Cultivo de microalgas mediante masificación

UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA
FACULTAD DE INGENIERIA PESQUERA
DEPARTEMENTO ACADÉMICO DE ACUICULTURA
INFORME DE PRACTICA:
CULTIVO DE UNA MICROALGA (Dunaliella SP) MEDIANTE LA TÉCNICA DE LA
MASIFICACION
CURSO :
ACUICULTURA I
PIURA − PERU
INTRODUCCION
Son llamadas microalgas a una gran cantidad de especies que constituyen el fitoplancton que abarca desde
organismos autótrofos hasta microflagelados y microciliados auxótrofos.
Su posición taxonómica ha sido de gran polémica entre botánicos y zoólogos, como ejemplo podemos
mencionar el grupo de los dinoflagelados, conocidos por unos como microalgas y por otros como
protozoarios.
Estas especies aportan un alto contenido nutricional para peces, crustáceos y moluscos, además de ofrecer
facilidades de manejo en sistemas de cultivo tanto en laboratorio como en producción a gran escala con fines
comerciales.
Debido a esto es necesario cultivar los diversos tipos de microalgas dándoles las condiciones y
enriqueciéndoles con los nutrientes necesarios para darle mayor calidad a nuestros cultivos hidrobiologicos.
CULTIVO DE UNA MICROALGA MEDIANTE LA TÉCNICA DE LA MASIFICACION
DUNALIELLA SP
1.− DESCRIBA DETALLADAMENTE LA COMPOSICIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO
GUILLARD
TABLA DEL MEDIO DE GUILLARD F/2 (J. STEIN, 1979)
Nutrientes Mayores
NaNO3 7.5
Solución Primaria
% w/v
NaH2PO4.H2O 0.5
% w/v
NH4Cl 2.65
% w/v
Na2SIO3.9N2O 3
% w/v
1
(calentar para disolver)
Usar 1 ml de éstas soluciones por litro de agua de mar, para preparar el medio F/2.
Sugerencia: preparar el NaNO3 junto con NaH2PO4 . H2O en 100 ml
Metales Traza
CuSO4.5H2O
Solución Primaria
0.98 % w/v
ZnSO4.7 H2O
2.2 % w/v
ZnCl2
1.05 % w/v
CoCl2.6H2O
1.0 % w/v
MnCl2.4H2O
18 % w/v
Na2MnO4.2H2O
0.63 % w/v
Es conveniente hacer las soluciones primarias en forma individual, y con una concentración menor de 106
mas concentrada que en el medio F/12
Solución Primaria De Metales Traza
• Con Secuestrante Férrico (Cloruro Férrico): Disolver 5g del secuestrante férrico en 900 ml de agua
destilada y añadir 1 ml de cada una de las soluciones primarias de metales traza preparados anteriormente;
aforar a un litro y asegurar que el pH quede cerca de 4.5. use 1 ml de esta solución por cada litro de agua de
mar para hacer el medio de cultivo. Agua de mar filtrada (5, 10, etc.) y de ser posible irradiada con UV
• Con EDTA y Cloruro Férrico (FeCl.6H2O): disuelva 3.15 g de FeCl.6H2O ó 4.36 de EDTA (Na2) en
900 ml de agua destilada, agregue 1 ml de cada una de las soluciones stock primarias de metales traza y
afore a 1 litro, asegure un pH de 2.0
Use 1 ml de esta solución por litro de agua de mar para preparar el medio f/2
Solución Primaria De Vitaminas
• Solución primarias de Biotina: se prepara a partir de cristales de Bl, disolver 10 mg de Biotina en 96
ml de agua destilada. Haga esta solución ligeramente ácida para ser autoclavada y manténgase en un
congelador.
• Solución de Vitamina B12: A partir de Cyanocobalamina U.S. de 100 mg/ml solución inyectable.
Tomar 1 ml y aforarlo en 100 ml de agua destilada. La solución se acidifica para ser autoclavada y se
congela.
Tomar 1ml de la solución primaria de Biotina y 0.1 ml de la solución stock primaria de B12, aforar a 100 ml
con agua destilada y añadir 20 mg de Tiamina HCl.
