Bioquímica de Proteinas.
1er. Cuatrimestre de 2010.
Programa Teórico
I.
Las proteínas en Biotecnología.
La Proteómica y su importancia como continuación de los Proyectos
Genoma.
II. Purificación de proteínas. Estrategias generales. Obtención del extracto libre de células: ruptura y extracción
del material, clarificación, concentración. Diálisis. Métodos cromatográficos basados en la carga (intercambio
iónico, cromatoenfocado), en la hidrofobicidad, en la formación de quelatos metálicos o uniones covalentes, o en
la adsorción. Cromatografía de afinidad. Filtración por gel.
Problemas especiales: Purificación de proteínas en gran escala o para usos terapéuticos. Purificación de proteínas
de membrana. Uso de detergentes. La separación de fases con Triton X-114.
Criterios de pureza: Electroforesis en gel de poliacrilamida. Electroforesis bidimensional (2D-PAGE)
III. Caracterización de las proteínas: Determinación de la masa molecular por ultracentrifugación analítica o en
gradiente, espectrometría de masa y filtración por gel.
Secuenciación de las proteínas: la reacción de Edman. Estrategias adicionales de purificación para
secuenciación. Secuenciación directa del N-terminal. Secuenciación de péptidos internos: digestión enzimática o
fragmentación química seguida de separación por HPLC o electroforesis. Digestión enzimática in situ en el gel
electroforético.
Aplicaciones de la espectrometría de masa a la determinación de secuencias.
IV.
Estructura de las proteínas: Niveles primario, secundario, terciario y cuaternario. Motivos y dominios.
Determinación de la estructura tridimensional de las proteínas. Dicroísmo circular.
Cristalografía de
Rayos X. Resonancia Magnética Nuclear (NMR).
Predicción, modificación y diseño de estructuras proteicas. Modelado computacional de estructuras.
V. Modificaciones post-traduccionales de las proteínas en eucariotes. Puentes disulfuro, O- y N-glicosilación,
fosforilaciones, sulfatación, prenilación, acilación. Anclas de glicosil fosfatidil inositol. Procesado proteolítico:
péptidos señal y dominios pro. Precursores hormonales y poliproteínas virales.
Proteinasas de procesamiento.
Inteínas.
VI.
Plegamiento de las proteínas. Estados desplegado, plegado y de glóbulo fundido. Métodos de estudio del
plegamiento. Enzimas que participan en el plegamiento: protein disulfuro isomerasa y peptidil-prolil cistrans isomerasa. Chaperonas moleculares y su función en el plegamiento.
Importancia del plegamiento de las proteínas en Biotecnología. Cuerpos de inclusión: estructura y
propiedades. Factores que afectan su formación.
Purificación de cuerpos de inclusión.
Solubilización,
purificación y renaturalización de la proteínas recombinantes.
VII. La degradación proteolítica de las proteínas y su prevención. Proteinasas: clasificación y nomenclatura.
Estructura y propiedades de serin proteinasas, cistein proteinasas, aspartil proteinasas y metaloproteinasas. El
proteasoma. Inhibidores: reactivos químicos, derivados de péptidos e inhibidores proteicos naturales. Su uso para
evitar la proteólisis no deseada de proteínas naturales o recombinantes durante su purificación.
Programa práctico
1) Purificación de proteínas:
Teórico-Práctico: Obtención de extracto libre de células, precipitación con sulfato de amonio. Diálisis.
Práctico: Cromatografía de afinidad en columna con lectinas inmobilizadas: ConA Sepharosa.
Práctico: Cromatografía de intercambio iónico: FPLC en columna Mono Q, y Explicación de Filtración por gel:
FPLC en columna de Superdex 75.
Teórico-Práctico: Elaboración de los datos de purificación. Tabla de Purificación.
2) Criterios de pureza de proteínas:
Práctico: Electroforesis en geles de poliacrilamida. Tinciones con plata y con Coomassie Blue. Transferencia a
membrana: Western blot.
Mostración de 2D-PAGE.
3)
Secuenciación de proteínas:
Teórico-Práctico: Digestión de proteínas in gel. Separación por HPLC en fase reversa.
La clase teórica sobre secuenciación de péptidos y espectrometría de masa en el LANAIS-Pro incluye una
demostración del uso del secuenciador automático y el espectrómetro de masa.
