proyecto de investigación - Sociedad Española de Medicina

PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
ESTUDIO EPIDEMIOLÓGICO DE LAS REPERCUSIONES CLÍNICAS,
FUNCIONALES Y BIOLÓGICAS DE LA EXPOSICIÓN AL VERTIDO
DE
FUEL
DEL
BUQUE
'PRESTIGE'
SOBRE
LA
SALUD
RESPIRATORIA EN MARINEROS DE LA COSTA DE GALICIA
Auspiciado por la
Sociedad Española de Neumología y Cirugía Torácica (SEPAR)
Febrero de 2003
RESUMEN
En las tareas de limpieza del vertido de fuel ocasionado por el naufragio del petrolero
‘Prestige’ han participado un número elevado de personas, que se han expuesto a posibles
efectos tóxicos sobre su salud. Se dispone de escasa información científica sobre la
repercusión clínica, funcional y biológica de la exposición a los vertidos de fuel sobre la
salud respiratoria. Los estudios realizados han sido recortados en el tiempo, con una
valoración funcional poco detallada, y sin investigar marcadores biológicos de daño celular y
molecular.
HIPÓTESIS: La exposición a algunos de los componentes del fuel puede inducir cambios
inflamatorios en la vía aérea que se manifestarían en hiperreactividad bronquial y aumento
de síntomas respiratorios. Estos componentes también poseen la capacidad de inducir
alteraciones cromosómicas que podrían predisponer al desarrollo de neoplasias.
OBJETIVOS: Investigar los efectos respiratorios de la exposcición al vertido de fuel del
‘Prestige’ en la población de marineros de la costa de Galicia, tanto desde una vertiente
clínica y funcional, como en marcadores biológicos de inflamación de la vía aérea y de
genotoxicidad.
MÉTODOS: Estudio transversal en dos etapas consecutivas en poblaciones de marineros
de la costa gallega. Mediante muestreo bi-etápico clásico se definirá la población diana. En
la segunda etapa se incluirán 2 grupos equivalentes de 500 marineros en cada uno,
diferenciados por la exposición al fuel. El estudio incluirá una encuesta de síntomas, el
estudio funcional respiratorio (espirometría forzada y prueba de broncoprovocación) y
mediciones de sensibilidad mediada por IgE. Se evaluará el estado inflamatorio de la vía
aérea mediante el análisis de marcadores de estrés oxidativo y de citocinas en el
condensado del aire exhalado. El potencial genotóxico de la exposición se evaluará
mediante estudios de inestabilidad genética (análisis de fragilidad cromosómica y técnicas
de citogenética molecular) y el análisis de aductos de hidrocarburos aromáticos policíclicos
en ADN de linfocitos.
1
EQUIPO INVESTIGADOR
Investigador principal
Dr. Héctor Verea Hernando
Servicio de Neumología, Complejo Hospitalario Universitario Juan Canalejo, A
Coruña.
Coinvestigadores
Dra. Gema Rodríguez Trigo
Dra. Marina Blanco Aparicio
Servicio de Neumología, Complejo Hospitalario Universitario Juan Canalejo, A
Coruña.
Dra. Mercedes Suárez Rodríguez
Servicio de Neumología, Hospital Xeral, Vigo.
Dra. Mª Elena Toubes
Servicio de Neumología del Complexo Hospitalario, Ourense.
Dra. Ana Palacios Bartolomé
Servicio de Neumología, Hospital Clínico, Santiago.
D.E. Felip Burgos Rincón
Servei de Pneumologia i Al.lèrgia Respiratòria, Hospital Clínic, Barcelona.
Jan-Paul Zock, PhD
Unidad de Investigación Respiratoria y Ambiental, Institut Municipal d’Investigació
Mèdica (IMIM), Barcelona.
Dra. Carme Fuster
Dra. Mª Angels Rigola
Departamento de Biología Celular, Universidad Autónoma de Barcelona.
Dra. Isabel Isidro
Instituto Nacional de Silicosis, Oviedo.
Comité científico asesor
Dr. Joan Albert Barberà Mir
Presidente del Comité Científico de la SEPAR.
Servicio de Neumología, Hospital Clínic de Barcelona.
Profesor Asociado, Facultad de Medicina, Universidad de Barcelona.
Dr. Francisco Pozo Rodríguez
Máster en Salud Pública. Comité Técnico Centro Respira de Investigación.
Responsable Científico del Grupo de Medicina Basada en la Evidencia, Servicio de
Neumología, Hospital Universitario 12 de Octubre, Madrid.
Unidad de Investigación, Hospital Universitario 12 de Octubre, Madrid.
2
Dr. Josep Mª Antó Boqué
Coordinador de la Unidad de Investigación Respiratoria y Ambiental, Institut
Municipal d’Investigació Mèdica (IMIM), Barcelona.
Profesor Titular, Departament de Ciencias Experimentales y de la Salud; Vicerrector
de Política Científica, Universitat Pompeu Fabra, Barcelona.
Dr. Josep Egozcue Cuixart
Catedrático. Area de Biología Celular, Departamento de Biología Celular, Fisiología
e Inmunología, Universidad Autónoma de Barcelona.
Comité Científico, Sociedad Internacional de Bioética.
Dr. Jordi To Figueras
Consultor. Servicio de Toxicología, Hospital Clínic de Barcelona.
Profesor Titular. Facultad de Medicina, Universidad de Barcelona.
