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IMPLANTES DE POLÍMEROS SINTETIZADOS POR PLASMA EN LESIONES DE MÉDULA
Resumen
Uno de los problemas de salud pública es la lesión de médula espinal (LME) en accidentes. La ingeniería de
tejidos es una rama de la medicina que se ha visto enriquecida por la ciencia de materiales y se pretende
utilizarla para realizar implantes de cualidades regenerativas.
Se supone que los materiales poliméricos conductores y semiconductores sintetizados por plasma logran la
función de servir como neuro-protectores, y promotores de la reconexión nerviosa.
Los polímeros fueron sintetizados por plasma, por medio de un reactor con descarga de resplandor de baja
presión. Se utilizó como monómero pirrol y como dopante iodo (PPy/I). El modelo de lesión fue el de sección
completa de la médula espinal (LSC). Justo en el sitio de lesión se introdujo en forma trasversal un trozo de
polímero. Se obtuvieron microfotografías de un corte histológico de la médula espinal para un animal de
control y para uno con implante.
En microfotografías en el caso del animal de control se puede ver que se generan grandes cavidades en la
médula (quistes) que impiden la regeneración celular y provocan la parálisis. La disminución de los quistes es
una indicación de neuro-protección. La recuperación funcional es la evidencia más clara de la reconexión
nerviosa.
Introducción
Uno de los problemas de salud pública que afecta principalmente a la población económicamente activa es la
lesión de médula espinal (LME). En México no se tienen estadísticas detalladas pero se estima que la
incidencia anual de daño a la médula espinal en la población de EE. UU, es aproximadamente de 11,000 casos
al año, sin incluir aquellos que mueren en el accidente [1]. Actualmente no se cuenta con una estrategia
terapéutica efectiva para reestablecer la función neurológica normal después de una LME, esto se debe a la
complejidad para regular los mecanismos de daño secundario, así como la baja capacidad de regeneración
espontánea de las células neuronales [2, 3]. Durante varios años se ha intentado establecer el posible efecto
benéfico de los implantes en el tejido nervioso después de una LME con el fin de promover una posible
recuperación funcional. En estudios experimentales de LME, se ha incrementado el uso de roedores como
modelo animal [3-4].
La ingeniería de tejidos es una rama de la medicina altamente interdisciplinaria que se ha visto enriquecida
por la ciencia de materiales, entre ellos los materiales poliméricos tienen una gran participación. Los
polímeros conductores y semiconductores son parte explícita de este avance [5]. Una parte de los materiales
poliméricos participantes son aquellos que se obtienen en base a la polimerización por plasma, donde
destacan los tratamientos superficiales para mejorar la biocompatibilidad o para dar lugar a superficies
modificadas que permiten cumplir con objetivos específicos en los biosistemas [6-8].
Este trabajo discute el uso de polímeros sintetizados por plasma en implantes en la médula espinal, su función
como neuroprotectores, y promotores de la reconexión nerviosa en el caso de una lesión en la médula espinal.
Procedimiento Experimental
Los polímeros fueron sintetizados por plasma, por medio de un reactor con descarga de resplandor de baja
presión. Se utilizó como monómero pirrol y como dopante iodo (PPy/I). También se sintetizo un copolímero
pirrol-polietilenglicol (PPy/PEG) por medio de polimerización por plasma. Esto se realizó en un reactor
tubular de vidrio, con electrodos de acero inoxidable [9]. Los parámetros fueron: Campo eléctrico de radio
frecuencia de 13.5MHz, potencia 18W, presión 1.5x10 -2 Torr, y temperatura 365K, el tiempo total de reacción
fue de 300min. El material obtenido se molió y se compactó para formar una pastilla ( 0.1cm de espesor) que
se usó como implante en la LME de ratas de laboratorio. El análisis estructural de los polímeros se obtuvo con
un espectrómetro de infrarrojo con transformada de Fourier (Perkin-Elmer 2000) a partir de películas usando
32 barridos.
El modelo de lesión fue el de sección completa de la médula espinal (LPSC) [10], la lesión se hizo a la altura
de las vértebras 8 y 9 utilizando tijeras de microcirugía y corroborando la desconexión completa con un
gancho quirúrgico, al termino de la sección, justo en el sitio de lesión se introdujo en forma trasversal un trozo
de polímero (figura 1.) cerrando después meninges y piel y aplicando cuidados postoperatorios. Se utilizaron
ratas hembras adultas de la cepa Long Evans, entre12–14 semanas de edad con peso corporal de entre 230250gr.
Figura 1. En la fotografía se puede apreciar la médula expuesta y el material colocado en sitio de la lesión.
