1 MÉTODOS Y TÉCNICAS AVANZADOS EN BIOLOGÍA MÓDULO : LABORATORIO AVANZADO DE FISIOLOGÍA VEGETAL UNIDAD PRÁCTICA I : PRODUCCIÓN PRIMARIA EN ECOSISTEMAS ACUÁTICOS Profesores: Elvira Perona (despacho B-002) Antonio Quesada (despacho B-010a) Introducción La medida de la PRODUCCIÓN PRIMARIA de un sistema se realiza habitualmente porque es un muy buen indicador de las potencialidades tróficas del ecosistema, esto es, la capacidad de producir biomasa en un ecosistema o dicho de otra manera la capacidad de incorporar materia orgánica (fundamentalmente carbono) al ecosistema. Esta actividad es realizada fundamentalmente por los organismos fotosintéticos o productores primarios, que en el caso de ecosistemas acuáticos son las algas y consiste en la conversión de la energía luminosa en energía química que es almacenada en forma de compuestos orgánicos, mayoritariamente compuestos de carbono. En esta práctica realizaremos la determinación de la producción primaria de un ecosistema acuático, en este caso de embalses, producida por el fitoplancton. El objetivo fundamental de esta determinación es medir el valor de la síntesis de C orgánico en el ecosistema, ya que constituye la entrada más importante de materia y energía útil para el conjunto del ecosistema. La forma más sencilla de medir la producción primaria en un momento determinado es medir la fotosíntesis, ya sea medida como desprendimiento de oxígeno o como incorporación de carbono en unas condiciones determinadas. Sin embargo, esta medida aislada sólo es un análisis puntual y por tanto no nos permite inferir como varía la producción primaria a lo largo del día (dado que la luz disponible varía a lo largo de éste) ni a lo largo del año. Para poder conocer esta variación, necesitamos conocer previamente las características fotosintéticas de un organismo o de una comunidad. Para ello, analizamos la actividad fotosintética variando la intensidad luminosa que alcanza a las células, en lo que se denominan curvas de fotosíntesis frente a irradiancia (comúnmente denominadas curvas PvsI, de sus siglas en inglés) por lo que podremos calcular la producción primaria en función de la intensidad luminosa. Con este tipo de curvas podemos conocer las características fotosintéticas de la comunidad: por ejemplo, saber cuanta luz necesita la comunidad fitoplanctónica para que la fotosíntesis se sature o podemos saber cómo de eficaces son los fotosistemas en el proceso. Además, con este tipo de aproximaciones podemos inferir cómo es la producción primaria en la columna de agua (en la que la intensidad de luz disminuye con la profundidad), o incluso podríamos estimar la entrada de C a lo largo del año. Por todo esto las curvas PvI se muestran como una herramienta muy útil en ecología acuática. 2 Las características fundamentales que vamos a estudiar son: - Ps, que es el valor máximo de fotosíntesis, y - , que es la pendiente de la parte lineal de la curva de respuesta a la luz, lo que nos indica la afinidad de los fotosistemas de la comunidad por la luz. (Ver el ejemplo real de abajo). Hay otras variables que también podemos obtener de estas curvas y que tienen otras connotaciones, y que obviaremos en esta práctica. Curva PvI en un cultivo de Chlorella sp. 2,5 mg C asimilado (mg cl)-1 h-1 2,0 Ps 1,5 datos experimentales ajuste del modelo 1,0 = 0.065 mg C (mg cl)-1h-1 /µE cm-2 s-1 0,5 -1 -1 Ps= 1.868 mg C (mg cl) h 0,0 0 100 200 300 400 1600 -2 -1 Irradiancia (µE cm s ) Estos parámetros van a permitir comparar la potencialidad ecológica de las comunidades, así como su estado fisiológico, ya que los valores obtenidos van a depender, por un lado de los grupos algales dominantes (que dependerán normalmente del estado trófico de la masa de agua), y por otro lado de la situación fisiológica del grupo dominante de la comunidad algal. Objetivo El objetivo de esta práctica es comparar las características fotosintéticas