Las preoteína verde fluorescentes fueron descriptas desde 1962 en

Castroagudín, V.L
Proteínas Fluorescentes Rojas
Proteínas Fluorescentes Rojas
Una puerta a nuevas posibilidades
Desde 1999 se han hallado, purificado y clonado una serie de nuevas proteínas fluorescentes:
una verde, una naranja y una proteína roja, no fluorescente, de una anémona mediterránea
Anemonia sulcata [18]; de especies no bioluminiscentes anthozoarias[19] de los Océanos Índico y
Pacífico: seis proteínas homólogas a avGFP pero que emiten fluorescencia roja y amarilla; y del coral
Discosoma genus [20], la proteína fluorescente roja que rodea su disco oral.
Proteínas Fluorescentes de A. sulcata
Características
Las proteínas fluorescentes de A. sulcata fueron denominadas asFP499, asFP522 y asFP595.
La proteína roja no fluorescente recibió el nombre c de asCP562 (ver Figura 6). La proteína verde (a
pesar del color de su fluorescencia se describe en esta sección para poder compararla con las demás
proteínas obtenidas del mismo espécimen con mayor comodidad), posee un espectro de excitación
con dos máximos: a 480 nm y 511 nm, y un hombro alrededor de los 400 nm. El espectro de emisión
presenta los picos a 499 y 522 nm. La razón entre los máximos de emisión cambian según la
intensidad de la luz con que se excite las proteínas, lo cual también varía según el espécimen de
anémona. Esto indicaría, en un principio, la existencia de dos tipos de proteínas fluorescentes verdes
en los tentáculos del animal, con máximo de excitación emisión a 480/499nm y otra a 511/522 nm. La
proteína naranja hallada en esta anémona del mediterráneo se distingue por tres máximos de
excitación a 278 nm, 337 nm y 574 nm, con un sólo pico de emisión a 595 nm.
Figura 6. Localización de las proteínas: GFPs en la parte superior, la proteína fluorescente naranja en la parte
inferior y la proteína rojiza (no fluorescente) en la punta de los tentáculos, a la luz del día (A) y bajo UV, a
369 nm (B). Criosección de un tentáculo (C) irradiado con UV a 365 nm. La PF naranja se localiza en la
parte inferior ( la fluorescencia a virado al amarillo por artificio de la fijación), la fluorescencia roja de
entodermo es producto por la clorofila de zooxanthellas, no de una proteína; [18].
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Las masas moleculares determinadas por SDS-Page, fueron 26.2 kDa para la fracción
conteniendo ambas proteínas verdes, que son imposibles de separar por pasos de purificación, y 19.1
kDa para asFP595 y asCP562, por filtración en gel todas las proteínas dieron un peso aparente de 66
kDa. Para las proteínas verdes esto se debe a su tendencia natural a formar dímeros o trímeros, en
condiciones desnaturalizantes estos polímeros pueden parcialmente dividirse en los monómeros de 23
kDa. Todas estas proteínas presentan gran estabilidad ante los tratamientos con calor, detergentes,
agentes caotrópicos, agentes reductores y pH. La fluorescencia de asFP595 es más termoestable que
la de asFP499/asFP522. En cambio, la fluorescencia de asFP499 es más estable frente a
desnaturalizantes químicos (1% SDS, 8 M urea, y pH 11). Esta propiedad en las proteínas verdes, se
mantiene aún tratándolas con una solución 4% de para-folmaldehído. La capacidad de fluorescer en
todos lo casos se recupera sin inconvenientes luego de un proceso de denaturalizaciónrenaturalización, e incluso asCP562 que no es fluorescente in vivo, adquiere esta propiedad luego de
renaturalizarse, como asFP595; ver Figura 7.
Figura 7. Espectros de excitación/ emisión de las proteínas fluorescentes aisladas de A. sulcata (A) y clonadas en E. Coli (B).