Se pueden preparar ampolletas de 2,5 ó 10 ml y almacenarlas estériles (acidificas) en el congelador.
Use ½ ml de esta solución por cada litro de agua de mar para preparar el medio f/12
Preparación del Buffer Tris
2
Tome 50 g de tris y disuélvase en 200 ml de agua destilada y ajuste el pH a 7.2 en HCl. Use de 1 a 5ml por
litro de medio antes de la autoclave, ajustando el pH a 7.4 (recomendado usar 1 ml por litro cuando el pH del
medio es 7.9 − 8.2)
TABLA DEL MEDIO DE CULTIVO (AGUA DULCE)
(Guillard, In: Stein, 1979)
Guillard comunicación personal a J. Steinn, 1973. Handbook of phycological methods, Culture Methods and
Growth Measurements. Cambridge at the University Press: 448 pp
• Macronutrientes:
• CaCl2.H2O 36.76 g/l
• MgSO4.7H2O 36.97 g/l
• NaHCO3 12.60 g/l
• K2HPO4 8.71 g/l
• NaNO3 85.01 g/l
• Na2SiO3.9H2O 28.42 g/l
De esta solución rotulada como a se obtiene 1 ml y se le adiciona a 1 litro de agua esterilizada.
• Micronutrientes:
◊ Na2EDTA 4.36 g/l
◊ FeCl3.6H2O 3.15 g/l
◊ CuSO4.5H2O 0.01 g/l
◊ ZnSO4.7H2O 0.022 g/l
◊ CoCl2.6H2O 0.01 g/l
◊ MnCl2.4H2O 0.18 g/l
◊ Na2MoO4.2H2O 0.006 g/l
• Vitaminas:
♦ Thiamine. HCl 0.1 mg/l
♦ Biotin 0.5 g/l
♦ Cyanocobalamina 0.5 g/l
De esta solución rotulada como c, se obtiene 1 ml y se adiciona a 1 litro de agua esterilizada
• Tris:
♦ Tris (Hydroxymethyl) − Aminomethano 50 g./200 ml H2O destilada
(Cuando el cultivo se encuentra axénico el tris puede reemplazarse por Glycylaglycine). De esta
solución rotulada como d, obtener 2 ml y adicionar al litro de agua esterilizada que se esta preparando
en cultivo, se debe hacer ajuste de pH a 7.2 con HCl cuidadosamente para no obtener el pH ácido.
Solución Básica de Nutrientes
♦ NaNo 75 mg
♦ Po4H2NaH2O 5 mg
♦ SiO2Na29H2O 15 − 30 mg
Solución de Metales Traza
♦ Na2EDTA 4.36 mg.
♦ Cl3FeGH2O 3.15 mg
♦ So4CuSH2O 0.01 mg
3
♦ So4Zn7H2O 0.022 mg
♦ Cl2Mn4H2O 0.018 mg
♦ MoO2Na22H2O 0.006 mg
♦ Cl2Co6H2O 0.01 mg
Solución de Vitaminas
♦ Cianolobalamina (B12) 0.5 mg
♦ Tiamina Mc (B1) 0.1 mg
♦ Biotina (vit. M) 0.5 mg
2. DESCRIBA PUNTUALMENTE TODO EL SISTEMA DE ACONDICIONAMIENTO
REALIZADO EN EL CULTIVO DE MICROALGAS.
Para el cultivo de la microalga Dunaliella sp y para las demás microalgas, se llevo a cabo un
acondicionamiento muy cuidadoso, dado que cualquier negligencia cometida en el
acondicionamiento podría ocasionar el fracaso de nuestros cultivos.
Materiales
♦
♦ Biotero
♦ Fluorescente
♦ Termómetro
♦ Inóculo o cepa
♦ Aireador
♦ 1 pali globo
♦ Cocina eléctrica
♦ Botellas de vidrio y plástico de 500 ml, 1500 ml y 3000 ml
♦ Sustancias Madres: Nitrógeno y Fósforo
♦ Agua de mar esterilizada
♦ Pipetas
♦ Fiolas
En El Biotero
Este inicialmente presentaba el inoculo o cepa de donde se extraería las muestras para el
cultivo, y que posteriormente albergaría a todos los cultivos de las microalgas a cultivar.