La evaluación de la función motora de las extremidades posteriores de los animales se realizó por medio de la
escala BBB (Basso, Beattie y Bresnahan), la cual evalúa la marcha motora tomando en consideración las
articulaciones de la cadera, rodilla y tobillo a través de 22 grados de recuperación motora; donde el grado 0
representa la ausencia absoluta de movimiento y el grado 21 una marcha normal. Los valores de BBB se
tomaron con dos observadores independientes que no tenían información sobre el tratamiento que se les había
dado a los animales. Las primeras evaluaciones se realizaron 1 día después de la LPSC y se continuo
realizándolas una vez por semana durante 8 semanas. La estadística que se utilizo fue desviación estándar
directa aún cuando en la literatura se recomiendan análisis más completos pero se trabajó con 8 sujetos por lo
que en nuestro caso este análisis es adecuado [11].
Después de ocho semanas de la LPSC de la médula espinal los animales fueron perfundidos. Primero se
anestesiaron con ketamina e hidrocloruro de xilacina a dosis de 77.5 y 12.5mg/Kg. de peso corporal. Fueron
perfundidos con formaldehído. Se retiro un segmento de la médula espinal de 1cm de largo aproximadamente
centrado en el epicentro de la LPSC. Las muestras fueron deshidratadas con diluciones graduale de alcohol y
ocluyo en parafina, realizando cortes longitudinales con microtomo. Se les realizó un estudio histológico con
la técnica de hematoxilina y eosina de Harris. Las imágenes de los segmentos de médula espinal fueron
adquiridas y digitalizadas con una cámara sony 300FX , software IM 1000, y microscopio Leica V.4.01.
3343
2932
Absorbancia (u.a)
Absorbancia (u.a)
1452
3349
1377
747
2200
3500
3000
1662
742
1092
673
605
2220
PPy-PEG
PPy-I
4000
2946
1428
1630
2500
2000
1500
1000
Longitud de onda (cm -1)
500
4000
3000
2000
1000
Longitud de onda (cm-1)
Figura 2. Espectro de infrarrojo de polipirrol dopado con yodo (superior) y copolímero polipirrolpolietilenglicol (inferior).
Resultados Experimentales
Los polímeros obtenidos son característicos de la polimerización por plasma de onda continua y potencia
media, en el proceso se da ruptura del monómero y se obtiene un película de material cuyo espesor es
proporcional al tiempo de reacción. La figura 2 presenta espectros de infrarrojo de polipirrol plasma (PPy/I) y
el copolímero pirrol-etilenglicol. Se puede distinguir en PPy/I las absorciones en 2940 y 2220, estas no están
en el pirrol químico y la primera se asocias a CH y CH 2 alifáticos que son producto del rompimiento de los
anillos de monómero, mientras que la segunda se asocia a grupos nitrilo, esto nos da un material con
características muy diferentes a pirrol químico ya que esta entrecruzado y no se pudo disolver, sin embargo
se hincha con agua y con acetona.
Su conductividad es muy baja pero cambia significativamente ante la humedad [9]. El copolimero PPy/PEG
muestra estas dos absorciones pero ademas muestra un absorción mucho mas ancha en 3443, que denota los
grupos OH del PEG. Una de las características de los polímeros sintetizados por plasma es que se obtiene una
película polimérica que es la base del implante, mientras que en la mayoría de los trabajos en la literatura el
plasma se utiliza como modificador superficial.
La figura 3 muestra tres microfotografías de un corte histológico de la médula espinal para un animal control
(a), uno con implante de PPY/PEG (b) y otro de PPY/I (c), se
Figura 3. Fotografías (5X) de los cortes histológicos con tinción HE en la parte superior es para un animal
control, la central es para uno implantado con PPy/PEG, y la inferior para uno implantado con PPy/I.
puede ver que en el caso del control se generan grandes cavidades (quistes) que después impiden la
regeneración celular y provocan la desconexión nerviosa y por lo tanto la parálisis. En el caso del PPy/PEG
se presentan menos quistes en la zona del implante se puede distinguir el tejido creciendo alrededor del
polímero, en esta zona se pueden ver huecos que se generan en el corte histológico ya que el tejido que rodea
el polímero no mantiene su consistencia al momento de realizarse el corte con el microtomo.
.
Figura 4. Fotografía de una rata control (izquierda) las articulaciones están totalmente inmóviles y se puede
notar una inflamación en la zona de la lesión. La rata con un implante de PPY/I se muestra a la derecha, esta
presenta movimiento en las articulaciones y se sostiene en las extremidades afectadas.