3
ANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL DEL TEMA
El 14 de noviembre de 2002 se produjo el hundimiento del petrolero ‘Prestige’ y el
subsiguiente vertido de parte de las 77.000 toneladas de fuel contenidas en sus
depósitos. Este vertido alcanzó de lleno las costas de Galicia y otras comunidades
del norte de España dando lugar a la que se ha considerado mayor catástrofe
ecológica en nuestro pais. Desde el momento del naufragio hasta la actualidad se ha
producido una importante contaminación por fuel de las playas, las zonas rocosas y
los fondos marinos de la costa del noroeste español. La contaminación es extensa
pero heterogénea debido a las especiales características geográficas de la costa
gallega y a las condiciones metereológicas y de las corrientes marinas. De este
modo alternan núcleos de población muy afectados (como Fisterra o Muxía) con
municipios vecinos donde la repercusión fue mínima o nula (Noia o Vilagarcía de
Arousa).
La limpieza del fuel en la costa y su recogida en el mar ha sido una árdua
tarea en la que han participado amplios sectores de vecinos de estas localidades
gallegas y de otras comunidades, en una de las mayores muestras de solidaridad
colectiva vividas en nuestra historia reciente. Las repercusiones sociales han sido
muy importantes y han propiciado que una gran parte de los 28.270 tripulantes de la
flota que faena habitualmente en aguas territoriales gallegas no pueden pescar y se
dedican, diariamente desde hace 2-3 meses, a la recogida de fuel.
Las tareas de limpieza del fuel vertido por el buque ‘Prestige’ suponen la
exposición a los elementos potencialmente tóxicos que contiene dicho producto, con
un potencial efecto deletéreo sobre la salud. De hecho, según datos recientes de la
Consellería de Sanidade de la Xunta de Galicia [1] y a pesar de las medidas de
protección adoptadas, un número considerable de personas que han participado en
4
las tareas de limpieza del fuel han precisado valoración sanitaria. Es de destacar
que un 42% de casos que requirieron atención médica por problemas no traumáticos
presentaban irritación de la vía aérea y síntomas respiratorios.
El
fuel
que
transportaba
el
buque
‘Prestige’
está
compuesto
fundamentalmente por hidrocarburos aromáticos volátiles (benceno, tolueno),
hidrocarburos aromáticos policíclicos (naftaleno, fluorantenos, benzopirenos),
hidrocarburos saturados, metales pesados (níquel, zinc y vanadio), azufre, resinas y
asfaltenos [2]. Es un material de elevada viscosidad y alta densidad, con gran
tendencia a formar emulsiones estables con el agua. La pérdida por evaporación es
baja (2-5%). Según la International Agency for Cancer Research (Lyon, Francia), el
potencial carcinogenético de este producto se clasifica como 2B, lo que indica que
en estudios en animales hay evidencia de actividad carcinogenética de sus
componentes, si bien se requieren más estudios para determinar su potencial
carcinogenético en humanos.
En la última década se han producido diversos accidentes de grandes
petroleros en las costas de diferentes paises. Para estudiar las posibles
consecuencias de estos vertidos de petróleo sobre la salud fueron realizados
estudios epidemiológicos dirigidos a evaluar la salud de las poblaciones afectadas.
Los trabajos de limpieza de las zonas dañadas dan lugar a la exposición de los
individuos por dos vías fundamentales: la cutáneo-mucosa y la inhalatoria. Los
síntomas respiratorios son de los que se presentan con mayor frecuencia a corto
plazo. Presumiblemente, están relacionados con el contenido en hidrocarburos
aromáticos y poliaromáticos en el fuel [3]. Otros componentes químicos, presentes
en
menor
concentración,
también
pueden
estar
asociados
a
problemas
respiratorios [4].
5
Lyons y colaboradores [5] en un estudio de cohortes retrospectivo en 539
sujetos expuestos al fuel del ‘Sea Empress’ (Inglaterra, 1996) y 550 no expuestos,
identificaron como problemas fundamentales de la exposición: cefalea, dolor ocular y
odinofagia. No se realizó seguimiento posterior ni determinación de biomarcadores.
En el naufragio del ‘Nakhodka’ (Japón, 1997) se valoraron los problemas de salud
agudos de 282 individuos que participaron en la limpieza [6], de ellos un 69% refería
síntomas como lumbalgia, algias en miembros inferiores, cefalea, odinofagia,
lagrimeo, visión borrosa y dolor ocular. La intensidad y número de síntomas se
relacionaban con el número de días de trabajo y desaparecieron al interrumpir la
exposición. Los trabajos realizados para valorar las repercusiones del vertido del
buque ‘Erika’ (Francia, 1999) mostraron hallazgos similares en cuanto a
sintomatología aguda. En un estudio de 3669 trabajadores en la limpieza del fuel
procedente del ‘Erika’ dirigido a identificar problemas de salud y en el que no se
realizó seguimiento, el 53% presentaron alguno de los siguientes síntomas: cefalea,
dermatitis, enrojecimiento ocular, problemas respiratorios, náuseas, dolor abdominal.
Las estimaciones del riesgo teratógeno o cancerígeno a largo plazo se consideraron
despreciables [7], excepto en el caso de los limpiadores de aves en quienes existe
mayor riesgo de desarrollar cáncer de piel. En estudios de exposición ocupacional,
concretamente en el análisis del lavado nasal de trabajadores de calderas que están
en contacto con derivados del petróleo, se demostraron niveles altos de vanadio y
un estado inflamatorio agudo neutrofílico con elevación de interleuquina (IL) 8 y
mieloperoxidasa, con niveles normales de IL-6 y proteína catiónica del eosinófilo [8].
Hauser y colaboradores [9] demostraron que la exposición ocupacional a productos
de la combustión de petróleo se asocia a un descenso agudo del flujo espiratorio
máximo.