y la producción primaria en dos ecosistemas acuáticos de distintas características, realizando curvas PvsI. Esta práctica se desarrollará en dos embalses con distinto estado trófico, el estado trófico en una masa de agua está relacionado con procesos de contaminación, así un embalse eutrófico tiene una gran cantidad de biomasa debida a la contaminación por fertilizantes, de origen agrícola, industrial o urbano; sin embargo un embalse oligotrófico tiene poca biomasa porque apenas presenta contaminación. Trabajaremos en un embalse oligotrófico o mesotrófico, dada la dificultad de encontrar uno con características oligotróficas en la CAM, y uno eutrófico. En cada uno de los embalses, tomaremos una muestra de agua de orilla y realizaremos un estudio de las características fotosintéticas de cada una de las comunidades del fitoplancton realizando una curva PvsI.. 3 Metodología En esta práctica vamos a utilizar como medida de la fotosíntesis la incorporación de C inorgánico. Para este tipo de medidas normalmente se utiliza un tipo de C marcado isotópicamente de manera que podamos saber cuanto de ese C marcado se ha incorporado en una unidad de tiempo. Anteriormente el isótopo más utilizado era el 14C, que es un isótopo radiactivo del C y que requería un cuidado y protección para la radiación especialmente delicadas. En la actualidad, se puede usar otro isótopo pesado del C, el 13C, que aún siendo un isótopo pesado no sufre descomposición radiactiva y por lo tanto no requiere ningún cuidado especial en su manejo, lo que le hace muy apropiado para esta práctica. El problema que presenta la utilización del 13C es que la medida de lo que se ha incorporado requiere una instrumentación muy sofisticada, un espectrómetro de masas, que precisa unos altos conocimientos técnicos. Nuestras muestras se enviarán al Servicio Interdepartamental de Investigación (SIDI) de la UAM, que las analizará. En la práctica utilizaremos Na H13CO3 como sustrato para la asimilación fotosintética, y lo añadiremos en nivel trazador, esto es, en concentraciones dentro del rango de las que existen de forma natural en el ambiente que se va a analizar, para evitar artefactos fisiológicos (cambios en las actividades biológicas debidos a las condiciones experimentales). El Na H13CO3 será incorporado por los organismos fotosintéticos y asimilado en sus propias moléculas, en forma de compuestos orgánicos. De esta manera, conociendo el C inorgánico marcado que se ha añadido y el C inorgánico presente en el medio, y sabiendo el C que se ha acumulado en las células en un tiempo determinado, podemos saber la actividad fotosintética de estos organismos. Posteriormente podremos calcular el C incorporado con las siguientes fórmulas: % 13C - % AN Vc (h ) = -----------------------------------------------------------------T ( (-------------- x 100 ) - % AN ) x tiempo (h) (T+DIC) -1 Rho C (µg C/l . h) = Vc x POC Vc= tasa de aumento de isótopo Rho C= tasa de incorporación de C por la comunidad AN= Abundancia natural de C T= [trazador ] (mg l-1) DIC= [Carbono Inorgánico Disuelto] (mg l-1) POC= Carbono orgánico particulado (µg l-1 ) Como queremos estudiar la variación de la actividad fotosintética en función de la intensidad de luz, utilizamos filtros neutros (reducen la intensidad de la luz sin alterar las características de ésta) para modificar la intensidad lumínica recibida. Dependiendo del número de capas de filtros neutros que usemos, tendremos una atenuación u otra de la intensidad luminosa, que las denominaremos como el % de transmisión, que es el % de la luz que incide y que atraviesa los filtros. 4 En esta práctica vamos a utilizar los siguientes números de capas de filtro neutros: 0, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10 y opaco (con papel aluminio), que nos dan los siguientes % de transmisión: 100 (toda la luz que incide sobre la muestra le llega a las células), 50.5, 22.5, 12.7, 6.1, 1.7, 0.2, 0.1 y 0 %. Nº Filtros % Trans. 