Espectro de absorción de la proteína roja aislada del mismo animal (C) y clonada en E. coli (D), [18]
Propiedades de los pigmentos [18]
Proteína
asFP499/522
asFP499(clonada)
asFP595
asCP562
asCP562(clonada)
Masa molecular
determinada, kDa
26.2*/23.0+/66.6#
26.2*
19.1*/66.0+#
19.1*/66.0+#
19.1*/66.0+#
Número de
aminoácidos
-228
--148
* por
SDS-PAGE
por filtración en gen en condiciones desnaturalizantes
#
por filtración en gel en condiciones fisiológicas.
§ después de sufrir un de proceso desnaturalización-renaturalización
+
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Máximo de absorción/excitación, nm
<280/~400/480/511
278/403/480
278/337/574
562
562
Maximo de emisión
499/522
499
595
595§
595§
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Descripción de los distintos niveles estructurales y su relación con la
fluorescencia
La asFP499 posee 228 aminoácidos y una masa molecular calculada en base a su secuencia de
25.4 kDa. Con 148 aminoácidos y 16.5 kDA, asCP562 es significativamente más pequeña. Ambas
proteínas son homólogas de la GFP de A. victoria. El extremo N terminal de as499 y asCP562 posee
tres aminoácidos menos que otras GFP homólogas distantes. La relación entre todas las proteínas
similares a avGFP evaluadas por alineamiento múltiple, sugiere que los diferentes colores en la
fluorescencia evolucionaron independientemente a partir de una ancestro común [19].
Los elementos del barril- característicos de GFP se encuentran también presentes en la
estructura secundaria de estas proteínas, esto incluye regiones -turn- y los caps, en cuanto a la
secuencia, la región del N terminal hasta el residuo 140 para las proteínas verdes y desde el N
terminal al residuo 135 para asCP562, son las más conservadas. Esta última carece de las regiones que
codifican para los cordones  7 a 10 de avGFP, sin embargo la región C terminal es la que
corresponde al cordón -11. Basados en la alineación y en posibles estructuras terciarias, calculadas
por programas de computación, se ha determinado que asCP562 forma una especie de semi-barril-,
de al menos seis cordones.
El fluoróforo de asFP499 y el de asCP562 tienen básicamente la misma estructura, en estas
proteínas los residuos 66 y 67 son conservados, mientras que la serina 65 se reemplaza por Gln o
Met. Se atribuye a la Arg 96 una función catalítica en la formación del cromóforo, cuyo proceso es
básicamente igual que en avGFP.
Las dos GFP pueden ser distinguidas por sus propiedades espectrales pero no pueden ser
separadas en la purificación y tienen idéntico peso molecular; esto indica que son dos estados de la
misma proteína. Por su parte la proteína fluorescente naranja asFP595 y la no fluorescente roja
asCP562, poseen también el mismo peso molecular; luego de la renaturalización ambas muestran la
misma fluorescencia con un pico en 595, pero en este caso, la relación que las une es estructural. La
estructura de barril-, que rodea al cromóforo completamente como se ha mencionado, es
indispensable para el desarrollo de la fluorescencia, posibilitando la interacción del cromóforo con las
cadenas laterales de la proteína y resguardándolo del quenching. Tal ambiente puede ser
proporcionado por el semibarril  de asCP562, pero para ello debe estar presente asFP595.
Se propuso entonces, que la formación del barril  se obtiene por multimerización de al
menos dos moléculas de asCP562, que formaría una estructura de 12 cordones que rodea a el/los
fluoróforos por completo. Entonces, la masa molecular de 66kDa para la proteína fluorescente
naranja (asFP595) corresponde exactamente a un tetrámero de asCP562, en un gel en condiciones de
renaturalización de asFP595 se observa una segunda banda si la desnaturalización se lleva a cabo sin
-mercaptoetanol. La segunda banda presentaría el doble del peso molecular de asFP595, lo que
confirmaría la hipótesis del dímero, cuyos monómeros sólo se separan en presencia de agentes
reductores, indicando que están unidos covalentemente por puentes disulfuro (posiblemente entre las
Cys 64).
