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LABORATORIO Nº4
DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA:
ENZIMAS DIGESTIVAS
1. Aspectos teóricos:
1.1 -Amilasa salival y pancreática.
La saliva es una mezcla derivada de la secreción de 3 pares de glándulas, las
parótidas, submaxilar y sublingual, como también de pequeñas glándulas mucosas
ubicadas difusamente sobre la mucosa de la boca.
La cantidad normal secretada en una persona adulta es de 1 a 1,5 Iitros en
24 horas. La composición de la saliva es un 99,5% H 2O y 0,5 % de sólidos
orgánicos e inorgánicos, el pH oscila entre 6,2 y 7,4. Los principales componentes
orgánicos son las glicoproteínas, proteínas (albúmina, globulinas) y carbohidratos.
Los componentes inorgánicos principales son calcio, sodio, potasio, magnesio y
fósforo.
La secreción pancreática es un líquido acuoso no viscoso, que tiene un contenido
de H2O semejante al de la saliva y que lleva cierta cantidad de proteínas y
compuestos inorgánicos, principalmente Na+, K+, HCO3- y Cl-, además están
presentes en pequeñas cantidades Ca+2, Zn+2 y HPO4-2. El pH del jugo pancreático
es claramente alcalino de 7,5 a 8,0 o mayor. En la secreción pancreática se
encuentran numerosas enzimas, la tripsina, amilasa, carboxipeptidasa, lipasa y
otras.
La enzima -amilasa, presente en la saliva, inicia la degradación del almidón, la
principal fuente de carbohidratos de la dieta humana. Esta enzima hidroliza al azar
los enlaces  (14) que unen residuos de glucosa en el almidón, a excepción de
los enlaces cercanos a los extremos y a los puntos de ramificación de las
cadenas. Por la acción de esta enzima activada por iones cloruro, en la boca la
longitud de la cadena del almidón se reduce de varios miles a unas ocho unidades
de glucosa. La alta concentración de protones del estómago inactiva la -amilasa
salival. La digestión del almidón continúa en el intestino delgado por la acción de
la -amilasa pancreática, como producto se forma una mezcla del disacárido
maltosa, el trisacárido maltotriosa y oligosacáridos conocidos como dextrinas que
poseen ramificaciones  (16).
  amilasa
alm idón 
 m altosa  m altotriosa 
dextrinas
Ecuación 4.1
El almidón y dextrinas complejas al ser tratados con una solución de yodo dan un
complejo de coloración azul, mientras que las dextrinas más simples, la
maltotriosa y maltosa no dan una reacción positiva. Así, la acción de la -amilasa
sobre polisacáridos puede ser seguida midiendo la decoloración del complejo azul
hasta alcanzar el punto acrómico (solución incolora).
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La maltosa y otros carbohidratos reductores producidos en la reacción pueden ser
detectados por el test de Benedict. Este método es cualitativo, consiste en una
solución alcalina de Cu2+ que se encuentra formando un complejo con citrato. El
ión cúprico es reducido a Cu1+ por compuestos reductores con formación de
hidróxido cuproso amarillo o de óxido cuproso rojo. El cambio de coloración o la
formación de un precipitado rojo-ladrillo (Cu2O) indica la presencia de un
compuesto reductor. Carbohidratos reductores también pueden detectarse y
cuantificarse por los ensayos de Somogyi-Nelson y de la o-toluidina.
1.2
Lipasa pancreática, efecto de la sal biliar.
La mayoría de los lípidos de la dieta son triglicéridos, esteroles y fosfolípidos de
membrana de origen vegetal y animal. La digestión de los lípidos ocurre en el
duodeno gracias a la secreción pancreática.
La lipasa pancreática actúa en la interfase H2O / aceite de las gotitas de lípidos
finamente emulsificadas, formadas por la agitación mecánica en el intestino en
presencia de sales biliares.
La degradación de lípidos en el sistema digestivo es incompleta, los triglicéridos
son transformados a una mezcla de diglicéridos, monoglicéridos, glicerol y ácidos
grasos.