6
En referencia a los naufragios referidos, hay que subrayar que en los estudios
efectuados en personas expuestas a los vertidos de petróleo, el impacto respiratorio
de la exposición se evaluó con poco detalle, dado que sólo se emplearon
cuestionarios de síntomas y mediciones de función muy groseras, como la del flujo
espiratorio máximo. Dados los efectos irritantes que la exposición al fuel tiene sobre
la vía aérea y las superficies mucosas, y teniendo en cuenta además que alguno de
sus componentes tambien se encuentra en el humo del tabaco, es previsible que la
inhalación de estos productos produzca cambios inflamatorios sobre la vía aérea, tal
y como se ha observado en los lavados nasales en trabajadores de calderas [8].Los
mecanismos responsables de dicha respuesta inflamatoria pulmonar no han sido
aun completamente dilucidados. La activación de diversas citocinas proinflamatorias,
como las interleucinas (IL) o el TNF-alfa así como un incremento de la actividad de
la óxido nitrico sintasa (NOS) en las vías aéreas han sido involucrados en la
patogénesis de esta respuesta inflamatoria. Asimismo, los fueles residuales pueden
ser una fuente considerable de sustancias oxidantes capaces de producir daño
pulmonar tanto por sus efectos oxidativos directos como por la activación de
mecanismos inflamatorios.
El análisis de los constituyentes del exhalado pulmonar es una herramienta
incruenta para el diagnóstico y la monitorización de las enfermedades pulmonares.
El exhalado pulmonar está constituido por una fase gaseosa, donde es posible
detectar distintos compuestos volátiles endógenos tales como óxido nítrico (NO) o el
monóxido de carbono (CO), y una fase acuosa donde aparecen en suspensión
distintos compuestos no volátiles que pueden ser recuperados mediante la
condensación del aire exhalado por técnicas de enfriamiento. Refleja la composición
del fluido extracelular de revestimiento epitelial pulmonar y permite la estimación del
7
estrés oxidativo pulmonar a través de la medición de peróxido de hidrógeno o de
productos derivados de peroxidacíon lipídica como el 8-isoprostano. Del mismo
modo,
diversos
marcadores
inflamatorios
como
productos
derivados
del
metabolismo del óxido nítrico (nitritos, nitratos, nitrosotioles, nitrotirosina), citocinas
(IL-1, IL-8, TNF-alfa) o leucotrienos (LTB4, cisteinil-LTs) también pueden ser
cuantificados en el condensado del aire exhalado.
La presencia de cambios inflamatorios en la vía aérea podría favorecer la
aparición de procesos obstructivos, o bien agravar procesos previamente existentes
como el asma o la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). En este
sentido, aunque se trata de otro tipo de exposición, cabe destacar que para estudiar
las consecuencias respiratorias de los bomberos que participaron en las tareas de
desescombro del World Trade Center de Nueva York, el 11 de septiembre de 2001,
fueron empleados espirometría y prueba de provocación bronquial, metodología con
la cual fue constatado en un significativo número de casos el desarrollo de
hiperrreactividad bronquial y tos crónica [10].
Por consiguiente, no puede descartarse a priori que la exposición al vertido de
fuel del ‘Prestige’ pueda ocasionar cambios inflamatorios en la vía aérea que
favorezcan una mayor reactividad bronquial. Por este motivo es preciso que una
correcta evaluación de los efectos sobre la salud respiratoria de la exposición al
vertido de fuel, contemple la medición del estado inflamatorio de la vía aérea y de la
reactividad bronquial, empleando para ello técnicas de elevada sensibilidad.
En la valoración de las repercusiones del vertido del buque 'Braer' (Inglaterra,
1993) se realizaron determinaciones en muestras biológicas en el momento agudo y
después de 10 meses para evaluar potencial genotoxicidad secundaria a la
exposición [11]. Aunque el número de individuos analizados era muy limitado (20
8
expuestos y 7 no expuestos), no se demostró incremento de los niveles de aductos
de ADN relacionados con el vertido.
La inestabilidad genética en forma de alteraciones cromosómicas y /o
aumento en la expresión de fragilidad cromosómica, se considera un factor de
predisposición a diferentes tipos de cáncer. Esta alteración puede ser inducida por
condicionantes externos tales como mutágenos químicos o exposición a
radiaciones.Los Lugares Frágiles (FS) se expresan como gaps o roturas en bandas
específicas de cromosomas metafásicos bajo condiciones específicas de cultivo en
los que se inhibe la replicación o la reparación de DNA. Existen evidencias de una
correlación entre las bandas correspondientes a FS y los puntos de rotura
implicados en reorganizaciones cromosómicas observadas en neoplasia, la
localización de oncogenes y genes supresores de tumores así como de puntos de
rotura inducidos por mutágenos y carcinógenos [12,13]. Yunis y Soreng en 1984,
[14], sugirieron que el incremento de fragilidad podría originar
reorganizaciones
cromosómicas imprecisas, amplificaciones genéticas, activación de oncogenes o
pérdida de genes supresores de tumor. Hasta el momento, se han realizado pocos
estudios en los que se analiza la expresión de FS en trabajadores ocupacionalmente
expuestos a determinados agentes potencialmente mutágenos, observándose que
los FS más expresados coinciden con los puntos de rotura implicados en
reorganizaciones típicas de tumores [15]. Las mutaciones que se originaran en FS
loci podrían ser responsables del propio proceso canceroso no sólo por ser regiones
de DNA inestable sino también por su relación con genes que contribuyen
directamente al propio proceso neoplásico [16]. Las alteraciones cromosómicas,
numéricas y estructurales, tienen un papel esencial en la aparición de cáncer y
también pueden ser inducidas por agentes químicos y /o por radiaciones. El método
9
citogenético clásico utilizado para la detección e identificación de estas alteraciones
cromosómicas está basado en la realización y examen de los cromosomas
metafásicos mediante bandas G. Actualmente, se dispone de una nueva técnica de
citogenética molecular conocida como de hibridación “in situ” fluorescente (FISH)
que permite identificar, de forma rápida, anomalías cromosómicas que con las
técnicas convencionales pasan desapercibidas, o no pueden llegar a caracterizarse.
