DANAGENE RNA PURIFICATION KIT REF.0801.1 100 EXTRACCIONES

DANAGENE RNA PURIFICATION KIT
REF.0801.1 100 EXTRACCIONES
REF.0801.2 500 EXTRACCIONES
1.INTRODUCCION
Este kit permite la permite la obtención de ARN total a partir de cultivos celulares, tejidos animales,
bacterias, levaduras, fluidos biológicos y mezcla de reacciones utilizando para ello columnas con
una membrana de sílica.
Las células son lisadas por incubación en una solución que contiene agentes caotrópicos que inactivan
inmediatamente las RNasas (las cuales están presentes en todos los materiales biológicos) y a la vez crean
las condiciones de unión apropiadas que favorecen la absorción del ARN en la membrana de sílica.
Después de la lisis, se realiza una homogenización y filtración con un filtro que se provee con el kit. El
ADN contaminante unido a la membrana de sílica puede ser eliminado con una solución de DNasa (no
suministrada con el kit) bien aplicada directamente en la membrana, o bien, una vez eluido el ARN total.
Las sales, metabolitos y componentes celulares son eliminados por lavados con dos tampones diferentes.
El ARN total es eluido con agua libre de nucleasas.
El ARN total preparado con el DANAGENE RNA PURIFICATION KIT es útil para aplicaciones como
RT-PCR,
Northern, primer extension, tecnología de “arrays” y ensayos de protección de la RNasa.
1. COMPONENTES DEL KIT
Tampón de Lisis ARN
45 ml
RT
Tampón RW1
45 ml
RT
Tampón de Lavado (añadir etanol)
25 ml
RT
Agua Libre Nucleasas
10 ml
RT
Columnas de Filtración
100 unid.
RT
Columnas ARN
100 unid.
RT
Tubos de Recolección
200 unid.
RT
El Tampón de lisis ARN y el Tampón RW1 contiene guanidinio de isotiacianato que es un potente irritante, llevar
guantes y gafas protectoras. Ambos tampones pueden formar componentes reactivos peligrosos cuando se
combinan con lejía.
Equipos y reactivos necesarios y no provistos con el kit







Etanol 100 %
Etanol 70 %
Microcentrifuga.
Microtubos de 1. 5 ml y 2.0 ml.
Homogenizadores generales para homogenizar tejidos animales y de plantas.
Nitrógeno líquido.
-mercaptoetanol.
3. PROTOCOLO GENERAL
3.1 Consideraciones preliminares
1. Tamaño muestra:

Hasta 5 x 10 6 Células

Hasta 25 mg tejido

Hasta 1 x 109 bacterias

Hasta 5 x 10 7 levaduras
2.
3.
4.
5.
Promedio ARN obtenido: Hasta 70 µg
Volumen Elución: 50 – 100 µl
Capacidad de Unión: 100 µg
Tiempo/ preparación < 30 minutos / 6 prep
Es posible obtener hasta 70 µg de ARN total, cuando como muestra se utiliza 5 x 106 células o 25 mg de tejido.
El ARN obtenido puede ser utilizado para RT-PCR. Generalmente, entre 1-10% del total del ARN obtenido a partir
de 1 x 106 células o 10 mg de tejido es suficiente para ser utilizado en RTPCR.
El ARN obtenido a partir de muestras iniciales pueden presentar trazas de ADN en la preparación. Es por ello
que si se ha de utilizar en RT-PCR recomendamos utilizar bajas cantidades de muestra inicial y un
tratamiento con DNasa I en la columna o una vez eluido el ARN.
3.2 Preparaciones preliminares




Añadir 100 ml de alcohol 100 % a la solución de lavado concentrada, marcar la fecha.
Debido a la omnipresencia de RNasas es absolutamente esencial que todo el material inicial sea congelado en
Ni Líquido y conservado a –70°C. Añadir las soluciones de lisis lo antes posible, una vez añadida la solución
de lisis, el lisado puede ser conservado a –70°C durante meses.
El ARN no está protegido hasta que el material es congelado en Ni líquido o lisado en presencia de agentes
desnaturalizantes. Por tanto, es importante que las muestras sean congeladas en Ni líquido, inmediatamente
y conservadas a –70°C, también puede utilizarse DANAGENE PROTECT SOLUTION o ser procesadas
inmediatamente. Las muestras pueden ser conservadas en la solución de lisis después de la homogenización
a –70°C durante 1 año, a 4°C durante 24 horas y hasta varias horas a temperatura ambiente.
