sido enriquecido con urea, la expresión del resultado es engañosa.
Material y Equipo
Matraces de Kjeldahl de 30 ml
Matraces de Erlenmeyer de 125 ml
Pipetas serológicas de 1 y 10 ml
Buretas
Reactivos
Ácido sulfúrico concentrado
Oxido de mercurio
Sulfato de potasio
Solución de hidroxido-tiosulfato de sodio: disolver 60 g de hidroxido de sodio y 5 g
de tiosulfato de sodio pentahidratado en agua y diluir a 100 ml.
Ácido bórico al 4% (p/v)
Ácido clorhídrico 0.1 N (estandarizado)
Solución indicadora (1) ó (2):
(1) Rojo de metilo-azul de metileno: Mezclar dos partes de una solución
alcohólica de rojo de metilo 0.2% con una parte de una solución alcohólica
de azul de metileno al 0.2%.
(2) Rojo de metilo- verde de bromocresol. Mezcla una parte de una solución
alcohólica de rojo de metilo 0.2% con 5 partes de una solución alcohólica
de verde de bromocresol 0.2%.
MANUAL DE PRÁCTICAS DE
FISIOLOGIA DE LA NUTRICIÓN
Determinación
(1) Pesar la cantidad de muestra que consuma en la titulación de 3 a 10 ml de
HCl 0.1N (10 a 100 mg de muestra seca), en papel libre de nitrógeno y
transferir a un matraz de microkjeldahl.
(2) Adicionar 1.9 + 0.1 g de K2SO4, 40 + 10 mg HgO, y 2.0 + 0.1 ml de H2SO4
(densidad especifica 1.84). Si la muestra es mayor a 15 mg, añadase 0.1 ml
adicional de H2SO4 por cada 10 mg más de muestra.
(3) Agregar perlas de ebullición que pasen por un tamiz número 10.
(4) Si el tiempo de ebullición es de 2 a 2.5 min., debe digerirse por una hora
después de que se halla destilado toda el agua y el ácido se encuentre en
franca ebullición; si es tiempo de ebullición es de 2.5 a 3 min., se digiere
entonces 1.5 h o bien hasta que la muestra se aclare.
(5) Se enfría y se añade la mínima cantidad de agua destilada para disolver
sólidos remanentes. Se engrasa ligeramente con vaselina el cuello de
matraz.
(6) Tanto la muestra digerida como las perlas de ebullición se transfieren al
receptor del aparato destilador y se enjuaga el matraz 5 a 6 veces con
porciones de 1 2 ml de agua destilada.
(7) Se coloca debajo del condensador un matraz Erlenmeyer de 125 ml
conteniendo 5 ml de la solución de H3BO3 4% y de 2 a 4 gotas del
indicador, procurando que el extremo del condensador quede sumergido en
la solución.
(8) A la muestra digerida se le adiciona de 8 a 10 ml de la solución de NaOHNa2S2O3.
(9) Se colectan 15 ml de destilado y se diluye aproximadamente a 50 ml.
(10)
Esta solución se valora con el HCl 0.1N. Un color violeta indica el
termino de la valoración.
(11)
Correr un blanco bajo las mismas condiciones.
Cálculos
%N=
(ml HCl – ml blanco) * Normalidad del HCl * 14.008 * 100
mg de muestra
% N proteico = %N * F
MANUAL DE PRÁCTICAS DE
FISIOLOGIA DE LA NUTRICIÓN
Bibliografía
AOAC 1990. Official Methods os Analysis, 15th. Ed., Association of Oficial Anlytical
Chemists, Inc., USA, 342.