La FISH multicolor permite detectar reorganizaciones crípticas y con sondas
teloméricas
(multitel-FISH)
se
pueden
explorar
las
regiones
teloméricas,
especialmente ricas en genes. Hasta el momento se han publicado dos estudios en
los que se relaciona la sobreexpresión de FS concretos con anomalias
cromosómicas en telómeros [17,18]. Dado que la utilización de esta técnica es muy
reciente, se dispone de muy poca información respecto al papel que desempeñan
estas anomalías cromosómicas cripticas (subteloméricas o no) en la predisposición /
aparición de cáncer.
Es bien conocido que numerosos carcinógenos ambientales sufren un
proceso de bioactivación endógeno-tisular mediado por enzimas de fase I como el
citocromo P-450, que conduce a la formación de intermediarios reactivos(epóxidos,
electrófilos). Estos intermediarios reactivos tienden a unirse al ADN formando
aductos, resultado de la unión del tóxico intermedio con alguna base nitrogenada del
ADN. La formación de aductos en genes críticos como p53 induce mutagénesis en el
momento de la replicación celular y eventualmente carcinogénesis. Aunque no sea
posible analizar directamente los aductos en tejidos diana, actualmente es posible,
mediante técnicas cromatográficas y/o inmunológicas, estudiar los aductos en ADN
linfocitario. Ello da una medida representativa del grado de exposición y de la dosis
interna. Así, se ha utilizado el análisis de aductos de hidrocarburos aromáticos
10
policíclicos
en
ADN
de
linfocitos
de
personas
expuestas
y
fumadores,
configurándose como un tipo de análisis muy útil en el campo de la salud pública y la
epidemilogía molecular. Un estudio realizado en trabajadores de refinerías de
petróleo mostró que el grado de exposición a hidrocarburos aromáticos policíclicos
supone un factor de riesgo para la formación de aductos con el DNA [19].
A la vista de estos antecedentes, un comité "ad hoc" designado por la Junta
Directiva de la Sociedad Española de Neumología y Cirugía Torácica (SEPAR) ha
considerado que existe la posibilidad de que la exposición al vertido de fuel del
buque ‘Prestige’ tenga efectos nocivos sobre la salud respiratoria. Por este motivo, la
SEPAR, conjuntamente con el Centro Respira de Investigación (CRI), han impulsado
una comisión de estudio sobre los posibles efectos respiratorios de esta exposición,
formada por expertos de distintas disciplinas (neumólogos, epidemiólogos,
toxicólogos, especialistas en medicina laboral y genetistas).
Fruto del trabajo de esta comisión nace este proyecto de investigación,
dirigido a evaluar los efectos respiratorios de la exposición al vertido del buque
‘Prestige’ en una amplia población de marineros gallegos. El estudio principal es de
corte epidemiológico y estará dirigido a evaluar tanto la prevalencia de síntomas
respiratorios como signos de irritación e hiperrreactividad de la vía aérea. Este
estudio se complementará con otro sobre biomarcadores de genotoxicidad. El
primero estará dirigido a evaluar el estado inflamatorio de la vía aérea, empleando
para ello una de las técnicas más novedosas que permite, de modo incruento,
analizar marcadores biológicos contenidos en el condensado del aire exhalado. El
segundo estará dirigido a analizar el efecto genotóxico de la exposición al fuel en los
marineros, estudiando aductos de ADN y determinando si se produce un incremento
de
inestabilidad
genómica,
evaluada mediante
la
expresión
de
fragilidad
11
cromosómica y la aparición de alteraciones cromosómicas, especialmente crípticas,
en linfocitos de estos individuos. De encontrar dicha inestabilidad se establecería la
existencia de un mayor riesgo en estos pescadores a desarrollar algún tipo de
cáncer, especialmente los que afectarían a los tejidos más expuestos al fuel, como
el pulmón.
12
BIBLIOGRAFIA
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14. Yunis and Soreng (1984). Science 226:1199-1204
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18. Musio et Mariani (1999). J.Environ. Pathol. Toxol. Oncol. 18:11-15
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13
HIPOTESIS
1º.
La exposición inhalatoria repetida a hidrocarburos volátiles del fuel del buque
'Prestige', especialmente cuando ocasiona síntomas irritativos respiratorios,
produce inflamación e hiperrespuesta bronquial.
2º.
La exposición al fuel da lugar a un incremento de inestabilidad genómica, que
podría desembocar en un mayor riesgo de cáncer, especialmente cáncer de
pulmón.
OBJETIVOS
Objetivo principal
Investigar los efectos respiratorios clínicos y subclínicos de la exposición al fuel del
buque 'Prestige' mediante la evaluación de alteraciones respiratorias biológicas y
funcionales.
Objetivos intermedios
1.- Definir la población de estudio:
1.1.
Evaluación de la salud respiratoria en una población de marineros en relación
con las especiales características de su actividad laboral.
1.2. Definición de una población base de marineros gallegos bien caracterizada
para seguimiento (estudio de cohorte prospectiva).
