Determinación del nivel de ploidia en zacate búfalo

Determinación del nivel de ploidia en zacate búfalo (buchloe dactyloides)
Ploidy level determination in buffalograss (buchloe dactyloides)
Juan Manuel Martínez Reyna1 y Edgar Gerardo De Anda Villarreal 2
Resumen
El mejoramiento genético del zacate búfalo [Buchloe dactyloides(Nutt.)
Engelm.] ha despertado gran interés por ser un zacate con potencial como
césped para zonas áridas y semiáridas. El mejoramiento de especies poliploides
es más complicado, tal es el caso del zacate búfalo, ya que es necesario clasificar
los materiales genéticos de acuerdo con su nivel de ploidia y de esta manera
tener control en los programas de los la hibridación. En este trabajo se tuvo como
objetivo corroborar, mediante técnicas citológicas, el nivel de ploidía determinado
con anterioridad por citometría de flujo en seis materiales de zacate búfalo. B62
fue un diploide (2n=2x=20), este material fue colectado en Real de Catorce, SLP y
corresponde a una área distribución de diploides diferente a las ya reportadas.
B42y B12P fueron tetraploides (2n= 4x=40). B14P y B88 fueron considerados
hexaploides (2n= 6x= 60) y B12PxB14P fue un pentaploide (5x= 50).En los
materiales pentaploides y hexaploides, debido al tamaño tan pequeño y a la gran
cantidad de cromosomas que presentan se hizo un conteo estimado del número
de cromosomas. En todos los casos las técnicas citológicas identificaron los
mismos niveles de ploidia obtenidos por citometría de flujo, esto permite afirmar
que existe una alta relación entre la cantidad de ADN determinada por el citómetro
de flujo y el número cromosómico de zacate búfalo.
Palabras clave: Buchloe dactyloides (Nutt.) Engelm., zacate buffalo, preparación
cromosómica, nivel de ploidía.
Abstract
Breeding Buffalograss [Buchloe dactyloides (Nutt.) Engelm.] has become
very important for being a turfgrass with potential for being used in arid and
semiarid zones. Breeding in polyploidy species is more complicated, as is the case
of Buffalogass, since it is necessary classify the genetic materials according with
the ploidy level and in this way have a control in hybridization programs. This
study had as objective to probe, by cytological techniques, the ploidy level obtained
by flow citometry of six materials of buffalograss. B62 was a diploid. This material
was collected in Real de Catorce, SLP that is a new report of diploid distribution
area. B42 and B12P were tetraploids. B14P y B88 were considered hexaploid and
B12P x B14P was a pentaploid. In the case of pentaploid and hexaploids, due to
the small size and the large number of chromosomes some counts were estimate.
For all the cases the cytological techniques identified the same ploidy levels
obtained by flow citometry, this indicates that there is a relationship between the
DNA content, determined by the flow cytometer, and the chromosome number in
Buffalograss.
_____________________
1
Departamento de Fitomejoramiento. Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro. Buenavista, Saltillo, Coah. C.P. 25315.
Tel. 01(844) 411-0296 Fax. 01(844) 411-0236 Correo electrónico: [email protected] 2 Tesis Ingeniero Agrónomo en
Producción. UAAAN.
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Key words: Buchloe dactyloides (Nutt.) Engelm., bufallograss, chromosomic
slide, ploidy level.
Introducción
Cuando se hace mejoramiento genético en una especie es necesario conocer
e identificar las características que muestran cada colecta o material, incluyendo
el número cromosómico. En un programa de mejoramiento existen muchas
barreras que resultan ser limitantes para lograr los objetivos y una de ellas es el
nivele de ploidía que una especie puede tener. (Poehlman y Allen, 2003)
mencionan que al cruzar progenitores con diferentes niveles de ploidía puede dar
como resultado progenies estériles o genéticamente inestables. Con la
determinación del número cromosómico de los materiales disponibles se tendrá
una adecuada planeación en los programas de hibridación, asegurando la
compatibilidad genética entre los progenitores, lo que permitirá la incorporación y
selección de determinada característica favorable.