Acondicionamiento Químico
Desinfección.− se llevo a cabo en las botellas a utilizar que fueron de vidrio y plástico. Las
botellas de vidrio y de plástico fueron desinfectadas con hipoclorito de sodio o lejía, detergentes,
las cuales fueron necesarias colocarles un tapón hecho de algodón para evitar el ingreso de
microorganismos.
Esterilización.− ésta se llevo a cabo en el agua de mar a usar, para esterilizarla solo era
necesario dejar que el agua haga un pequeño burbujeo, sin dejarlo que ebullicione debido a que
se precipitarían los fosfatos y las sales minerales, si esto sucedía, era necesario volver a
esterilizar una nueva muestra de agua.
Acondicionamiento Físico
4
En el interior del biotero se acondiciono un fluorescente el cual estaba iluminado las 24 horas
del día, con el propósito de dar energía e iluminación a los cultivos para realizar la fotosíntesis.
También se coloco un termómetro para poder llevar el control diario de la temperatura.
Fue necesario obtener un aireador o agitador, el cual al final de la manguera del aireador se le
coloco un pali globo para que pueda tener las condiciones necesarias de aireación a los cultivos,
de la misma manera evitar la sedimentación de las microalgas.
3.− ¿CÓMO SE HA LOGRADO CONTROLAR LA CONTAMINACIÓN DE SU CULTIVO?
Se logro controlar la contaminación del cultivo de Dunaliella sp, debido a las siguientes razones:
♦ El medio de cultivo que se uso fue el medio de cultivo Guillard.
♦ Para cada botella de cada masificación se colocó un tapón de algodón el cual evitaba el
ingreso de microorganismos, solamente se permitía el paso de la manguera del aireador.
♦ Las botellas fueron desinfectadas con Hipoclorito de Sodio o lejía, con detergentes,
alcohol.
♦ Al momento de realizar la masificación, la persona que manipulaba los cultivos tenía
que estar en buen estado de salud, así como evitar los estornudos, evitar el habla, evitar
el acercamiento del inóculo con la cara o boca.
♦ Las pipeta y la fiola debían estar desinfectadas
♦ El agua de mar a usar para las masificaciones debían de estar completamente estériles.
♦ Durante las 24 horas del día el cultivo permanecía en el interior del biotero, el cual
solamente se sacaba para llevar a cabo la siguiente masificación.
4.− ¿CUÁL HA SIDO EL EFECTO DE LA TEMPERATURA REGISTRADA DURANTE EL
EXPERIMENTO, SOBRE EL DESARROLLO DE CULTIVO DE LA MICROALGA?
1er Experimento
Se realizó un primer experimento el cual se dejaron los cultivos en la parte externa del
laboratorio, para lo cual se llevo a cabo los mismos procedimientos de cultivo, usando la misma
técnica.
Estos cultivos fueron depositados en el interior de una tolda para darle mayor temperatura,
también se les coloco fluorescentes a medio metro de distancia de los cultivos, pero se noto
diferentes cambios de temperaturas muy bruscos que variaban de 24ºC a 32ºC, y como
consecuencia ocasiono la decoloración de las microalgas, de un color verde pálido a un color
transparente en solo pocos días ocasionando el colapso y fracaso de los cultivos por lo que se vio
la necesidad de volver a cultivar pero esta vez se tuvo un mayor control de temperatura debido
que los cultivos fueron colocados en el laboratorio en el interior de un biotero.
2do Experimento en el Laboratorio
Durante el tiempo que duro el 2do experimento, la temperatura ha sido un factor físico muy
importante para el desarrollo de la microalga, debido que su efecto ha sido satisfactorio, ya que
se mantuvo dentro del rango óptimo para el desarrollo de la microalga cultivada.