1.3.
Evaluación de las tareas de recogida del fuel en relación con la exposición
inhalatoria por expertos de higiene laboral, con el fin de desarrollar un
cuestionario válido para la determinación de la exposición inhalatoria en un
diseño epidemiológico.
14
1.4. Estudio de la relación entre tareas de recogida de fuel y síntomas
respiratorios.
2.- Recoger la información necesaria:
2.1. Estudio espirométrico y prueba de provocación con metacolina en marineros
expuestos y no expuestos
2.2. Análisis de marcadores de la inflamación en condensado de aire exhalado en
expuestos y no expuestos
2.3.
Análisis y cuantificación de la inestabilidad genómica y de aductos de ADN:
2.3.a)
análisis de la fragilidad cromosómica mediante la determinación de
la expresión de lugares frágiles en expuestos y no expuestos.
2.3.b)
análisis de alteraciones cromosómicas por métodos de citogenética
básica (Bandas G) y
mediante las técnicas de FISH (alteraciones
cromosómicas crípticas por pintado cromosómico multicolor M-FISH
y subteloméricas mediante M-TEL-FISH) en marineros expuestos y
no expuestos.
2.3.c)
estudio de la formación de aductos de hidrocarburos aromáticos
policíclicos en el ADN de linfocitos de expuestos y no expuestos.
15
UTILIDAD PRACTICA
Los resultados del estudio producirán conocimiento de impacto sanitario en relación
con:
 Intervenciones inmediatas si se detecta una mayor frecuencia de eventos clínicos
respiratorios en los sujetos expuestos.
 Intervenciones cautelares si se detecta una mayor frecuencia de alteraciones
biológicas (mediadores de inflamación o daño genético), marcadores de un
potencial
incremento de riesgo de neoplasias y enfermedades pulmonares
inflamatorias crónicas en enfermos expuestos.
 Y como valor añadido, un primer acercamiento sistemático al conocimiento del
estado de salud de una población de trabajadores poco estudiada hasta la fecha.
16
METODOS
DISEÑO
Estudio transversal en dos etapas consecutivas en poblaciones de marineros de la
costa gallega.
Se aplicará un muestreo bi-etápico clásico para definir bien la población diana y para
controlar la población no respondedora.En la segunda etapa se incluirá un grupo de
marineros con exposición al vertido de fuel del 'Prestige', y un grupo sin dicha
exposición.
POBLACION DE ESTUDIO
Los sujetos proceden de la población de marineros asociados con las cofradías
gallegas, incluyendo tanto las zonas afectadas como las zonas no afectadas por el
fuel. Aplicando esta estrategia, se puede asumir que las características socioeconómicas y laborales de los marineros de bajura sean parecidas en las distintas
zonas. En primer lugar se definirá una población de 5.000 marineros de bajura entre
18 y 65 años. Mediante un cuestionario 'screening' se obtendrá información sobre
datos personales, participación en las diferentes tareas de recogida y limpieza del
fuel y otras variables determinando criterios de inclusión y exclusión en la segunda
etapa.
Se contactará con >1000 marineros seleccionados a través de la primera etapa, con
el fin de establecer una población de 500 con exposición y 500 sin exposición al fuel.
Para aumentar el contraste entre los grupos, los 500 expuestos habrán realizado por
lo menos tres semanas de trabajos de recogida del fuel. Tanto la distribución de las
tareas reportadas en el cuestionario de la primera etapa, como los hallazgos del
17
estudio de higiene ocupacional podrá modificar la definición mencionada. Los 500
sujetos sin exposición no habrán tenido ningún tipo de contacto con el fuel.
Es posible que los más expuestos participen más y que los que tienen síntomas
sobrevaloren la exposición. También es posible cierto sesgo tipo “efecto del
trabajador sano”. Se realizarán esfuerzos para controlar los sesgos de selección y
de respuestas relacionadas, incluyendo la recogida de información de no respuestas
y el grado de preocupación por los potenciales efectos nocivos de la exposición al
fuel.
VARIABLES
1. Cuestionario screening de la PRIMERA ETAPA
1.1 Determinación de la exposición a petróleo: la encuesta contendrá preguntas
sobre contacto con el fuel a partir del 14 de noviembre de 2002; tipo de tarea
incluyendo la recogida de fuel en las rocas, las playas, el fondo, en las rías, limpieza
de contenedores, aves, ropa, botas, transporte, número de días y horas al día de
cada tarea. Se incluirán también las tareas de recogida de fuel previstas en las
próximas semanas, con el fin de definir un grupo de expuestos durante la realización
de la segunda etapa.
1.2 Síntomas respiratorios: la encuesta contendrá preguntas sobre síntomas agudos
y crónicos de las vías aéreas superiores e inferiores, procedentes de cuestionarios
estandarizados y validados [Eur Respir J 2001;18:598-611]. Se incluirán preguntas
sobre trastornos crónicos. Con el objetivo de definir criterios de inclusión y de
exclusión para la segunda etapa, se harán también algunas preguntas generales
como hábitos tóxicos y otros empleos.
Se obtendrán datos de los sujetos seleccionados que no acepten participar.
18
SEGUNDA ETAPA
2. Espirometría basal
Se realizará espirometría forzada con intrumental común en todos los centros (Sibel
600) y según los criterios de la ATS-Update 94 [Am Rev Respir Dis 1995; 162:110736].