El uso de -mercaptoetanol en la lisis es altamente recomendado para tejidos animales, particularmente en
aquellos que se sabe que tienen un alto contenido en RNAsas (ejem.páncreas), al igual que en tejidos de
plantas. También se recomienda para aquellos usuarios que quieren aislar RNA para aplicaciones muy
sensibles o enriquecimiento de microRNA. Alternativamente, la Solución de Lisis RNA puede ser utilizada tal
y como es suministrada.
3.3 Protocolo para purificación de ARN a partir de tejido animal
1.
Añadir 400 l de Tampón de Lisis ARN + 4.0 l de -mercaptoetanol al tejido pulverizado con Ni
líquido. Homogenizar con homogenizador eléctrico manual.
Homogenización de la muestra: homogenizar hasta 25 mg de tejido congelado y pulverizarlo con
nitrógeno
líquido . IMPORTANTE: Es esencial para una eficiente preparación de ARN que todo el ARN que contiene la
muestra sea liberado de las células por la homogenización con un homogenizador mecánico (tipo Polytron), tener
cuidado en mantener el rotor sumergido para evitar formar mucha espuma.
Para los tejidos frescos y blandos utilizar el homogenizador; para los tejidos frescos duros o ricos en RNasas
pulverizar con Ni líquido; para los tejidos congelados blandos o pequeñas piezas utilizar el homogenizador; para
todos los demás tejidos congelados pulverizar con Ni líquido.
2.
Centrifugar 2 minutos a máxima velocidad. Pasar el sobrenadante a una columna de filtración.
3.
Reducir la viscosidad y limpiar el lisado por filtración a través de una columna de filtración. Colocar la
columna de filtración en un tubo de recolección, aplicar el lisado y centrifugar 1 minuto a 8.000 x g.
Transferir el filtrado a un nuevo tubo de centrifuga. No agitar el pellet de desechos celulares que se puede
observar en el fondo del tubo de recolección después de la centrifugación. Este paso también elimina gran
parte del ADN genómico contaminante, no siendo total para aquellas aplicaciones que requieren una
eliminación total, para ello realizar un tratamiento con DNasa I en la columna o una vez eluido el
ARN.
4.
Añadir 400 l de Etanol 70 % al filtrado resultante del paso 3 y mezclar por vortex o pipeteo. Después de
añadirse el etanol se puede observar un precipitado que no afectará al proceso, asegurarse de cargar todo el
precipitado en la columna. Si después del paso 2 y 3 el volumen del lisado es menor de 400 l, añadir 1
volumen igual de etanol 70%.
5.
Coger una columna de unión ARN más su tubo de recolección y añadir el lisado. Centrifugar a 8.000 x g
(10.000 rpm)durante 60 segundos. Colocar la columna en un nuevo tubo de recolección. La capacidad
máxima de la columna es de 750 l. Repetir el proceso si mayores volúmenes son utilizados
6.
Añadir 400 l de Tampón de RW1 y centrifugar a máxima velocidad(11.000 x g) durante 1 minuto.
7.
Añadir 500 l de Tampón de Lavado y centrifugar a máxima velocidad(11.000 x g) durante 1 minuto.
8.
2º Lavado: Añadir 500 l de Tampón de Lavado y centrifugar a máxima velocidad(11.000 x g) durante 1
minuto.
9.
Centrifugar durante 3 minutos adicionales para eliminar todo el etanol residual. Eliminar el tubo de
recogida.
10. Colocar la columna en un microtubo nuevo de 1.5 ml ( no suministrado con el kit) para eluir el ARN total.
11. Eluir el ARN en 30-50 l de Agua libre de Nucleasas (suministrada).Incubar 2 minutos y centrifugar a
máxima velocidad (11.000 x g) durante 1 minuto.
12. Eluir el ARN con otros 30-50 l de Agua libre de Nucleasas (suministrada).Incubar 2 minutos y
centrifugar a máxima velocidad (11.000 x g) durante 1 minuto.
3.4 Protocolo de extracción de ARN total a partir de células animales en cultivo
Nota: La máxima cantidad recomendada de células es 3 x 10 6 . Pellets de células pueden ser conservados a -70ºC
para un uso posterior (determinar el número de células antes de congelar). Los pellets congelados no deberán ser
conservados más de 2 semanas para asegurar que la integridad del ARN no se verá comprometida. El Tampón de
lisis RNA se añadirá directamente sobre los pellets congelados sin dejar que alcancen la temperatura ambiente.