El zacate búfalo es la única especie nativa que se usa ampliamente como
césped en la región de las Grandes Planicies de Estados Unidos de América y a
nivel mundial va cobrando un interés especial (Wu, 2000). En México se ha
empezado un programa de mejoramiento genético de esta especie con el fin de
obtener las primeras variedades de césped para zonas áridas y semiáridas
(Martínez, 2002).El zacate búfalo (Buchloe dactyloides) es una planta dioica de
clima templado y originario de las Grandes Planicies de Norteamérica, su
rusticidad y adaptabilidad le permite estar dispersa de Norte a Sur desde Canadá
hasta México. (Riordan y Johnson, 1997). En el zacate búfalo los materiales
diploides constan de 20 cromosomas, adicionalmente existen otros tres niveles de
ploidía, tetraploide, pentaploide y hexaploide, siendo los más comunes los
tetraploides y hexaploides. Mencionan que los tetraploides prevalecen en la
región oeste de Texas, este de Nuevo México y sureste de Colorado, sin embargo
concluyen que la distribución geográfica de acuerdo a los niveles de ploidía no
está bien definida (Johnson, et al., 1998). El primer pentaploide reportado fue
derivado de una cruza entre un progenitor hexaploide y uno tetrapolide (Johnson,
et al., 1998). Posteriormente Johnson et al. (2001) identificaron, a través de
citometría de flujo, cuatro materiales pentaploides naturales. Los materiales
hexaploides son los que dominan en gran parte del área norte de las grandes
planicies y posiblemente se debe a un incremento en la tolerancia a bajas
temperaturas (Johnson et al., 1998). Existen también materiales triploides que han
sido creados mediante cruzas controladas en la Universidad de Texas Tech, pero
no hay ningún reporte donde mencionen que se encuentren en forma natural
(Johnson et al., 2001).
Para la determinación del número cromosómico existen varias técnicas
citológicas. En metafase de mitosis se utilizan ápices de raíz y en diacinesis de
meiosis, anteras inmaduras y por medio del microscopio compuesto se pueden
observar los cromosomas de manera individual e independiente para hacer el
conteo (Singh, 2003).
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El objetivo del presente estudio fue corroborar, mediante técnicas citológicas,
el nivel de ploidía determinado con anterioridad por citometría de flujo en seis
materiales de zacate búfalo.
Materiales y métodos
El estudio se realizó en el Laboratorio de Citogenética de la UAAAN. Se
estudiaron células en división meiótica y mitótica, las cuales se obtuvieron de
anteras inmaduras y ápices de raíz respectivamente. Se utilizaron seis materiales
de zacate búfalo cuyo nivel de ploidía había sido determinado mediante citometría
de flujo (Cuadro 1).
Cuadro 1. Nivel de ploidía y sitios de colecta de materiales de zacate búfalo. Saltillo, Coah.
2003.
Material
B12 P
B14 P
B42
B62
B88
B12P x B14P
Sitio de Colecta
Nivel de ploidia
(citometría de flujo)
Selección de B12 General Cepeda- Parras Coah. Tetraploide
km 55
Selección de B14. General Cepeda-Parras Coah. Hexapliode
km 80
Sierra Hermosa, Arteaga, Coah.