0 1 2 3 4 6 8 10 opaco 100 50.5 22.5 12.7 6.1 1.7 0.2 0.1 0 Desarrollo de la práctica Para realizar esta práctica es necesario llevar a cabo: - la determinación de la asimilación fotosintética del DIC (Carbono Inorgánico Disuelto) - la estimación de la biomasa algal (como clorofila y el carbono particulado). - con los datos anteriores construiremos la curva Pvs I - mediremos las características químicas del agua - la composición fitoplanctónica de los ecosistemas analizados. 1) Curvas PvI. Las curvas PvI las realizaremos de la siguiente manera: en primer lugar tomaremos la muestra de agua del embalse e incubaremos in situ, con Na H13CO3 a diferentes intensidades luminosas durante 2 horas. Tras la incubación se parará la actividad fotosintética y se filtrarán las muestras para separar las células del Na H13CO3 no asimilado. Posteriormente eliminaremos los restos que puedan quedar de Na H13CO3 mediante acidificación y se enviarán las muestras al SIDI para su análisis. 2) Determinación de las características químicas del agua 3) Estimación de la Biomasa por medio de la clorofila. Mediremos la abundancia de organismos fitoplanctónicos por la extracción y la cuantificación de la clorofila. 4) Estimación de la Biomasa por medio del análisis del POC. Mediremos la abundancia de organismos planctónicos mediante el análisis del C particulado presente en las masas de agua 5) Determinación de la abundancia natural de 13C. Determinaremos la abundancia natural de este isótopo pesado enviando una muestra filtrada al SIDI. 6) Identificación de los organismos fitoplanctónicos por microscopía. 5 Procedimiento En el campo 1- Tomamos una muestra de agua 4-5 litros y la distribuimos en 9 botellas planas (250 ml por botella) por cada curva PvI 2- Conservamos el agua sobrante, en 2 botes de 1 litro, para realizar una serie de determinaciones químicas necesarias, y para determinar la concentración de clorofila y la de C orgánico particulado que existe en la masa de agua 3- una vez que tenemos las 9 botellas llenas, los filtros neutros y el papel de aluminio preparados añadimos el volumen que se indicará (1 ml) del trazador de Na H13CO3 4- cerramos las botellas las introducimos en las bolsas de los filtros neutros y las dejamos incubar en la orilla (dentro del agua) durante al menos 2 horas. 5- durante toda la incubación anotaremos cada 10 minutos la intensidad de luz incidente y la temperatura del agua en la zona de la incubación 6- Pasado el tiempo de incubación detendremos la actividad fotosintética introduciendo las botellas en bolsas negras, que no permiten el paso de la luz, y con hielo. 7- durante la incubación realizaremos la determinación de P soluble y las diferentes formas de N existentes en el agua, para comparar los nutrientes disponibles y el estado trófico de la masa de agua. 8- determinaremos, asimismo, la concentración de C inorgánico disuelto en el agua por una valoración sobre 500 ml de agua. Primera sesión de laboratorio a) Preparación de las muestras de fotosíntesis - por medio de filtración sobre filtros GFF, rápidamente y en semi-oscuridad, retiramos del agua de incubación las células. De esta manera, éstas quedarán retenidas en los filtros (1 por botella de incubación). Ponemos los filtros hacia arriba en un papel absorbente para secarlos - acidificamos los filtros con gas de HCl, para eliminar todo el Na H13CO3 que no haya sido incorporado pero que se haya adsorbido a las estructuras externas de las células. Para ello, simplemente disponemos los filtros en posiciones conocidas dentro de un recipiente en el que ponemos un vaso con HCl al 10%. b) Preparación de la muestra para la medida de clorofila a - para determinar la concentración de clorofila filtramos un volumen conocido (entre 100 y 250 ml) del agua del embalse en 1 filtro GFF (lo hacemos por duplicado) - extraeremos