Recomendaciones generales de colecta

Laboratorio de Ornitología, Instituto de Biología UNAM
Protocolo para la colecta de sangre de aves
para estudios genéticos
Observaciones generales
En la aves la sangre representa una fuente adecuada para estudios de ADN
nuclear, y aunque puede ser menos eficiente en análisis de ADN mitocondrial,
también se han obtenido muy buenos resultados. Los tejidos ideales para los
análisis mitocondriales son aquellos que son ricos en mitocondrias tales como
músculos e hígado pero como en muchos casos implican la muerte de los
organismos se recurre a la sangre por su relativa facilidad de obtención y
preservación en el campo.
Para cada individuo es suficiente colectar de 1-5 gotas de sangre (500
l). Se recomienda tomar más de una muestra de cada ave para tener replicas
de colecta, dependiendo del tamaño de la misma. Otra fuente de ADN son las
quillas con sangre (una pluma en muda) ya que tienen mucho tejido. Además, es
un método menos invasivo que colectar sangre por lo que los organismos son
sometidos a un menor riesgo y estrés, y el ave puede volver a hacer su pluma.
Si se sigue este método de colecta es preferible arrancar cobertoras
secundarias en lugar de plumas primarias o secundarias emergentes que
pueden ser más críticas para el vuelo. Se debe tener en cuenta que la fuente
de ADN son las quillas por lo que es esta parte la que debe quedar dentro de la
solución de preservación (en caso de que la pluma completa no entre en el tubo
hay que cortar la punta y dejar la parte basal con sangre en la muestra). En las
quillas gruesas es a veces necesario partirla por la mitad (con una navaja gillete
para cada quilla y no contaminar con otras muestras) para asegurar que la
solución de preservación penetre al tejido con ADN.
En los casos en que se colecte sangre, las muestras se obtienen por
venipunción con una aguja o lanceta estéril, en el ala (braquial) o en el tarso, o
cortando una uña (no el dedo). Se debe usar una aguja o lanceta para cada
individuo para evitar contaminación entre muestras. Seleccione el sitio para
punzar y limpie con un algodón con benzal líquido de preferencia (o alcohol al
70% aunque este puede favorecer el sangrado).
La gota de sangre se puede recoger con tubos capilares los cuales son
puestos directamente en tubos individuales con solución anticoagulante en las
paredes (EDTA de preferencia, heparina afecta el análisis de ADN). Si no se
va a refrigerar se añade el líquido de preservación agitando suavemente (SDS
o buffer de lisis, o en su defecto alcohol al 96% o ver colecta con buffer).
Otras muestras que pueden servir para extraer DNA son: membranas de
huevos, y plumas de los nidos con la certeza de que pertenecen a un solo
individuo.
Detener puede la hemorragia por presión con un cotonete y el benzal.
La muestra de sangre se debe refrigerar
Colecta en nitrógeno líquido
material:
tanque de nitrógeno líquido
lanceta o aguja de insulina (casi todas las aves pequeñas y medianas)
criotubos de 2 ml
Se colecta la sangre directo al criotubo de 2 ml, se etiqueta y se guardan en el
tanque de nitrógeno líquido. De regreso al laboratorio se pasan los tubos al
ultracongelador a –70°C. No importa que se coagule.
Colecta en seco (en papel filtro, o cotonetes, o toallitas de papel)
material:
lanceta o aguja de insulina,
círculo de papel filtro,
tubos de 1.5 ml con tapa,
5-6 gotas de sangre se pueden poner en el papel filtro cuidando de no
contaminar, se tiene que dejar secar.
Los círculos de papel filtro se colocan en tubos de microcentrífuga de 1.5 ml
Se etiquetan y se guardan si se puede entre 5 a –20°C hasta su almacenamiento
a –70°C. , si no al menos evitar exposición directa al sol y temperaturas
superiores a 40°C.
Colecta en buffer
material:
lanceta o aguja para cada individuo,
tubos capilares con EDTA liofilizado
tubos de 1.5 ml con tapa, y después de la sangre añadir un volumen de 500UL
de buffer de lisis con SDS,
Eligir el tamaño adecuado de acuerdo con la cantidad de sangre que se va a
colectar o usar más de un tubo por ave si es necesario. También se pueden usar
crioviales de 2 ml.
Se recomienda colocar el buffer en los tubos después de la sangre y agitar (si
se corta la uña se puede "enjuagar" el dedo en el tubo para que caiga la sangre
y cerrarlo).
Para la proporción se necesita una gota de sangre (aprox 20-60 l) en 200-500
l de buffer o más, es decir, se debe contar al menos con un volumen
aproximado de buffer 2:1 sangre o más (5:1) para que se conserve, no poner
más sangre que buffer.
No se recomienda usar capilares con heparina, con EDTA es mejor.
No soplar el capilar (se contamina), si no fluye al tubo, cortarlo y dejarlo
adentro, poner el buffer, taparlo y agitar, se hace viscoso y así está bien.
Numerar el tubo con plumón de tinta indeleble.
Anotar datos en el catálogo de preferencia con un lápiz grueso (2H).
Rotular la caja por fuera también.
Pueden mantenerse a temperatura ambiente y lejos de la luz directa del sol,
pero es recomendable mantener las muestras en refrigeración o congeladas el
mayor tiempo posible.
Recomendaciones generales de colecta
Se debe tener en cuenta que cada muestra colectada debe representar el
genoma de un único individuo, por ello se deben seguir precauciones que eviten
contaminaciones con genomas externos a cada individuo. Esto se puede lograr
si los colectores usan guantes de látex durante la toma de muestras, si evitan
mezclar muestras etiquetando cada tubo con plumón indeleble para evitar
confusiones, tratar de efectuar este proceso rápido para disminuir la
contaminación ambiental de virus, bacterias y hongos. Además, evitar destapar
los tubos con las muestras, no exponerles directamente al sol y evitar las
temperaturas por arriba de los 40°C. Emplear para cada individuo una aguja
estéril que se descarta una vez finalizada la colecta.
Mandar las muestras a:
Patricia Escalante
Instituto de Biología, UNAM
Tercer Circuito Cultural
Ciudad Universitaria
04510 México DF
Las muestras deben ir en cajas de poliuretano o de alguna manera aisladas,
bien empacadas y protegidas.
advertir a: [email protected]
Buffer de lisis:
50 ml de 2M Tris-HCl pH 8.0
200 ml de 0.5 M EDTA pH 8.0
2 ml de 5M HCl
subir a 975 ml. de agua bidestilada
añadir 25 ml de 20% SDS
otra fórmula:
Tris - 100 mM PH 8
EDTA -100 mM PH 8
SDS - 2%
NaCl - 10mM