1.A) Extracción ARN total de células creciendo en monocapa
1.
Aspirar el medio y lavar las células con una cantidad apropiada de PBS.Aspirar el PBS.
2.
Añadir directamente 400 l de Solución de Lisis RNA + 4.0 l de -mercaptoetanol directamente a la
placa de cultivo.
3.
Lisar las células, tapar la placa y agitar el tampón alrededor de la superficie de la placa durante 5 minutos.
4.
Pasar el lisado a un microtubo y homogenizar con un homogenizador eléctrico manual.
5.
Centrifugar 2 minutos a máxima velocidad. Pasar el sobrenadante a una columna de filtración.
6.
Reducir la viscosidad y limpiar el lisado por filtración a través de una columna de filtración. Colocar la
columna de filtración en un tubo de recolección, aplicar el lisado y centrifugar 1 minuto a 8.000 x g.
Transferir el filtrado a un nuevo tubo de centrifuga. No agitar el pellet de desechos celulares que se puede
observar en el fondo del tubo de recolección después de la centrifugación. Este paso también elimina gran
parte del ADN genómico contaminante, no siendo total para aquellas aplicaciones que requieren una
eliminación total, para ello realizar un tratamiento con DNasa I en la columna o una vez eluido el
ARN.
7.
Añadir 400 l de Etanol 70 % al filtrado resultante del paso 6 y mezclar por vortex o pipeteo. Después de
añadirse el etanol se puede observar un precipitado que no afectará al proceso, asegurarse de cargar todo el
precipitado en la columna. Si después del paso 6 el volumen del lisado es menor de 400 l, añadir 1
volumen igual de etanol 70%.
8.
Coger una columna de unión ARN más su tubo de recolección y añadir el lisado. Centrifugar a 8.000 x g
(10.000 rpm)durante 60 segundos. Colocar la columna en un nuevo tubo de recolección.La capacidad
máxima de la columna es de 750 l. Repetir el proceso si mayores volúmenes son utilizados
9.
Añadir 400 l de Tampón de RW1 y centrifugar a máxima velocidad(11.000 x g) durante 1 minuto.
10. Añadir 500 l de Tampón de Lavado y centrifugar a máxima velocidad(11.000 x g) durante 1 minuto.
11. 2º Lavado: Añadir 500 l de Tampón de Lavado y centrifugar a máxima velocidad(11.000 x g) durante 1
minuto.
12. Centrifugar durante 3 minutos adicionales para eliminar todo el etanol residual. Eliminar el tubo de
recogida.
13. Colocar la columna en un microtubo nuevo de 1.5 ml ( no suministrado con el kit) para eluir el ARN total.
14. Eluir el ARN en 30-50 l de Agua libre de Nucleasas (suministrada).Incubar 2 minutos y centrifugar a
máxima velocidad (11.000 x g) durante 1 minuto.
15. Eluir el ARN con otros 30-50 l de Agua libre de Nucleasas (suministrada).Incubar 2 minutos y
centrifugar a máxima velocidad (11.000 x g) durante 1 minuto.
1.B) Extracción de ARN total de células creciendo en solución
1.
Transferir la suspensión celular a un tubo libre de RNAsas (no suministrado) y centrifugar a no más de
200x g (aprox. 2.000 rpm) durante 10 minutos para pellet las células.
2.
Cuidadosamente eliminar el sobrenadante.
3.
Añadir 400 l de Solución de Lisis RNA + 4.0 l de -mercaptoetanol al pellet. Lisar las células por
vortex durante 15 segundos. Asegurarse que todo el pellet está disuelto antes de proceder con el siguiente
paso
4.
Centrifugar 2 minutos a máxima velocidad. Pasar el sobrenadante a una columna de filtración.
5.
Reducir la viscosidad y limpiar el lisado por filtración a través de una columna de filtración. Colocar la
columna de filtración en un tubo de recolección, aplicar el lisado y centrifugar 1 minuto a 8.000 x g.
Transferir el filtrado a un nuevo tubo de centrifuga. No agitar el pellet de desechos celulares que se puede
observar en el fondo del tubo de recolección después de la centrifugación. Este paso también elimina gran
parte del ADN genómico contaminante, no siendo total para aquellas aplicaciones que requieren una
eliminación total, para ello realizar un tratamiento con DNasa I en la columna o una vez eluido el
ARN.
6.