la clorofila de la comunidad algal, introduciendo estos filtros en 5 ml de acetona al 90%, tapando y agitando el tubo y dejándolo el fin de semana a –20ºC c) Preparación de la muestra para la medida de POC y AN - para determinar la concentración de carbono orgánico particulado (POC) y Abundancia Natural de 13C (AN) filtramos un volumen conocido de agua del embalse en 2 filtros GFF, uno para cada determinación. d) fijación de las muestras de fitoplancton para su posterior observación - 40 y 15 ml de la muestra se introducen en tubos en forma de cono (Falcon) que los fijaremos por dos procedimientos distintos: lugol y formol (aproximadamente 1 ml) e) dejaremos el resto del material recogido encima de las encimeras sin fijar para su posterior observación microscópica. 6 Segunda sesión de laboratorio a) Preparación de las muestras de fotosíntesis - una vez acidificadas las muestras durante el fin de semana se sacan del recipiente, se mantienen al aire 1 hora - guardamos los filtros en bolsitas de papel de aluminio previamente etiquetados y se envían al espectrómetro de masas. b) Determinación de clorofila a de la comunidad fitoplanctónica - se extrae el tubo de ensayo con el filtro y la acetona del congelador - se agita con agitatubos durante 1 minuto - se centrifuga para eliminar las partículas y se separa el sobrenadante - en espectrofotómetro se determina la absorbancia del sobrenadante a 665 y 750 nm frente a un blanco de acetona - los valores de absorbancia se incluyen en la siguiente fórmula para obtener los valores de concentración: [clorofila a en el extracto] (µg ml-1) = 13.14 (ABS665-ABS750) [Clorofila columna de agua] (µg l-1) (conc. extracto x vol. extracto x 1000) =---------------------------------------------------vol. filtrado (ml) c) determinación de AN y POC - ambos filtros se llevan al SIDI para su determinación por espectrometría de masas y por análisis elemental d) Observación de las muestras de fitoplancton fijadas - los tubos se desplazan con mucho cuidado intentado evitar su movimiento - El lugol habrá hecho que la mayor parte del fitoplancton pese más y se haya depositado en el fondo del tubo, así que se retira con pipeta pasteur de plástico la mayor parte del sobrenadante, dejando únicamente la parte cónica del tubo con líquido - se toma la muestra del fondo y se mira al microscopio, se dibujan e identifican los grupos principales de organismos que aparecen en el fitoplancton - Se procede de la misma manera con el tubo con formol. Tercera sesión en aula de informática (análisis de los resultados) - Una vez las muestras estén analizadas del SIDI nos enviarán las proporciones de 13C que tenían las muestras mandadas a analizar. El análisis de isótopos estables no nos da concentraciones, si no proporciones relativas de estos isótopos, por lo que necesitamos convertir estos valores en una tasa de incorporación, mediante la siguiente formulación: Vc (h-1) % 13C - % AN = ------------------------------------------------------------T ( --------------------- X100) - %AN x tiempo (h) (T+DIC) Rho C (µg C/l . h) = Vc x POC 7 Vc= tasa de aumento de isótopo Rho C= tasa de incorporación de C por la comunidad AN= Abundancia natural T= trazador (mg l-1) DIC= Carbono Inorgánico Disuelto (mg l-1) POC= Carbono orgánico particulado (µg l-1 ) Si dividimos el valor de Rho C por la concentración de clorofila podemos estimar la producción primaria por unidad de clorofila, que es una medida habitual para poder comparar la producción primaria de los organismos en diferentes sistemas relacionándolo con la cantidad de biomasa (expresada como concentración de clorofila) - También representaremos los valores de fotosíntesis para cada una de las intensidades luminosas utilizadas y obtendremos seguramente una hipérbola cuadrática que podemos modelizar, por medio de una hoja de Excel, a la siguiente función para obtener los parámetros fotosintéticos de cada una de las comunidades: Pr=Ps x (1 - exp(-*I/Ps)) Así obtendremos los valores de Ps y que son los parámetros que buscábamos y así podremos comparar las características fotosintéticas de ambos cuerpos de agua. 8 Instrucciones para el cálculo de los parámetros fotosintéticos 1.