La reacción puede ser seguida por el cambio de pH causado por la disociación de
los ácidos grasos formados a través del tiempo de la reacción ocupando un
indicador ácido-base, compuestos que son ácidos o bases cuyas distintas formas
iónicas tienen diferentes colores. El rojo de fenol es un ácido débil con un intervalo
de transición entre valores de pH 6,4 y 8,0; la forma protonada es amarilla y la
forma básica es roja. Una transición de pH de un medio neutro o alcalino a pH
ácido va acompañada de un cambio de coloración, de rojo a amarillo.
Lipasa
Triglicéridos
diglicéridos + monoglicéridos + glicerol + ácidos grasos
Sales biliares
( R-COO- + H+)
Ecuación 4.2
2. Objetivos.
Determinar la actividad enzimática de las enzimas digestivas -amilasa y lipasa
de acuerdo a las diferentes propiedades que presentan los reactantes y productos
de las reacciones catalizadas.
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3. Parte experimental.
3.1 Materiales

baño termostatizado / termómetro

trípode / rejilla / mechero

espectrofotómetro / celdas
 2 gradillas
 2 pipetas graduadas de 10 ml
 2 pipetas graduadas de 5 ml
 1 pipeta graduada de 1 ml
 1 pipeta graduada de 1 ml
 1 pipeta graduada de 2 ml
 1 pizeta
 1 vaso precipitado de 100 ml
 1 vaso precipitado de 250 ml
 1 vaso precipitado de 500 ml
3.2
Reactivos
 Almidón 0,5 % en tampón fosfato 0,1 M pH 6,7
 Tampón fosfato 0,1 M, pH 6,7
 NaCl 1 %
 Reactivo de Benedict
 Solución de yodo 2,5 mM
 Pancreatina 1 mg/ ml, como fuente de -amilasa
 Pancreatina 10 mg/ml, como fuente de lipasa
 Rojo fenol 0,8 mg/ml
 Na2CO3 0,5 M
 HCl 1,0 M
 Leche con 26% de material grasa
 Colato de sodio 5%.
4. Procedimiento.
En forma previa:
 Diluya 1:5 la solución stock de -amilasa 1 mg/ml.
(1 ml de enzima 1 mg/ml + 4 ml de tampón fosfato 0,1M pH 6,7).
 Prepare una batería de tubos de ensayo rotulados con 3,0 ml de la solución de
yodo (T0I, T1I, T2I, T2I, T5I y T15I).
 Prepare una batería de tubos de ensayo rotulados con 5,0 ml del reactivo de
Benedict (T0B, T1B, T2B, T2B, T5B y T15B).
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4.1
Hidrólisis de almidón por -amilasa pancreática
 Prepare los tubos rotulados como se indica en la tabla 4.1:
TABLA 4.1
TUBOS
Almidón (ml)
Tampón fosfato 0,1 M (ml)
NaCl 1% (ml)



B
----5,0
1,0
T
10,0
----2,0
Nota: Es importante que se mida exactamente los tiempos indicados en el
procedimiento.
Coloque el tubo T en un baño de agua a 37 ºC durante 5 minutos.
Inicie la reacción, agregando 2,0 ml de enzima diluida 1/5 al tubo T. Mezcle sin
agitación violenta el contenido del tubo e incube inmediatamente a 37ºC. El
momento en que agregó la enzima al tubo de ensayo se considera como
tiempo cero de la reacción.
A los tiempos 0, 1, 2, 5 y 15 minutos de iniciada la reacción enzimática, saque
1,0 ml de la solución T para estimar cambios de concentración del sustrato
(almidón, punto 4.1.1) y en forma paralela, 1,0 ml de la solución T para
cuantificar el producto de la reacción (cuerpos reductores, punto 4.1.2).
Nota: Es importante que una vez sacado el volumen indicado en forma
inmediata inicie los procedimientos descritos en 4.1.1 y 4.1.2.