Tetraploide
Real de Catorce, SLP
Diploide
Rancho Santa Anita, N L
Hexaploide
Cruzamiento
Pentaploide
Preparaciones Meióticas
Los microsporocitos en desarrollo son células en las que se puede estudiar la
división meiótica, en ocasiones es difícil seleccionar flores en estado apropiado de
desarrollo donde se pueda hacer esto. En el caso del zacate búfalo que es una
planta dioica presenta una inflorescencia masculina con maduración escalonada
de la parte superior a la inferior lo que facilitó el proceso de selección de las
espiguillas a analizar. Después de que se colectaron las inflorescencias se
colocaron en fijador Farmer con la finalidad de fijar las diversas fases de la división
celular. En esta solución permanecieron hasta su estudio. De las inflorescencias
en el fijador se tomó una ramificación espigada y se procedió a disectar una
espiguilla para extraerle las anteras que fueron colocadas en un portaobjetos al
cual se le agregó una gota de colorante carmín propiónico. Con una aguja de
disección curva se cortaron a la mitad y se aplastaron para liberar las masas de
microsporocitos. Ahí se dejaron de 1 a 2 minutos para que se colorearan. Se
colocó un cubreobjetos sobre los microsporocitos disueltos en la gota de
colorante, se calentó la preparación en un mechero de alcohol y se presionó
suavemente, sin movimientos laterales sobre un papel filtro. Se observó la
preparación al microscopio. Si el aplastado no fue suficiente y los microsporocitos
estaban sobrecoloreados, se agregó una gota de ácido propiónico por los bordes
del cubreobjetos y se volvió a presionar. Si al observar nuevamente al
microscopio se obtuvo un buen contraste de color entre los cromosomas y el
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citoplasma, se procedió a presionar un poco para quitar el exceso de ácido y a
continuación se selló la preparación.
Preparaciones Mitóticas
Para poder observar los cromosomas en el proceso de Mitosis se requieren
células que se encuentren en división activa. Los meristemos de ápices de raíz
resultan adecuados para este fin. Para esto se colectaron estolones de los
materiales y se llevaron al laboratorio donde se pusieron en vermiculita para que
cada uno de los nudos se enraizara.
Procedimiento
Pretratamiento de meristemos. El pretratamiento consistió en someter los
ápices de raíz a la acción de agentes químicos. Después de haber sido cortados
los meristemos fueron colocados en 8-Hidroxiquinoleína al 0.04%, por 3 horas en
total oscuridad.
Fijación. Posteriormente se pasaron al fijador Farmer con el propósito de
preservar la organización del tejido, permaneciendo en esta solución hasta el
momento de la hidrólisis.
Hidrólisis. Los ápices de raíz previamente tratados con el fijador se pasaron
por tres enjuagues con agua destilada cada 30 minutos en agua destilada, al
término de este tiempo se enjuagaron nuevamente y se pasaron a ácido
clorhídrico al 0.1N por 10 minutos, luego se enjuagaron dos veces con agua
destilada nuevamente durante 30 minutos en agua destilada. Posteriormente se
pasaron a un buffer de Citratos durante 30 minutos, y se procedió a cortar los
meristemos para pasarlos por el tratamiento enzimático con pectiolasa y celulasa
en baño maría a 37ºC durante 1 hora, después se eliminan la enzima mediante 2
enjuagues con agua destilada y se dejaron en agua.
Estudio microscópico. Los meristemos ya tratados se extrajeron con una pipeta
y se colocaron sobre un portaobjetos con una gota de fijador Farmer. Con una
aguja curva de disección se presionaron suavemente para extender las células
meristemáticas sobre el portaobjetos, el cual se enjuagó con unas gotas de fijador
Farmer para eliminar residuos de tejido, quedando así lista la preparación para su
observación en el microscopio.
Resultados y discusión
De los materiales que se lograron obtener inflorescencias masculinas y
meristemos radiculares se elaboraron preparaciones meióticas y mitóticas
respectivamente. La hora óptima de colecta de anteras fue de 8:00 a 9:00 AM y el
corte de ápices de raíz se realizó de 11:00 AM a 12:30 PM a ya que fue cuando
se encontró el mayor número de células en división. En algunas de las
preparaciones se lograron apreciar cromosomas bien dispersos lo que permitió
contarlos. Sin embargo, debido al tamaño tan pequeño y a la gran cantidad de
cromosomas que presentan los materiales tetraploides, pentaploides
y
hexaploides, (40, 50 y 60 cromosomas respectivamente) en la mayoría de los
materiales se hizo un conteo estimado del número de cromosomas.