La temperatura registrada se mantenía en el rango de 25 − 27 ºC, el cual permitió que las
microalgas se reproducieran satisfactoriamente, en el transcurso de los días se noto el cambio de
la coloración de verde pálida a otra coloración verde oscura. El cual indicaba que el cultivo
marchaba en buenas condiciones.
5
Esta temperatura se dio gracias a la iluminación de los fluorescentes colocados en el interior del
biotero.
5.− DESCRIBA DIARIAMENTE EL DESARROLLO DEL CULTIVO (PUNTUALICE LA
VARIACIÓN DEL COLOR ) DESPUÉS DE CADA MASIFICACIÓN.
MASIFICACIÓNES DE Dunaliella SP
1ERA MASIFICACION A 500 ml (10/11/2004)
♦ 1 ml de Nitrógeno para 500 ml de agua de mar
♦ 1 ml de Fósforo para 500 ml de agua de mar
♦ 160 ml del inóculo de Dunaliella sp
♦ 350 ml de agua de mar
Temperaturas
Días
9:00 a.m. − 11:00
4:00 p.m. − 6:00
a.m.
p.m.
10/11/2004
26 ºC
27 ºC
11/11/2004
25 ºC
27 ºC
12/12/2004
26 ºC
26.5 ºC
15/11/2004
26 ºC
26.5 ºC
16/11/2004
25.5 ºC
26 ºC
17/11/2004
26 ºC
27 ºC
Cuando se llevo a cabo la primera masificación se noto que el color era verde pálido, y a medida
que iban pasando los días se observaba que la coloración de las microalgas de nuestra especie
Dunaliella sp. iba tomando la coloración verde mas intenso y al mismo tiempo se notaba la
evaporación del agua.
2 MASIFICACION 1500 ml (17/11/2004)
♦ 2 ml de Nitrógeno para 1000 ml de agua de mar
♦ 2 ml de Fósforo para 1000 ml de agua de mar
♦ Se evaporo 20 ml de agua por lo que se contó con 490 ml del inóculo de Dunaliella sp de
la primera masificación
♦ 1000 ml de agua de mar
Días
Temperaturas
9:00 a.m. − 11:00 a.m.
4:00 p.m. − 6:00 p.m.
17/11/2004
26 ºC
27 ºC
6
18/11/2004
25 ºC
27 ºC
19/12/2004
26 ºC
−−−
22/11/2004
26 ºC
−−−
23/11/2004
25.5 ºC
26 ºC
24/11/2004
27 ºC
27 ºC
3 MASIFICACION 3000 ml (24/11/2004)
♦ 3 ml de Nitrógeno para 1500 ml de agua de mar
♦ 3 ml de Fósforo para 1500 ml de agua de mar
♦ Se evaporo 55 ml de agua por lo que se contó con 1435 ml del inóculo de Dunaliella sp de
la primera masificación
♦ 1500 ml de agua de mar
Temperaturas
Días
9:00 a.m. − 11:00
4:00 p.m. − 6:00
a.m.
p.m.
24/11/2004
26 ºC
27 ºC
25/11/2004
26 ºC
27 ºC
26/12/2004
26 ºC
−−−
29/11/2004
26 ºC
−−−
30/11/2004
26 ºC
26 ºC
01/12/2004
26 ºC
27 ºC
02/12/2004
26 ºC
26.5 ºC
03/12/2004
26 ºC
27 ºC
06/12/2004
26 ºC
27 ºC
07/12/2004
26 ºC
27 ºC
7
08/12/2004
26 ºC
27 ºC
Porcentaje de Evaporación de agua en las Masificaciones
1era Masificación (500 ml)
De los 510 ml de la 1ra masificación se evaporo 10 ml de agua quedando 490 ml de agua,
entonces tenemos
510 ml −−−−−−−−−−−−−−−−−−−100 %
490 ml −−−−−−−−−−−−−−−−−−− x
x = 96 %, entonces se evaporo el 4% del total de agua
2da Masificación (1500 ml)
490 ml + 1000 ml de agua = 1490 ml de agua
De los 1490 ml de la 2da masificación se evaporo 55 ml de agua quedando 1435 ml de agua,
entonces tenemos
1490 ml −−−−−−−−−−−−−−−−−−−100 %
1435 ml −−−−−−−−−−−−−−−−−−− x
x = 96.31 %, entonces se evaporo el 3.69% del total de agua
3ra Masificación (3000 ml)
1435 ml + 1500 ml de agua = 2935 ml de agua
De los 2935 ml de la 2da masificación se evaporo 105 ml de agua quedando 1435 ml de agua,
entonces tenemos
2935 ml −−−−−−−−−−−−−−−−−−−100 %
2830 ml −−−−−−−−−−−−−−−−−−− x
x = 96.42 %, entonces se evaporo el 3.58% del total de agua
CONCLUSIONES GENERALES
♦ El cambio de color es un factor determinante del progreso del cultivo, a mayor
coloración verde, la Dunaliella sp se esta desarrollando en mejores condiciones
ambientales.