Así, a través de la multimerización, se crearía un ambiente propicio y estable para el
desarrollo de la fluorescencia, lo que no es extraño ya que todas las proteínas fluorescente hasta
ahora halladas salvo GFP de A. victoria son dímeros estables y no disociables, pero en la mayoría de
ellas la dimerización no involucra la aparición de la fluorescencia.
Aplicaciones
Estas proteínas pueden ser utilizadas como marcadores celulares in vivo en células eucariotas,
se han probado con éxito en células de Drosophila melanogaster, protoplastos de Nicotiana tabacum y
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Arabidopsis thaliana. Además, la asFP499 presenta una fluorescencia mayor que las variantes
mejoradas de GFP de A. victoria.
Proteínas Fluorescentes en ejemplares del género Discosoma.[20,21,22]
Se descubrieron varias proteínas fluorescentes en los representantes del genero Discosoma.
Su función, es en parte, contribuir a la coloración de su hospedador y posiblemente protegerlo de la
radiación UV. De particular interés son aquellas proteínas que emiten en el rojo, (max > 580 nm).
Ya que además de ser útiles en marcaciones múltiples, permiten eludir la autofluorescencia de los
tejidos y extender los rangos de trabajo en experimentos de FRET[1]. Una de estas proteínas
fluorescentes roja es ya comercializada bajo en nombre de DsRed, proveniente de este coral.
Caracterización de DsRed
DsRed es un polipéptido de 28 kDa, tiene esencialmente el mismo cromóforo que avGFP,
formado autocatalíticamente a partir de los residuos Gln 66-Tyr 67-Gln 68. Su similitud de secuencia
con avGFP es del 23%, aunque algunos aminoácidos que rodean al cromóforo están estrictamente
conservados y son posiblemente imprescindibles para la fluorescencia, (el Glu 215 y la Arg 95, que se
corresponden con el Glu 222 y la Arg 96 de avGFP). Los espectros de excitación y emisión tienen sus
máximos a 551.5 y 583 nm, (con un hombro pequeño a 494 nm y un pico importante debido al
Figura 8. Espectro de
emisión (máx. a 583 nm) y
excitación (máx. a 551.5) de
DsRed comparado con dos
tipos de colorante a base de
Rhodamina [22].
triptofano a 280 nm), ver Figura 8. El monómero posee a 558 nm un coeficiente de extinción de
aproximadamente 75000 mol-1/cm-1 y un rendimiento cuántico de 0.7 [22]. En experimentos de
FRET, DsRed es una excelente pareja para YFP, ya que esta última tiene un máximo de emisión en
aproximadamente 525 nm.
La maduración de DsRed requiere varios días a temperatura ambiente y aparentemente tiene
un intermediario obligatorio con fluorescencia verde. Este intermediario sería similar a avGFP. La
maduración requiere oxigeno molecular, y la formación de cromóforo rojo no supera el 50% [10]. Se
ha propuesto que el paso final de la maduración involucra una segunda oxidación, la del enlace
peptídico entre el carbono  y el N de Gln 66 para formar una acilamina, la cual amplía la
conjugación del cromóforo. Para más detalle ver referencias [20 - 21].
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Estructura terciaria y cuaternaria
A pesar de la baja similaridad secuencial
entre avGFP y DsREd, sus estructuras terciarias
son semejantes (ver Figura 9). DsRed consiste
en un “-can”(o barril ) de 11 cordones , con
una hélice  central coaxial y caps helicoidales en
los extremos. En la superposición de avGFP y
DsRED , 164 carbonos  se traslapan con un
rms=1Å. Diferencias en otras regiones, fuerzan a
los residuos de la cadena principal de DsRed (del
197 a 220, y 140 al 145), a estar más cerca de
fluoróforo, lo cual tiene consecuencia directas y
muy importantes en el ambiente de este último.
Figura 9 .Superposición de las estructuras de avGFP (puntos
negros) y DsRed (puntos blancos), [20].