4.1.1 Estimación “semicuantitativa” del almidón.
 Mezcle 1,0 ml del ensayo de la hidrólisis enzimática del almidón (tubo T)
obtenido al tiempo cero de reacción con 3,0 ml del reactivo de yodo en el tubo
de ensayo ya rotulado. Homogenice.
 Repita la operación anterior a los diferentes tiempos de incubación (1, 2, 5 y
15 min).
 Prepare el blanco con 1,0 ml del tubo B y 3,0 ml de la solución de yodo.
 Lea la absorbancia a 540 nm, calibrando el equipo con el blanco.
 Grafique absorbancia versus tiempo de reacción.
4.1.2 Estimación de cuerpos reductores.
 Mezcle 1,0 ml del ensayo de la hidrólisis enzimática del almidón (tubo T)
obtenido al tiempo cero de reacción con 5,0 ml del reactivo de Benedict en un
tubo de ensayo ya rotulado. Homogenice.
 Coloque el tubo de ensayo en un baño en ebullición por 5,0 minutos exactos.
 Enfríe bajo llave de agua con cuidado.
 Repita la operación anterior (3 pasos) a los diferentes tiempos de incubación
(1, 2, 5 y 15 min).
 Prepare el blanco con 1,0 ml del tubo B y 5,0 ml de la solución de Benedict,
incube en un baño de agua a ebullición por 5 min y enfríe.
 Lea la absorbancia a 560 nm, calibrando el equipo con el blanco. Observe si
hay aparición de un precipitado rojo.
 Grafique absorbancia versus tiempo de reacción.
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4.2. Degradación de triglicéridos por la lipasa pancreática.
En forma previa:
 En un tubo de ensayo prepare 10 ml de una suspensión de 10 mg/ml de
pancreatina en agua destilada. Deje la enzima en un vaso de agua con hielo.
 Neutralice la leche fresca adicionando 10 ml de Na2CO3 0,5 M a 40 ml de leche
con 0,1 ml de una solución de rojo fenol (0,8 mg/ml).
 Prepare 2 tubos de ensayo con 5 ml de leche neutralizada cada uno.
Adicione a uno de ellos 0,4 ml de HCl 1,0 M. Estos dos tubos servirán como
referencia para el cambio de color, el color rosado indica medio neutro y
básico, el amarillo indica medio ácido.
De acuerdo a la tabla 4.2:
 Prepare una batería de tubos de ensayo rotulados.
 Agregue la leche neutralizada que contiene el indicador.
 Agregue la solución de colato de sodio.
 Agregue el agua destilada.
 Coloque los tubos en un baño de agua termostatizada a 37ºC durante 5,0 min.
 Inicie la reacción enzimática adicionando 2,0 ml de la solución de pancreatina a
los tubos T1 y T2. Agite y deje incubando siempre a 37ºC.
 Adicione 2,0 ml de agua destilada a los tubos controles C1 y C2. Agite y deje
incubando siempre a 37ºC.
 Anote el tiempo requerido para el cambio de color y olor desde que
agregó la pancreatina, compare también los cambios de color y densidad en
los tubos.
TABLA 4.2
Tubo
Leche neutralizada (mL)
Solución de colato de Na (mL)
H2O destilada ( mL)
T1
5,0
--1,0
T2
5,0
1,0
---
C1
5,0
--1,0
C2
5,0
1,0
---
5. Bibliografía
Robert Bohinski, 1991. Bioquímica, 5ª Edición, Addison-Wesley, Iberoamericana.
Preguntas.
1.
¿Con qué propósito agrega NaCl a la reacción de hidrólisis del almidón?
2.
Usando maltosa y sacarosa como ejemplos, discuta las características de
los azúcares que tienen propiedades reductoras.
3.
El reactivo de Benedict presenta color azul debido al cobre. ¿Por qué en
presencia de maltosa se observa un cambio de color?
4.
¿Cuál es la estructura de las sales biliares y por qué funcionan como
detergentes?
5.
¿Qué acción ejerce el colato de Na en la reacción catalizada por la lipasa
pancreática?
6.
¿Qué puede concluir de los resultados obtenidos de los tubos C 1 y C2 con
respecto al colato de Na?
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