♦ La temperatura debe de ser estable, no debe de existir cambios bruscos de temperatura,
ya que esto podría ser mortal para las microalgas
♦ Cuando se da un acondicionamiento adecuado y se evita la contaminación, el cultivo
progresa grandemente.
♦ Se recomienda trabajar en laboratorio, siendo mejor colocar los medios de cultivo en el
interior de un bioterio, controlando la temperatura constantemente
8
♦ Se recomienda que la persona que manipulea las masificaciones no debe de estar
enferma, ni acercar las cepas y cultivos cerca de la cara o boca debido a los
microorganismos que poseemos y que podrían contaminar el cultivo
♦ Para evitar la contaminación se debe tener como principio general la desinfección de los
materiales a usar como botellas, fiolas, pipetas, etc; asi como la esterilización del agua de
mar para el caso de la Dunaliella sp
DISCUSIONES
♦ A mayor volumen de masificación se obtendrá menores cantidades de evaporación de
agua.
♦ No se debe de hacer hervir el agua porque si esto sucede el agua quedará inactiva para
la masificación.
♦ Cuando se llevo a cabo el primer experimento colocando los medios de cultivos en la
parte exterior del laboratorio, resulto la muerte total de las microalgas debido a que no
se pudo tener un control de la temperatura.
♦ No se logro determinar la absorvancia y tramitancia debido que el laboratorio principal
no se encontraba en las condiciones básicas para llevar a cabo estas determinaciones,
además no se podía tener acceso a los equipos necesarios.
♦ Al finalizar las practicas de masificaciones, se logro obtener volúmenes mayores de
inóculos, los cuales deben de ser aprovechados y no dejarlos morir.
BIBLIOGRAFÍA
♦ http://www.fao.org/docrep/field/003/AB473S/AB473S02.htm#tbl13
♦ http://www.cibnor.mx/colecciones/malgas/eintro.php
♦ www.google.com
♦ www.yahoo.com
♦ http://www.fao.org/docrep/field/003/AB473S/AB473S00.htm
♦ Manual de producción de algas; SENAIM
♦ Gilbert Bernabé (1988) Acuicultura. Vol. 1, 681 pág
ANEXOS
1. CONSIDERACIONES GENERALES DE LOS CULTIVOS DE MICROALGAS
Muchos factores contribuyen para el desarrollo óptimo de los cultivos de microalgas, algunos de éstos
afectan las características del crecimiento.
Los recipientes de cultivo más comúnmente usados son de materiales no tóxicos como las cajas de
Petri, matraces Erlenmeyer, matraces Ferenback, carboys o garrafas, etc., adecuados para cultivos de
laboratorio. Para cultivos a gran escala los recipientes de plástico, madera y concreto son los más
recomendables, incluyendo los estanques rústicos en áreas rurales son los sistemas más económicos.
En cultivos masivos la aireación es un factor muy importante para la homogenización de los
nutrientes y para evitar la sedimentación de las microalgas. Las diatomeas suelen acumularse en
lugares donde el agua no se mezcla, esto también depende de la forma del recipiente de cultivo que
cuando no es adecuado retarda el crecimiento.