Añadir 400 l de Etanol 70 % al filtrado resultante del paso 5 y mezclar por vortex o pipeteo. Después de
añadirse el etanol se puede observar un precipitado que no afectará al proceso, asegurarse de cargar todo el
precipitado en la columna. Si después del paso 5 el volumen del lisado es menor de 400 l, añadir 1
volumen igual de etanol 70%.
7.
Coger una columna de unión ARN más su tubo de recolección y añadir el lisado. Centrifugar a 8.000 x g
(10.000 rpm)durante 60 segundos. Colocar la columna en un nuevo tubo de recolección. La capacidad
máxima de la columna es de 750 l. Repetir el proceso si mayores volúmenes son utilizados
8.
Añadir 400 l de Tampón de RW1 y centrifugar a máxima velocidad(11.000 x g) durante 1 minuto.
9.
Añadir 500 l de Tampón de Lavado y centrifugar a máxima velocidad(11.000 x g) durante 1 minuto.
10. 2º Lavado: Añadir 500 l de Tampón de Lavado y centrifugar a máxima velocidad(11.000 x g) durante 1
minuto.
11. Centrifugar durante 3 minutos adicionales para eliminar todo el etanol residual. Eliminar el tubo de
recogida.
12. Colocar la columna en un microtubo nuevo de 1.5 ml ( no suministrado con el kit) para eluir el ARN total.
13. Eluir el ARN en 30-50 l de Agua libre de Nucleasas (suministrada).Incubar 2 minutos y centrifugar a
máxima velocidad (11.000 x g) durante 1 minuto.
14. Eluir el ARN con otros 30-50 l de Agua libre de Nucleasas (suministrada).Incubar 2 minutos y
centrifugar a máxima velocidad (11.000 x g) durante 1 minuto.
3.5 Protocolo de extracción de ARN total a partir de bacterias.
Nota: Se recomienda no utilizar más de 1 x 109 células /ml, el crecimiento bacteriano puede ser medido por un
espectrofotómetro, como regla general, un cultivo de E.coli de 1 x 109 células /ml tiene una DO 600 de 1.0.
Preparar una cantidad apropiada de TE conteniendo lisozima, esta solución se preparará con TE libre de RNAsas y
conservado en hielo hasta su uso. Para Gram-negativos la concentración de lisozima será de 1 mg/ml y Grampositivos la concentración de lisozima será de 3 mg/ml.
1.
Pellet las células por centrifugación (aprox. 14.000 rpm) durante 1 minuto.
2.
Eliminar el sobrenadante y resuspender por vortex el pellet en 100 l del TE con la cantidad apropiada
de lisozima.Incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos.
3.
Añadir 300 l de Solución de Lisis RNA. Lisar las células por vortex durante 15 segundos. Asegurarse
que todo el pellet está disuelto antes de proceder con el siguiente paso
4.
Reducir la viscosidad y limpiar el lisado por filtración a través de una columna de filtración. Colocar la
columna de filtración en un tubo de recolección, aplicar el lisado y centrifugar 1 minuto a 8.000 x g.
Transferir el filtrado a un nuevo tubo de centrifuga. No agitar el pellet de desechos celulares que se puede
observar en el fondo del tubo de recolección después de la centrifugación. Este paso también elimina gran
parte del ADN genómico contaminante, no siendo total para aquellas aplicaciones que requieren una
eliminación total, para ello realizar un tratamiento con DNasa I en la columna o una vez eluido el
ARN.
5.
Añadir 400 l de Etanol 70 % al filtrado resultante del paso 4 y mezclar por vortex o pipeteo. Después de
añadirse el etanol se puede observar un precipitado que no afectará al proceso, asegurarse de cargar todo el
precipitado en la columna. Si después del paso 4 el volumen del lisado es menor de 400 l, añadir 1
volumen igual de etanol 70%.
6.
Coger una columna de unión ARN más su tubo de recolección y añadir el lisado. Centrifugar a 8.000 x g
(10.000 rpm) durante 60 segundos. Colocar la columna en un nuevo tubo de recolección. La capacidad
máxima de la columna es de 750 l. Repetir el proceso si mayores volúmenes son utilizados
7.
Añadir 400 l de Tampón de RW1 y centrifugar a máxima velocidad(11.000 x g) durante 1 minuto.
8.
Añadir 500 l de Tampón de Lavado y centrifugar a máxima velocidad(11.000 x g) durante 1 minuto.
9.
2º Lavado: Añadir 500 l de Tampón de Lavado y centrifugar a máxima velocidad(11.000 x g) durante 1
minuto.