DSRed existe como un tretrámero (Figura
10) muy empaquetado, con forma de un cubo con
paredes asombrosamente lisas y atravesado por un
orificio elíptico, el cual está tapizado con residuos
polares y puentes salinos. Un gran número de
moléculas del solvente se localizan en las paredes del
orificio. Es este tretrámero el carbono C-terminal del
monómero A abraza al monómero C y viceversa.
Esto posiciona la His 222 y Phe 224 en bolsillos de
la subunidad adyacente. La Phe se encastra en una
ranura entre la Arg C216 y el Glu C218, y la His 222
se une por puentes de hidrógeno al carbono
carbonilo de la Ser 146 y al del Asp 196. La mayor
parte de la interfase A-C involucra una zona de
Figura10. Tetrámero de DsRed [20].
protuberancias en la estructura terciaria, en
contacto con el cromóforo, sugiriendo que la
formación del tretrámero es importante para el correcto plegamiento y la formación adecuada del
entorno para el cromóforo. En un apareamiento inusual, la His C162 mantiene simultáneamente
puentes salinos y de hidrógeno con el Glu- C176, formando lo que parece ser una parte importante
de la interfase entre A-C.
Microambiente del fluoróforo
Como ya se adelantó el cromóforo de DsRed, está formado por un tripéptido, ubicado en el
centro de la hélice coaxial. El ambiente que rodea al cromóforo es extremadamente polar.
Considerando la red de puentes salidos y de hidrógeno ( ver Figuras 11 y 12) es mucho más complejo
que el ambiente del fluoróforo de avGFP. En DsRed existen más cargas enterradas en el core de la
proteína, incluidos tres residuos de lisina (70, 83 y 163) y un glutámico (residuo 148) que
interaccionan con el cromóforo, ausentes en avGFP. Las cargas positivas y negativas se acomodan en
dos zonas perpendiculares entre si, con la banda positiva aproximadamente paralela al eje mayor del
cromóforo ( y al dipolo transiente), y la negativa perpendicular a este eje bisectando el cromóforo.
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El oxígeno del fenolato del cromóforo forma un puente de hidrógeno con la Ser 146 y con
una molécula de agua cercana, y sorprendentemente también interactúa con una lisina enterrada en
el interior de la molécula, (Lys 163). La conservación del Glu 215, se extiende también a su posición
en el espacio, la cual es muy similar a la del Glu 222 de avGFP; aunque se encuentra un poco más
cerca al cromóforo e interactúa con una molécula de agua que está estratégicamente posicionada
cerca de la Gln 66. El Glu 215 interacciona también con una carga positiva de la cadena de lisina
cercana (Lys 70); en cambio en avGFP el Glu 222 forma un puente de hidrógeno con una serina.
Debido a la posición del esqueleto carbonado, la Leu 199 en DsRed, equivalente a la Ser 205
de avGFP, está 2.5 Å más próxima al cromórofo [20]. Estas interacciones
Figura 11. Esquematización distintas
representaciones de éste último [20].
Figura 12. Esquema del microambiente que rodea al fluoróforo, basado en referencia 20.
hacen que el Glu 215 se encuentre cargado todo el tiempo y no intercambie protones con el
cromóforo. La Gln 213 y la Asn 42 mediente puentes de hidrógeno, ayudan a posicionar la cadena
lateral de la Gln 66, que está involucrada en la fluorescencia roja y sobresale del plano del cromóforo.
Base estructural de la fluorescencia roja
La fluorescencia roja que sucede a la verde, sugiere que la maduración del cromóforo se lleva
a cabo en varios pasos (para un análisis detallado remitirse a referencias [20] y [21]), en los que los
residuos conservados juegan un rol principal. Baird y Gross, proponen, que la formación del
cromóforo de DsRed involucra una oxidación del Gln 66. De los estudios estructurales se desprende
que ningún enlace covalente nuevo se forma durante la maduración, por lo tanto los cambios que
conducen a la fluorescencia roja son sutiles. Aunque la geometría del carbono  de la Gln 66 no fue
restringida durante el refinamiento cristalográfico de la estructura, y los cuatro cromóforos adoptan
naturalmente un ordenamiento planar consistente con la hibridación sp2 de este centro. El carbono ,
el N de la cadena principal de la Gln 66 y el carbono carbonilo de la Phe 65 son coplanares con el
resto del cromóforo; a pesar de que la conjugación del enlace C=O de la Phe 65 es casi perpendicular
al plano del fluoróforo.