Otro factor importante es la penetración de la luz en el cultivo; en los cultivos masivos la profundidad
es tan grande que la intensidad de la luz insidente no es suficiente para la fotosíntesis, hasta el fondo
del tanque. En los cultivos masivos a la intemperie la penetración de la luz es más efectiva, pero se
debe reducir la intensidad de la luz fuerte, cubriendo estos estanques con una malla. En cultivos a
gran escala es recomendable la inyección de CO2 (0.5%) para contribuir al proceso fotosintético.
9
El crecimiento y la división celular son afectados por la intensidad de la luz y el fotoperíodo (horas de
iluminación y oscuridad) en relación también a la temperatura, por ejemplo en Diatomeas a 20°C y
1,000 lux se obtiene un crecimiento favorable.
Tabla Nº 1: Características De Algunas De Las Especies De Algas Unicelulares Utilizadas En
Acuacultura (Coll−Morales J., 1983)
GENERO
Phaeodactylum
(diatomea)
Skeletonema
(diatomea)
Dunaliella
(cloroficea)
Chlorella (cloroficea)
Tetraselmis
(cloroficea)
Monochrysis
(crisoficea)
Isochrysis
(crisoficea)
CICLO
TEMPERATURA
OPTIMA
DIAMETRO
MEDIO
10 h
25°C
10.4
13.1 h
18°C
>20
24 h
16°C
17.8
7.7 h
25°C
5
18 h
18°C
18.4
15.3 h
20−25°C
10
30.2 h
20°C
10.2
Estas especies se han utilizado en acuicultura marina dados su valor nutritivo y digestibilidad, además
de su capacidad para crecer en cultivos masivos. La duración del ciclo celular como los
requerimientos de temperatura son susceptibles de variación mediante selección de variedades.
TABLA Nº 2 Requerimientos PRINCIPALES DE LOS CULTIVOS DE MICROALGAS
REQUERIMIENTOS
COMPUESTOS
QUIMICOS
VALORES
2,000 −
4,000 lux
Luz
15 −
22°C
0.37
7−9
Temperatura
Nutritivos
Físicos
Salinidad
pH
Redox
C
O, H
N
CO2CO3"
O2H2O
N2NH4+
NO3
PO4"
SO4"
Sales
P
S
Na, K, Ca, Mg
Fe, Zn, Mn, B, Br,
Sales
Si
g/100 ml
g/100 ml
g/100 ml
g/100 ml
g/100 ml
g/100 ml
mg/100
ml
10
Cu, Co, Cl, I, Sr,
Rb, Al, et
Vitaminas
g/100
ml
B12, tiamina, g/100
biotina
ml
Sales
En esta tabla Nº 1 se exponen los requerimientos principales de los cultivos de microalgas y sus
valores aproximados. En cada caso habrá que estudiar los requerimientos particulares de la especie y
de la variedad que se vaya a cultivar en las condiciones concretas de cultivo que se van a utilizar, por
lo que estos datos son sólo orientación (Kinne, 1979).
En la tabla Nº 2 se muestran las características de algunas de las especies de microalgas unicelulares
utilizadas en acuacultura para la nutrición de moluscos y crustáceos.
Además del control de los parámetros antes mencionados es necesario considerar que para el
establecimiento de un sistema de producción de alimento vivo es importante el dominio de las
técnicas de aislamiento, purificación y mantenimiento de cepas, así como el conocimiento de la
fisiología, ciclo de vida, bioquímica, etc. de las especies para determinar su factibilidad de cultivo y
sobre todo su contenido nutricional para poder llevarse a niveles masivos de producción para fines
acuaculturales. La Tabla 8 muestra algunos de los principales requerimientos de los cultivos de
microalgas.
2. MEDIOS DE CULTIVO
Se han desarrollado diferentes medios para el cultivo de microalgas que van desde las fórmulas para
enriquecer el agua de mar natural, hasta el uso de medios artificiales que permitan resultados
constantes en contraste con los resultados tan variables que brinda el uso del agua de mar natural que
entre otros factores depende del lugar donde se colecta ésta, y el tiempo de almacenamiento de la
misma.