10. Centrifugar durante 3 minutos adicionales para eliminar todo el etanol residual. Eliminar el tubo de
recogida.
11. Colocar la columna en un microtubo nuevo de 1.5 ml ( no suministrado con el kit) para eluir el ARN total.
12. Eluir el ARN en 30-50 l de Agua libre de Nucleasas (suministrada).Incubar 2 minutos y centrifugar a
máxima velocidad (11.000 x g) durante 1 minuto.
13. Eluir el ARN con otros 30-50 l de Agua libre de Nucleasas (suministrada).Incubar 2 minutos y
centrifugar a máxima velocidad (11.000 x g) durante 1 minuto.
3.6 Protocolo de extracción de ARN total a partir de levaduras
Nota: Se recomienda no utilizar más de 107 células de levadura o 1ml de cultivo.
Preparar una cantidad apropiada de Tampón de Resuspensión que contenga liticasa : 50mM tris, pH 7.5, 10 mM
EDTA, 1M Sorbitol, 0.10 % -mercaptoetanol y 1 unidad / l de liticasa. Esta solución debería prepararse con
reactivos estériles y libres de RNAsas y mantenida en hielo hasta ser utilizada.
1.
Pellet las levaduras por centrifugación (aprox. 14.000 rpm) durante 1 minuto.
2.
Eliminar el sobrenadante y resuspender por vortex el pellet en 100 l del Tampón de Resuspensión con la
cantidad apropiada de liticasa.Incubar a 37ºC durante 10 minutos.
3.
Añadir 300 l de Tampón de Lisis RNA y vortex durante 15 segundos. Asegurarse que todo el pellet está
disuelto antes de proceder con el siguiente paso
4.
Reducir la viscosidad y limpiar el lisado por filtración a través de una columna de filtración. Colocar la
columna de filtración en un tubo de recolección, aplicar el lisado y centrifugar 1 minuto a 8.000 x g.
Transferir el filtrado a un nuevo tubo de centrifuga. No agitar el pellet de desechos celulares que se puede
observar en el fondo del tubo de recolección después de la centrifugación. Este paso también elimina gran
parte del ADN genómico contaminante, no siendo total para aquellas aplicaciones que requieren una
eliminación total, para ello realizar un tratamiento con DNasa I en la columna o una vez eluido el
ARN.
5.
Añadir 400 l de Etanol 70 % al filtrado resultante del paso 4 y mezclar por vortex o pipeteo. Después de
añadirse el etanol se puede observar un precipitado que no afectará al proceso, asegurarse de cargar todo el
precipitado en la columna. Si después del paso 4 el volumen del lisado es menor de 400 l, añadir 1
volumen igual de etanol 70%.
6.
Coger una columna de unión ARN más su tubo de recolección y añadir el lisado. Centrifugar a 8.000 x g
(10.000 rpm)durante 60 segundos. Colocar la columna en un nuevo tubo de recolección.La capacidad
máxima de la columna es de 750 l. Repetir el proceso si mayores volúmenes son utilizados
7.
Añadir 400 l de Tampón de RW1 y centrifugar a máxima velocidad(11.000 x g) durante 1 minuto.
8.
Añadir 500 l de Tampón de Lavado y centrifugar a máxima velocidad(11.000 x g) durante 1 minuto.
9.
2º Lavado: Añadir 500 l de Tampón de Lavado y centrifugar a máxima velocidad(11.000 x g) durante 1
minuto.
10. Centrifugar durante 3 minutos adicionales para eliminar todo el etanol residual. Eliminar el tubo de
recogida.
11. Colocar la columna en un microtubo nuevo de 1.5 ml ( no suministrado con el kit) para eluir el ARN total.
12. Eluir el ARN en 30-50 l de Agua libre de Nucleasas (suministrada).Incubar 2 minutos y centrifugar a
máxima velocidad (11.000 x g) durante 1 minuto.
13. Eluir el ARN con otros 30-50 l de Agua libre de Nucleasas (suministrada).Incubar 2 minutos y
centrifugar a máxima velocidad (11.000 x g) durante 1 minuto.
4. GUIA DE PROBLEMAS Y SOLUCIONES
Dado el amplio número de muestras que pueden ser tratadas para extraer ARN total utilizando este kit, es difícil
hacer una generalización de problemas, recomendamos ponerse en contacto con el servicio técnico de DANAGENBIOTED [email protected] para cualquier consulta adicional respecto a los protocolos de trabajo o problemas que
puedan surgir durante el trabajo.