3. Prueba de la metacolina
Se practicará a todos los individuos que realicen correctamente las maniobras
espirométricas, que hayan firmado su consentimiento para la prueba de la
metacolina, y que no estén en las categorías de exclusión (ataque cardiaco en los
últimos 3 meses, padezca una enfermedad cardiaca o epilepsia y tome medicación
para ello, esté embarazada, período de lactancia, tome un beta-bloqueante oral o
tópico). Además se excluirán los individuos con FEV1 menor del 70 % del predicho,
o FEV1 menor de 1.5 litros utilizando los valores de referencia [Roca J, et al, Eur
Resp J 1998;11:1354-62]. Los nebulizadores (Mefar) y la presión del dosímetro será
calibrada centralmente. La metacolina será suministrada del mismo lote desde un
solo centro (Juan Canalejo). La preparación de las soluciones de metacolina se
realizará de forma local siguiendo el protocolo ECRHS hasta una dosis acumulada
de 2 mg.
4. Prueba broncodilatadora
Se realizará en individuos que hayan realizado correctamente las maniobras
espirométricas, y se nieguen a realizar o hayan sido excluidos de la prueba de
metacolina, y hayan firmado su consentimiento para la prueba broncodilatadora.
5. Control de calidad de las mediciones de la función pulmonar
El desarrollo de diversos pilotos de telemedicina en el Hospital Clínic de Barcelona,
en el marco de los programas de “Health Telematics”, DG XIII, de la Unión Europea
19
(Mobcare, Chronic C- Arctic) facilita una experiencia única para establecer un
programa de control de calidad sobre los resultados de la Función Pulmonar
obtenidos.
6. Medición de marcadores biológicos exhalados de la inflamación
La recolección del condensado del exhalado respiratorio se realizará utilizando un
equipo EcoScreen® (Jäeger, Alemania), empleando la metodología habitual. La
recolección se realizará tras un período de reposo de 15 minutos, en posición
sentada y utilizando pinzas nasales. Con este método se obtienen 2-3 ml del
condensado del exhalado respiratorio. El condensado de cada sujeto se almacenará
en tubos de polipropileno (2-4 alícuotas, ~1 ml) a 70ºC para su ulterior análisis
antes de 12 semanas. Las muestras, congeladas, se transportarán al Hospital Clínic
de Barcelona por mensajería privada. En dichas muestras se analizará: (1) Estrés
oxidativo:
peróxido
de
hitrógeno
(método
colorimétrico),
nitritos/nitratos
(quimioluminiscencia), 8-isoprostano (EIA); (2) Citocinas: IL-4, IL-8 (ELISA); y (3)
marcadores de dilución, Na, K (espectrofotometria de llama) y de contaminación
salival (amilasa, método enzimático).
7. Determinaciones inmunológicas
El trabajo de marinero implica una amplia variedad de exposiciones algunas de los
cuales contienen alergenos capaces de producir sensibilización de tipo IgE. Por ello,
se
realizarán
(a) pruebas cutáneas a alergenos ambientales
Dermatophagoides
pteronyssinus,
gato,
Alternaria
alternata,
(incluyendo
Cladosporium
herbarum, hierba timotea, abedul y Parietaria judaica) y laborales (alergenos de
varios mariscos como almeja, camarón, cangrejo), incluyendo un control positivo
(histamina) y negativo; y (b) se determinará IgE total y específica contra alérgenos
comunes (Dermatophagoides pteronyssinus, gato). Esto ayudará a definir el estatus
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atópico para identificar grupos susceptibles con relación a efectos irritativos
respiratorios.
8. Sintomatología
Se incluirán en la entrevista preguntas estandarizadas y validadas para caracterizar
el estado de salud respiratoria de los sujetos (patología y tratamientos) y síntomas
potencialmente relacionados con la exposición estudiada.
9. Determinación de la exposición a fuel del ‘Prestige’
Teniendo en cuenta los resultados del estudio ya en marcha sobre exposiciones en
personas que están limpiando el fuel, promovido por el Ministerio de Sanidad y
Consumo, y la evaluación realizada por el higienista industrial, se desarrollará una
lista de preguntas sobre tareas con el fin de estimar de manera retrospectiva la
exposición inhalatoria a fuel. Estas preguntas incluirán detalles del tipo y de la
duración de las tareas, productos de limpieza utilizados, el uso de agua a presión y
aplicación de medidas de control.
10. Otras exposiciones laborales y ambientales
En la entrevista se obtendrán
datos sobre factores de riesgo de trastornos
respiratorios, en particular exposición a irritantes u otras sustancias capaces de
provocar inflamación respiratoria y antecedentes familiares y personales de
patologías respiratorias. Se detallará la historia laboral mediante preguntas
estandarizadas, y las características laborales. El cuestionario incluirá además
numerosas preguntas relativas a otras exposiciones individuales (como tabaco) o
ambientales (tales como animales domésticos o
contaminación atmosférica) las
cuales pueden actuar como factores de confusión o como modificadores del riesgo
estudiado.
21
11. Células de la sangre, fragmentación del ADN, separación de linfocitos. Fragilidad
cromosómica
Se extraerán 20 ml de sangre periférica que serán vehiculizadas a través del
Hospital Juan Canalejo de A Coruña.
En todos los casos, el procesado de la
muestra se realizará en el laboratorio de la Unidad de Biología de la Facultad de
Medicina de la Universidad Autónoma de Barcelona. En este mismo centro se
realizarán los cultivos, el análisis de fragilidad cromosómica y la identificación de
alteraciones cromosómicas. Estos trabajos serán realizados básicamente por
personal con cargo al proyecto (un técnico y un becario con dedicación exclusiva), y
por una persona (dedicación parcial) responsable de la coordinación, interpretación y
discusión de los resultados obtenidos. Las muestras que se reserven para el estudio
de aductos de ADN se almacenarán en el Hospital Juan Canalejo.