Bibliografía
1) E. L.V.Harris and S. Angal: Protein purification methods: a practical approach. IRL Press, Oxford, 1989.
2) E. L.V.Harris and S. Angal: Protein purification applications: a practical approach. IRL Press, Oxford, 1990.
3) P. Matsudaira: A practical guide to protein and peptide purification for microsequencing. Academic Press Inc.,
New York, 1993.
4) T. E. Creighton (Ed.): Protein Structure. A practical approach. 2nd. Edition. IRL Press, Oxford, 1997.
5) C. Branden and J. Tooze: Introduction to protein structure. Garland Publishing Inc., New York and London,
1991.
6) R. H. Pain: Mechanisms of protein folding. IRL Press, Oxford, 1994.
7) R.J. Beynon and J.S. Bond: Proteolytic enzymes: a practical approach. IRL Press, Oxford, 1989.
Cronograma de la asignatura
Clases Teóricas (Miercoles y Jueves de 14 a 17 hs., Marzo y Abril)
Tema
Docente
Introducción. Purificación de proteínas I.
Purificación de proteínas II.
Purificación de proteínas III.
Homogeneidad. Masa molecular.
Estructura 1a. Secuenciación de péptidos.
Visita LANAIS-Pro
Estructura 3a. Cristalografía.
Estructura 3a. NMR
Modificaciones post-traduccionales.
Plegamiento de las proteínas.
Modificaciones post-traduccionales: glicosilación
Estructura 2a. Dicroísmo circular
Proteinasas I.
Proteinasas II.
Proteinasas III.
Fecha
J.J. Cazzulo
J.J. Cazzulo
J.J. Cazzulo
J.J. Cazzulo
J.J.Cazzulo
S. Linskens
G. Paris
R. Rasia
J.J. Cazzulo
J. Caramelo
J.J. Cazzulo
J.M. Delfino
J.J. Cazzulo
J.J. Cazzulo
J.J. Cazzulo
Mi
Ju
Ju
Mi
Mi
Ju
Mi
Ju
Mi
Ju
Mi
Ju
Mi
Ju
Mi
10/3
11/3
25/3
31/3
7/4
8/4
14/4
15/4
21/4
22/4
28/4
29/4
5/5
6/5
12/5
Trabajos Prácticos y Exámenes Parciales
Miércoles y Jueves, 14 a 18 hs
Exámenes Parciales
Miércoles o Jueves, 14 a 18 hs
Fechas a modificar, en reunión con los JTPs:
Purificación I (Extracto crudo y sulfato de amonio)
Purificación II (ConA Sepharosa)
Purificación III (MonoQ)
Jueves
Miércoles
Jueves
Primer Parcial Teórico (Temas I a IV)
Miércoles 26/5
HPLC en fase reversa de péptidos
SDS-PAGE I (Tinción Coomasie y plata)
Revelado I – Análisis de purificación
SDS-PAGE II (Actividad en gel y western blot)
Revelado II – Análisis de Purificación
Jueves
Miércoles
Jueves
Miércoles
Jueves
Segundo Parcial Teórico (Temas V a VII)
Miércoles 16/6
Filtración por gel – Análisis de purificación
Mostración de 2D-PAGE
Jueves
Miércoles
Parcial de Trabajos Prácticos
Recuperatorio de parciales
Jueves
24/6
Miercoles 30/6
Docentes auxiliares:
13/5
19/5
20/5
27/5
2/6
3/6
9/6
10/6
17/6
23/6
1. Purificación: Dr. Gastón Paris - Alejandra Frasch – Griselda Noé.
2, 3 y 4. SDS-PAGE y Western Blot: Dr. Gaston Paris - Julio C. Bayona – Alejandra Frasch – Griselda Noé
Profesor a cargo de Bioquímica de Proteínas:
Prof. Tit. Dr. Juan José Cazzulo. 10 CTs de 3 hs., 30 hs. totales.
Prof. Adj. Dr. Carlos Labriola 9 TPs de 6 hs., y 2 Examenes Parciales de 4 hs., 58 hs. totales.
Prof. Adj. Dra. Vanina Alvarez 9 TPs de 6 hs., y 2 Examenes Parciales de 4 hs., 58 hs. totales.
Profesores Invitados:
Lic. Susana Linskens y Farm. Carlos Pavan.
Dr. José María Delfino.
Dr. Rodolfo Rasia.
Dr. Julio Caramelo
1 Clase teórico-Práctica de 6 hs. 6 hs. totales.
1 Clase Teórica de 3 hs. 3 hs. totales.
1 Clase Teórica de 3 hs. 3 hs. totales.
1 Clase Teórica de 3 hs. 3 hs. totales.
Jefe de Trabajos Prácticos:
Dr. Gaston Paris
Horas de docencia de los Docentes Auxiliares de Bioquímica de Proteínas:
JTP Dr. Gastón París. 1 CT de 6 hs.y 4 TPs de 6 hs. 30 hs. totales.
Bioq. Alejandra Frasch 3 TPs de 6 hs. 24 hs. totales.
Lic. Griselda Noé
3 TPs de 6 hs. 24 hs. totales.
Lic. Julio C. Bayona
3 TPs de 6 hs. 24 hs. totales.
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Bioquímica de Proteinas

ContaminaciónCondensaciónDurezaDestilaciónEstados: gaseoso, liquido y sólidoPartículas del átomoReacción químicaPotabilizaciónMoléculasFundamentos de estequiometríaPurificaciónDisoluciónÓsmosis inversa

La Vera Historia de Purificación; Raquel Saguier

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Purificación del Agua

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