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Los mapas de densidad electrónica de DsRed muestran mezcla de cromóforo maduro e
inmaduro. Con estos datos se ha logrado dilucidar el mecanismo de la oxidación final que daría lugar
a la maduración y el cambio de fluorescencia del verde hacia el rojo. Presumiblemente una
conformación catalítica del oxígeno gamma de la Ser 69 se posicionaría sobre el enlace N-C del
residuo 66, en forma apropiada para capturar un protón, activando al Glu 215,. De esta manera el
cromóforo inmaduro contendría un enlace peptídico cis entre la Phe 65y la Gln 66 ( el cual no existe
en el cromóforo maduro y es trans en avGFP). La Ser 69presenta dos conformaciones, una de las
cuales es catalítica para la última reacción de oxidación. El mecanismo de formación del fluoróforo se
muestra en la Figura 13.
- 22 Figura 13. Esquematización de las etapas propuestas para la
formación del fluoróforo de DsRed, basado en [20 – 21]
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Comparando los fluoróforos de DsRed y avGFP se observa:
1. La maduración del cromóforo de avGFP involucra una oxidación, la del cromóforo de
DsRed dos.
2. Los carbonos  de la Gln 66 y la Thr/Ser 65 son claramente diferentes, tienen
hibridación sp2 en DsRed y sp3 en avGFP.
3. Las posiciones de las glutaminas (215 o 222) son distintas respecto al cromóforo). En
DsRed se encuentra más próxima y unidas a una molécula de agua que se sitúa sobre el
heterociclo cerca del enlace N-C de Gln 66. Esta molécula de agua puede ser producto
de la reacción de oxidación final.
Las posiciónes de la Gln 66 y el Glu 215 son esenciales para la parición de la fluorescencia
roja, el ácido glutámico juega un papel importante en la maduración del cromóforo, tanto en
la formación de las especies que emiten en el verde como en el rojo.
La unión hace la fuerza
En DsRed los cuatro monómeros unidos formarían una especie de antena cuadrada de 27 por
34 Å haciendo que la transferencia de energía entre los cromóforos sea posible. Esto es de gran
importancia porque el 50% de los cromóforos no madura mas allá del estadío de la fluorescencia
verde, la transferencia de energía no radiativa de los centros que emiten en el verde hacia los que lo
hacen en rojo hacen que un tetrámero híbrido sea 100 % eficiente. Cabe mencionar que por mapeo
de la densidad electrónica no se han detectado cromóforos incompletos (inmaduros o con enlaces
rotos), por ello de estar presentes, estos deben estar desordenados rotacionalmente dentro de las
cuatro subunidades.
Desventajas en la utilización de DsRed
A pesar de estar ya en el comercio, DsRed no es un marcador perfecto, presenta ciertas
propiedades indeseables a la hora de utilizarla como marcador celular. Su maduración es lenta, la
formación del cromóforo aparentemente incompleta y la obligada oligomerización puede acarrear
problemas al fusionarla con otras proteínas y al emplearla como gen reporter. La formación del
tetrámero de DsRed es muy problemática, ya que se asocia covalentemente otras proteínas, como
proteínas de membranas. Por ello es intensa la búsqueda de mutantes y el detallado estudio
cristolográfico con el objetivo de mejorar esta molécula (para una excelente explicación de este tema
ver referencia[22]).
Se cree que la proteína avGFP es una versión “rota” de una proteína ancestral roja, cuyo
desarrollo quedó detenido en el estadio del intermediario. Sin embargo la intrincada estructura y el
ambiente polar del cromóforo de DsRed sugieren otra cosa. La fluorescencia roja es el resultado de
una interacción extremadamente sutil y complicada, de una ensamblaje de sitios activos más
evolucionada y optimizada, que en caso de avGFP.