- calcular la cantidad de fotones recibidos durante el periodo de incubación (mol fotones m-2 en 2 horas) : - hacer la media de la irradiancia instantánea (µmol fotones m-2s-1 = µE m-2s-1) entre la medida inicial y final de cada periodo de medida - multiplicar por los segundos de dicho periodo de medida - sumar todos los fotones por metro cuadrado obtenidos durante todo el periodo de incubación - transformar los datos a moles fotones m-2 2.- Calcular los fotones recibidos por cada una de las botellas de incubación en función del % de transmisión (ver tabla en el guión) 3.- Transformar los valores de la tabla (que están en unidades de , y se refieren a la proporción de 13C sobre 12C que hay en la muestra) en valores de mg C asimilado por cada mg de clorofila y por cada hora de la siguiente manera: 3.1- convertir los valores de en % de 13C sobre 12C, usando: % 13C = 1.11122 +(0.0010985 * ) (obtenido de forma empírica) 3.2 - Calcular el Carbono inorgánico disuelto (DIC) de embalse en mg C l-1 : dividir por 5 los dígitos obtenidos en la bureta digital y multiplicar por 0.12 el valor obtenido 3.3 - el trazador añadido fue 0.6 mg C l-1 en el Atazar y 0.9 mg C l-1 en Santillana. 3.4- calcular Vc (según esta fórmula, la del guión es errónea). Vc (h-1) % 13C - % AN = ------------------------------------------------------------------T (( -------------- x 100) - % AN ) x tiempo en horas T+DIC 3.5- calcular RhoC Rho C (µg C/l . h) = Vc x POC Vc= tasa de aumento de isótopo (h-1) Rho C= tasa de incorporación de C por la comunidad (µg C l-1 h-1) AN= Abundancia natural (% 13C) T= [trazador] (mg C l-1) DIC= [Carbono Inorgánico Disuelto] (mg C l-1) POC= Carbono orgánico particulado (µg l-1 ) 3.6- Calcular la fotosíntesis específica Fs (mg C asimilado (mg C l –1 h –1 ) = Rho C / [cl] 4.- Representar los valores obtenidos de fotosíntesis específica frente a moles de fotones por metro cuadrado en el periodo de incubación, generando la curva P versus I. 5.- Estimar con la curva anterior los siguientes parámetros fotosintéticos: 9 - la fotosíntesis máxima (PS) anotando la Fs máxima medida, - (afinidad de los fotosistemas) calculando la pendiente de la recta en la parte ascendente de la curva. Se calcula dividiendo para cada valor de esta parte de la curva obtenido de Fs entre su irradiancia y calculando posteriormente la media de todos los valores. - la pendiente de fotoinhibición . Cuando los organismos fotosintéticos reciben irradiancias muy superiores a las que sus fotosistemas pueden admitir, se produce el efecto de fotoinhibición que consiste en una disminución de la actividad fotosintética debida al daño en los fotosistemas por el exceso de fotones. La fotoinhibición se percibe en las curvas PvsI como una caída de la asimilación de C al aumentar la irradiancia. Se calcula dividiendo para cada valor de Fs de la región descendente de la curva entre la irradiancia y calculando posteriormente la media de todos los valores. 6.- Comparar los parámetros fotosintéticos obtenidos en las comunidades del Atazar y de Santillana en cada día de muestreo. 7.- Interpretar y discutir los datos obtenidos utilizando los parámetros fotosintéticos, las características físico-químicas del agua y la estructura de la comunidad fitoplanctónica en cada embalse. 8.- Para los que deseen profundizar más en estos datos pueden estimar la entrada de C en cada uno de los ecosistemas en el día de muestreo, considerando la penetración de la luz en la columna de agua y la irradiancia diaria ( los perfiles de penetración de luz y las irradiancias diarias estarán disponibles en el espacio virtual).