Los medios artificiales se usan principalmente para fines experimentales, ya que como se ha
mencionado, brinda resultados constantes, aunque existen algunas especies que no crecen en medios
artificiales por factores desconocidos que afectan su crecimiento, las principales fórmulas utilizadas
van desde el agua de Miguel, que data de 1910, desarrollada por Allen−Nelson; el medio de
End−Schereiber de 1934, hasta fórmulas específicas para familias como la fórmula del Laboratorio
Haskins de Nueva York para diatomeas, Provasoli et al., 1975; Matthiesen & Thorner, 1966;
McIachlan, 1973; Guillard F., 1973; Droop, 1975, 1979; Schoene, 1982, etc. Las principales
formulaciones de los medios de cultivo, tanto de mantenimiento de cepas como de producción masiva
(minerales, enriquecidos y orgánicos), se describen desde la Tabla 9 hasta la Tabla 16.
El fitoplancton se desarrolla y multiplica en relación de las condiciones fisicoquímicas del medio. En
términos generales son los macronutrientes o factores limitantes del crecimiento el carbono,
Nitrógeno, Fósforo, Silicio, Magnesio, Potasio y Calcio, que se requieren en cantidades relativamente
grandes, mientras que los llamados micronutrientes (Fierro, Manganeso, Cobre, Zinc, Sodio,
Molibdeno, Cloro y Cobalto) se necesitan en menores cantidades.
Existen otros medios que incluyen en su composición sustancias orgánicas (vitaminas, aminoácidos)
necesarios para aquellas especies de microalgas Auxótrofas, es decir que no sintetizan por medio de la
fotosíntesis este tipo de compuestos y resultan factores que pueden limitar su crecimiento; tal es el
caso de Platimonas, Chrysophytas y algunas Bacillariophyceas.
3. TECNICAS DE AISLAMIENTO Y PURIFICACION
11
Muchos métodos se han desarrollado para obtener cultivos monoespecíficos (de una sola especie) y
axénicos (libres de contaminantes). A continuación se brinda una breve descripción de algunos de los
principales métodos que se utilizan para aislar y purificar microalgas (O. Umebayashi, 1975) (Fig. 1).
1) Aislamiento
Pipeteo capilar: Se utiliza para separar microalgas mayores de 10, mediante una pipeta construída
con un tubo capilar, a través del microscopio óptico se pesca las células y se separan en pequeñas
gotas de nutrientes colocados alrededor de una Caja de Petri o en portaobjetos escabados.
Rayado de Placas de Agar: Se transfieren pequeñas gotas de plancton con una asa de siembra,
extendiendo por estrías (rompiendo un poco el agar). Este agar se prepara con una solución nutritiva
para microalgas y con una relación de 1−1.5% w/v de agar disuelto en el medio nutritivo, se incuba la
placa bajo iluminación a 18−20°. De este primer crecimiento se transfiere a tubos con agar inclinado
sembrando por estrías o bien, se transfiere a medios líquidos en subcultivos sucesivos para su
purificación, de tal manera que en cada dilución se reduzca el número de organismos en una gota, es
recomendable combinar la técnica de diluciones con la de transferencia en placa de agar o tubo
inclinado para obtener cultivos clonales (de una sola colonia o célula) y poder establecer el cultivo
monoespecífico. Después de 10 días, pequeñas colonias aparecen sobre la superficie del agar, que se
pueden transferir mediante el Método de Hocking o de la micropipeta a medios líquidos.
2) Purificación
Como ya se mencionó al describir las técnicas de aislamiento, estas mismas nos permiten purificar el
cultivo a través de las resiembras clonales sucesivas, pero además es recomendable entre otros
métodos el uso de antibióticos para eliminar otros microorganismos, generalmente de tipo bacteriano
que estén contaminando el cultivo de microalgas de nuestro interés. En el inciso 5 de este mismo
capítulo correspondiente a Métodos de Esterilización se amplian las alternativas.
12