Proteínas fluorescentes de especies antozoarios no bioluminicentes
[19]
De corales de la región oceánica Indo-pacífica, se obtuvieron seis proteínas fluorescentes
homologas a acGFP. Dos de ellas poseen características espectrales muy diferentes, emiten
fluorescencia amarilla y roja. Estas proteínas demuestran que organismos no bioluminiscentes pueden
poseer proteínas biolomuniscentes, denotando que ambas propiedades no siempre están ligadas.
Carácterísticas
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La secuencia aminoacídica de estas proteínas presenta de un 26 a un 30 % de homología con
avGFP. En base a alineamientos de secuencia se observó que la estructura terciaria posee la forma de
-can, característico de las proteínas fluorescentes, así como otros elementos observados en avGFP,
por ejemplo las porciones que forman los cap se encuentran perfectamente conservadas ( los
aminoácidos 82-91 forman el cap superior y las 129-140 el inferior del barril). Cinco de estas nuevas
proteínas tienen el extremo N terminal tan largo como el de avGFP; cfFP484, posee 37 residuos más,
de los cuales 19 constituirían un péptido señal.
Propiedades espectrales
Las características espectrales, así como la procedencia de las proteínas descriptas en esta
sección se especifican en la siguiente tabla [19].
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Ambiente del fluoróforo
En este grupo de proteínas la presencia de un sólo pico de absorción, similar al de 475 nm de
avGFP, indica que el fluoróforo de se encuentra siempre desprotonado. En las proteínas fluorescentes
de anthozoarios el Glu 222 es incapaz de formar un puente de hidrógeno con el residuo 65. Además
en la posición 205 este grupo de proteínas, la serina es reemplazada por una isoleucina o una
leucina. Por ello, el Glu 222 y el hidroxilo del fluoróforo (el cual parece formarse de la misma manera
que en los demás proteínas fluorescentes) están siempre separados, y el Glu 222 no está involucrado
en la fotoisomerización. Sin embargo este residuo es conservado, por ende debe tener una función
importante quizás catalizando la formación del fluoróforo.
A pesar de la diferencia en la secuencia es notable, por alineación se ve la conservación de
residuos claves en la formación y estabilización del fluoróforo: la Tyr 66 y la Gly 67; en las proteínas
de Discosoma y Clavularia, además de los residuos 148 y 203, interviene el 167 , Hys o Lys.
Las características especiales de en ambiente del fluoroforo son:
1.
El residuo 69 se aproxima más al cromóforo, y generalmente es Asn o Lys. Una
posible contracarga para él es el Glu 150 que también se encuentra presente en todos
las nuevas proteínas.
2. Se forma un puente salino entre los residuos mencionados en 1. Este puente además,
favorecería la función del residuo 69.
3. Presencia de hasta cuatro Trp, dos de los cuales se localizan cerca del fluoróforo. Lo
que contribuiría a la presunta función de estas proteínas en proteger a los
organismos contra los rayos UV, (los que serían absorbidos por los Trp y liberada
como luz de mayor ).
4. Las diferencia entre las dos proteínas de las especies Zoanthus, y de Discosoma, es
mínima en la secuencia, pero importante en cuanto a la forma de los espectros de
absorción y emisión. (Todavía no se ha logrado correlacionar las propiedades
espectrales con la estructura primaria para estas proteínas).
Dado que el análisis del entorno del fluoróforo no explica el gran corrimiento
hacia el rojo, que se observa por ejemplo en dsFR583, se postula que una reacción autocatalítica
adicional tiene lugar durante la maduración del fluoróforo, la cual estaría inhibida in avGFP y
extendería el sistema  conjugado.
Aplicaciones
Estas proteínas han sido exitosamente expresadas en sistemas eucariotas demostrando ser
cuatro veces más estables que avGFP, abriendo, por ejemplo, el camino a nuevos ensayos para seguir
procesos más lentos. Para mayor detalle sobre estas proteínas consultar referencia [19].
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