Muestras: Sangre periférica (2-4ml) recogida en heparina sódica al 0.1% en
condiciones estériles. El envío de las mismas se realizará lo antes posible, debiendo
ser iniciado su procesado antes de las 48 horas post-extracción.
Cultivo de linfocitos y obtención de preparaciones: se procederá a partir de 0.5-1ml
de sangre periférica recogida en heparina sódica, al cultivo de linfocitos durante 72
horas en medio RPMI-1640 complementado con un 20% de suero fetal y un 5%
(0.06 microg/ml) de fitohemaglutinina, añadiendo colcemid (0.06 microg/ml) los 20
minutos finales de cultivo.
Cultivo para la inducción de fragilidad cromosómica: La fragilidad cromosómica se
estudiará añadiendo afidicolina (0.2 molar) durante las últimas 24 horas de cultivo,
previa renovación del medio de cultivo. Se procesará el resto como en el caso de un
estudio citogenético convencional.
22
Análisis de la fragilidad cromosómica: Se realizará a partir de las preparaciones
cromosómicas teñidas uniformemente con Leishman procedentes de ambos tipos de
cultivos . Se procederá al recuento del número de 'gaps' y roturas observados en un
mínimo de 100 metafases de buena calidad (cromosomas bien extendidos, con las
mínimas superposiciones y con buena morfología).
Identificación de alteraciones cromosómicas a partir de preparaciones de metafases
mediante las técnicas de bandas G y FISH. Las técnicas FISH se desarrollaran
utilizando sondas comerciales diferentes, principalmente pintado cromosómico (MFISH) y sondas teloméricas (subtel-M-FISH), de acuerdo con los protocolos
indicados por las casas comerciales. Una vez las preparaciones han sido sometidas
a la técnica de bandas G o de FISH se procederá a la captura de imágenes para su
posterior análisis. Disponemos de microscopios equipados con software específico
(Cytovision-Ultra / Vysis) para el cariotipazo de las imágenes obtenidas mediante
bandas G. También disponemos de microscopios de epifluorescencia con un equipo
de “M-FISH” (Vysis) que permitirá la captura de imágenes fluorescentes para todos
los cromosomas al mismo tiempo.
RECOGIDA Y ANALISIS DE LOS DATOS
1. Aproximación de la población y realización de las encuestas y las pruebas
médicas
Se contactará con las 63 cofradías gallegas para recoger datos de los marineros
asociados y definir la población diana. Para ello se enviará un cuestionario por
correo, con posterior seguimiento telefónico.
En la segunda etapa, se contactará con los sujetos que cumplan los criterios
definidos en la primera etapa. Se facilitarán equipos móviles para la realización de
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las entrevistas y de las pruebas médicas en casas del mar. Para garantizar la
calidad y la consistencia de la información recogida, se evaluará la consistencia
entre los entrevistadores y las pruebas médicas realizadas por diferentes enfermeras
con diferentes equipos.
Un analista de datos realizará la entrada, la depuración y la edición de la base de
datos utilizando programas estadísticos apropiados.
2. Análisis de los datos
Sobre los datos obtenidos en la PRIMERA ETAPA se realizará un primer nivel de
análisis basado en las comparaciones entre personas que han realizado limpieza y
recogida del fuel y personas sin dicha exposición, y se estimará el exceso de riesgo
de síntomas respiratorios asociado a los trabajos de limpieza y recogida. El análisis
incluirá la estimación del riesgo crudo y del riesgo ajustado mediante el cálculo de
las razones de tasas de prevalencia (prevalence rate ratios). Las variables
consideradas como confusoras y modificadoras del efecto potencialmente relevantes
se determinarán a partir del análisis univariado y de la literatura científica existente.
Para el análisis multivariante se utilizarán modelos log-lineares [Skov et al, Int J
Epidemiol 1998;27:91-5]. Se identificará la población que cumpla los criterios para
ser incluida en la segunda etapa.
Sobre los datos obtenidos en la SEGUNDA ETAPA se realizarán análisis de las
variables de alteración tanto aplicando definiciones clinicamente relevantes
(hiperreactividad bronquial, cierto nivel de inflamación), como indicadores continuos
(‘pendiente’ resultado de la broncoprovocación [Chinn S, et al, Eur Respir J
1997;10:2495-501]; concentración de células inflamatorias). Se estimarán las
asociaciones entre las distintas tareas de limpieza y recogida del fuel, y las variables
relacionadas con los indicadores la salud respiratoria mencionada.
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PODER ESTADISTICO
Asumiendo una tasa de respuesta de 80% (incluyendo seguimiento telefónico) se
prevé tener en la PRIMERA ETAPA datos sobre unos 4.000 marineros. Si se supone
entre ellos aproximadamente 2000 expuestos y 2000 no expuestos, se podrá
demostrar con un poder del 80% y un nivel de significancia del 95%, un riesgo
relativo entre 1.2 y 1.4, dada una prevalencia del síntoma entre el 5% y el 20%.
En análisis de la SEGUNDA ETAPA (500 expuestos y 500 no expuestos), se puede
demostrar con un poder del 80% y un nivel de significancia del 95%, un riesgo
relativo entre 1.4 y 2.0, dada una prevalencia de la alteración entre el 5% y el 20%.