Para los animales con PPy/I tenemos las mismas características pero en general con este polímero se tiene un
desprendimiento mayor en el corte esto puede deberse a que en este caso no se tiene una parte bioasimilable o
biodegradable y el tejido que rodea el polímero es más fácil de romper en el corte. La disminución de los
quistes es una clara indicación de neuroprotección ya que se disminuyen los mecanismos de defensa del
organismo y el daño es limitado, esto permite una mayor posibilidad de crecimiento celular y por lo tanto de
reconexión nerviosa.
La recuperación funcional es la evidencia más clara de la reconexión nerviosa. La figura 4 muestra fotografías
de un animal control y de uno con implante de PPy/I, como se puede ver el control mantiene sus extremidades
posteriores sin flexibilidad y sin movimiento en las uniones, mientras el que tiene material muestra
movimiento en varias de las uniones en las extremidades posteriores, sin embargo su evaluación se hace con
estándares que presentan ciertos problemas sobre todo en el caso de lesiones severas como es el caso de la
LPSC [11], sin embargo este es el sistema reconocido en la literatura especializada y por eso se utilizó.
La figura 4 muestra la grafica de recuperación funcional medida por medio de la escala BBB, como función
del tiempo después de la lesión medida en semanas, las barras son desviación estándar (n=8). Como se puede
ver, la diferencia en recuperación es significativa, la evaluación en el caso del PPy/PEG aunque es en el
promedio mayor que los controles, la incertidumbre no permite ser conclusivos respecto a la reconexión, es
claro de las histologías que se tiene una menor densidad de quistes pero la recuperación funcional tiene
muchas variantes y en particular algunos de los animales tienen baja evaluación.
6
5
4
3
BBB
P P Y /I
C ontrol
2
1
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
-1
Semana
Figura 4. Recuperación funcional de ratas control y de ratas implantadas con PPy/I
Conclusiones
Al aumentar el número de animales en el experimento es claro que el material polimérico está ayudando a la
neuroprotección y reconexión de la médula espinal. En este momento estamos desarrollando varias líneas de
estudio para mejorar el seguimiento por medio de imágenes en vivo, evaluar la reconexión por medio de
potenciales evocados y programas computacionales para evaluar sistemáticamente las fotografías de las
histologías, así como el uso de tecnicas que no requieran el sacrificio del animal para el estudio de la
evolución del implante, como Tomografía axial computarizada (rayos X) e Imágenes con resonancia
Magnética. También se está estudiando el comportamiento del material en cultivos celulares in vitro, de esta
manera podemos variar las condiciones de síntesis y composición estudiando su respuesta y optimizando el
material.
Bibliografia
1. National Spinal Cord Injury Statistical Center (NSCISC) at, Birmingham, Alabama. (
http://www.spinalcord.uab.edu)
2. Christos Profyris, et al; Neurobiology of Disease 15 (2004), 415-436.
3. Clerie E. Hulsebosch; Adv Physiol Educ 26(2002), 238-255.
4. S. Rochkind, A. Shahar, D. Fliss, D. El-Ani, L. Astachov, T. Hayon, M. Alon, R. Zamostiano, O. Ayalon,
I. E. Biton, Y. Cohen, R. Halperin, D. Schneider, A. Oron, Z. Nevo, Eur Spine J (2006) 15: 234–245
5. Guimarda NK, Gomezb N, Schmidt CE, Prog. Polym. Sci. 32 (2007) 876–921
6. Förch R, Chifen AN, Bousquet A, Khor HL, Jungblut M, Chu L, Zhang Z, Osey-Mensah I, Sinner EK, and
Knoll W, Chem. Vap. Deposition 2007, 13, 280–294
7. Siow KS, Britcher L, Kumar S, Griesser HJ, Plasma Process. Polym. 2006, 3, 392 – 418
8. Chen KS, Chen SC, Lien WC, Tsai JC, Ku YA, Lin HR, Lin FH, Wu TH, Chen CC, Chen TM and Chiou
SH, Journal of the Vacuum Society of Japan, (2007), 50,10, 609-614
9. G. J. CRUZ, J. MORALES and R. OLAYO, Thin solid films 342
(1999) 119
10. R. Olayo, C. Ríos, H. Salgado-Ceballos, G. J. Cruz, J. Morales, M. G. Olayo, A. L. Alvarez, R. Lozano,
J. C. Morales, A. Diaz-Ruiz, Journal of Materials Science-Materials in Medicine 19 (2): 817-826, 2008
11. TE de Barros Filho, AE Molina, Clinics (Sao Paulo Brazil), 63,1, 103-108, 2008