En la Figura 1A se muestran los 20 cromosomas de B62 en mitosis. Esto
corresponden a un diploide (2n= 2x=20). Los materiales diploides en esta especie
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sólo se han reportado en las cercanías de la ciudad de San Luis Potosí y en la
región sureste de Texas (Huff et al., 1993). B62 fue colectado en Real de Catorce,
SLP, localizado aproximadamente a 200 km al norte de la ciudad de San Luis
Potosí por lo que se trata de otra área de distribución de diploides.
1A
1B
1C
Figura 1. Preparación mitótica de B62 que corresponde a un diploide (2n= 2x=20) (A).
Preparación mitótica de B42 (B). Preparación meiótica de B12P (C). En estos
últimos el número cromosómico corresponde a un nivel tetraploide (2n= 4x= 40).
Aumento 1000x.
La Figura 1B muestra una microfotografía del material tetraploide B42 en
metafase de Mitosis donde fácilmente se pueden contar 40 cromosomas. En la
Figura 1C se presenta al material B12P en diacinesis y se pueden observar 19
cromosomas bivalentes y 2 univalentes, que corresponden a un tetraploide con 40
cromosomas.
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Los materiales B88 y B14P fueron analizados en meiosis y mitosis
respectivamente y en el material B88 aproximadamente se pudieron contar 59
cromosomas (Figura 2A) y en la Figura 2B se presenta a B14P en diacinesis y
se pueden contar 29 cromosomas bivalentes y dos univalentes. Ambos materiales
fueron considerados hexaploides (2n= 6X= 60).
2A
2B
2C
Figura 2. Preparación mitótica de B88 (A). Preparación meiótica de B14P (B). Ambos son
materiales hexaploide (2n= 6x= 60). Preparación meiótica de B12P x B14P que
corresponde a un pentaploide (5x= 50) (C). Aumento 1000x.
El material B12P x B14P fue analizado en meiosis en la fase de diacinesis. En
la microfotografía del material B12P x B14P (Figura 2C) pueden observarse 20
cromosomas bivalentes y 9 univalentes, por lo que puede decir que es un
pentaploide. Esto se justifica debido a que es resultado de un cruzamiento entre
el material B12 P que es tetraploide y B14P que es hexaploide.
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Estos resultados corroboran los niveles de ploidía obtenidos en el estudio de
citometría de flujo en todos los materiales y se puede afirmar que existe una alta
relación entre la cantidad de ADN determinada por el citómetro de flujo y el
número cromosómico de zacate búfalo. Esto es importante ya que a medida que
se incrementa el número de materiales en la colección será difícil hacer la
determinación de nivel de ploidía mediante técnicas citológicas debido al tiempo
que requiere para tener resultados satisfactorios.
Literatura citada
Huff D R, R Peakall, P E Smouse (1993) RAPD variation within and among natural populations of
outcrossing buffalograss [Buchloe dactyloides (Nutt.) Engelm.]. Theor. Appl. Genet.
86:927-934.
Johnson P G, T P Riordan, K Arumuganathan (1998) Ploidy level determination in buffalograss
clones and populations. Crop Sci. 38:478-482.
Johnson P G, K E Kenworthy, D L Auld, T P Riordan (2001) Distribution of buffalograss polyploidy
variation in southern great plains. Crop Sci. 41:909-913.
Martínez R J M (2002) Colección de germoplasma de zacate búfalo (Buchloe dactyloides) In:
Memorias del XIX Congreso Nacional de Fitogenética. Septiembre 1-5, Saltillo,
Coah.385 p.
Poehlman J M, D Allen (2003) Mejoramiento Genético de las Cosechas. 2ª edición. Limusa.
México DF.
Riordan T P, Johnson P G (1997) Grass germplasm in the USA: a status report. pp: 50-51
Singh R J (2003) Plant Cytognentics. Second edition. CRC Press. USA. 443 p.
Wu L (2000) Buffalograsss: This ancient American forage grass may have a future as turf. Diversity
16 (1, 2): 42-43.
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