ASPECTOS ETICOS
Dado que el presente estudio incluye personas, así como la obtención de muestras
biológicas y de administración de metacolina, todas los sujetos participantes deberán
firmar una hoja de consentimiento informado después de conocer de manera
adecuada los fines, las características y los riesgos que supone su participación. Se
firmará una hoja independiente para la extracción y análisis de material genético. Se
seguirán las normas descritas en la Ley Orgánica de Protección de Datos de
Carácter Permanente (Ley 15/1999 de 13 de Diciembre de 1999). Esto garantiza la
confidencialidad de los datos, el tratamiento de los datos de manera estrictamente
anónima, y la disponibilidad de los propios datos sobre la salud para los sujetos
participantes.El proyecto ha sido valorado positivamente por el Comité Ético de
Investigación Clínica de Galicia.
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EXPERIENCIA DEL EQUIPO INVESTIGADOR
En los últimos años el grupo de Neumología del Hospital Juan Canalejo de A Coruña
ha participado activamente en proyectos de investigación sobre salud respiratoria y
desarrollado líneas de trabajo con especial énfasis en la epidemiología y manejo
clínico de neoplasias respiratorias y enfermedades obstructivas de la vía aérea, con
interés especial en polución ambiental( en colaboración con el IMIM). También forma
parte de la red del FIS "Nuevos modelos de prestación de servicios sanitarios
utilizando telemedicina”.
Desde 1984 la Unidad de Investigación Respiratoria y Ambiental (URRA) del Instituto
Municipal de Investigación Médica (IMIM) viene realizando estudios epidemiológicos
sobre enfermedades respiratorias y especialmente sobre su prevalencia y etiología
ambiental. En los últimos 10 años el grupo ha trabajado intensamente en el Estudio
Europeo de Salud Respiratoria (ECRHS) siendo el responsable de la coordinación
de 5 grupos en España. Dentro de esta línea de trabajo y en relación al presente
proyecto, cabe destacar los avances realizados en la estimación del riesgo atribuible
de asma a la exposición laboral en la población general (Kogevinas M et al, Lancet
1999; 353: 1750-1754).
El grupo de Neumología del Hospital Clínic de Barcelona (HCB) viene colaborando
desde 1984 con estudios epidemiológicos, entre los que cabe destacar la
caracterización del asma por soja y el Estudio Europeo de Salud Respiratoria. Estos
estudios se han extendido al análisis sobre estandarización de la función pulmonar y
el estudio longitudinal de la función pulmonar en individuos de referencia. Se han
desarrollado actividades conjuntas con el IMIM en la valoración de la calidad de vida
en la EPOC y en la evaluación de servicios sanitarios. El grupo del Servicio de
Neumología del HCB tiene un fuerte programa de investigación dentro del área de la
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Fisiopatología Pulmonar Aplicada y la Neumología Clínica. Como resultado de esta
actividad se han efectuado de forma continuada contribuciones a la literatura con un
significativo impacto a nivel internacional. El HCB dispone de la instrumentación
necesaria para el análisis de las muestras del condensado del exhalado pulmonar:
peróxido de nitrógeno, nitritos/nitratos, 8-isoprostano y citocinas. Miembros de
nuestro laboratorio han sido entrenados en esta metodología en el ELEGI Colt
Laboratory, Edimburgh University (Prof. W. McNee).
El departamento de Biología Celular, Universidad Autónoma de Barcelona tiene una
experiencia de casi treinta años en el campo de la Citogenética. Este grupo ha sido
reconocido como “grupo consolidado” en los diferentes programas de Ayudas a
Grupos de Investigación Consolidados convocadas por la CIRIT (Generalitat de
Catalunya). Los estudios de Fragilidad Cromosómica se iniciaron en 1982 (tesis
dosctoral Carme Fuster). Desde el año 1990 se están aplicándo las técnicas de
FISH en las distintas líneas de investigación y la de M-FISH multicolo (24
colores)desde el 2000.
La Dra. Isabel Isidro trabaja desde 1980 en el Servicio de Neumología Ocupacional
del Instituto Nacional de Silicosis y ha realizado desde esa fecha muchos estudios
epidemiológicos en Asturias, León, Palencia y Ávila, centrados fundamentalmente en
la minería del carbón, explotaciones a cielo abierto, canteras de granito, asma
ocupacional, asbesto, fábrica de armas, fundición, trabajadores de astilleros,
etc.Tiene experiencia en enfermedades ocupacionales respiratorias y en realización
de estudios epidemiológicos en diversos colectivos de trabajadores.
La Sociedad Española de Neumología y Cirugía Torácica (SEPAR) es una sociedad
científica fundada en 1967 que engloba a la práctica totalidad de los neumólogos y
cirujanos torácicos del país (cerca de 2.500 socios). SEPAR destina anualmente a
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través de su fundación (Fundación Respira) el 50% de su presupuesto (300.000 €) a
la financiación de proyectos de investigación (uni y multicéntricos). Con objeto de dar
un nuevo impulso estratégico a la investigación respiratoria, en Diciembre de 2001
SEPAR ha aprobado el Centro Respira de Investigación (CRI), formado por una red
de centros interesados en la investigación respiratoria con los siguientes objetivos:
(1) estimular y facilitar la coordinación entre los principales grupos de investigación
existentes en el seno de la sociedad para que desarrollen más y mejor investigación,
especialmente de tipo multicéntrica y multidisciplinaria; (2) favorecer la participación
de centros con menor tradición investigadora para potenciar y facilitar su desarrollo;
y (3) creación de un programa de formación en investigación. El proyecto CRI ha
permitido la participación con éxito en la reciente convocatoria del Insituto de Salud
Carlos III sobre redes temáticas de investigación cooperativa (RTIC), fruto de lo cual
ha sido la evaluación, aprobación y financiación de la denominada Red Respira
(RTIC C03/11).
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