Técnicas analíticas básicas en Fisiología Vegetal

Seminario Nº 3B
TÉCNICAS ANALÍTICAS BÁSICAS EN FISIOLOGÍA
VEGETAL
Contenido hídrico
Para saber el agua que contiene una planta se usa una técnica muy sencilla que
consiste en dos mediciones consecutivas del peso de la planta en distintas
condiciones. La primera, Peso fresco, consiste en el pesado de la planta intacta u
órgano que se desee cuantificar. Se tara la báscula con la porción de papel necesaria
pesándose a continuación el material de estudio. La segunda medida, Peso seco
consiste en pesar la planta en cuestión tras mantenerla en estufa a 60-70º C hasta
peso constante. La diferencia entre ambas medidas nos informará sobre el contenido
hídrico de la planta.
Determinación de pigmentos fotosintéticos
La fotosíntesis, proceso que permite a los vegetales obtener la materia y la energía
que necesitan para desarrollar sus funciones vitales, se lleva a cabo gracias a la
presencia en las hojas y en los tallos jóvenes de pigmentos, capaces de captar la
energía lumínica.
Entre los distintos métodos que existen para separar y obtener esos pigmentos se
encuentra el de la cromatografía, que es una técnica que permite la separación de las
sustancias de una mezcla y que tienen una afinidad diferente por el disolvente en que
se encuentran. De tal manera que al introducir una tira de papel en esa mezcla el
disolvente arrastra con distinta velocidad a los pigmentos según la solubilidad que
tengan y los separa, permitiendo identificarlos perfectamente según su color.
PIGMENTO
COLOR
Clorofila A
Verde azulado
Clorofila B
Verde amarillento
Carotenos
Naranja
Amarillo
Xantofilas
La técnica que se describe a continuación se puede realizar sin ningún problema en
casa.
Material necesario.
Hojas de espinaca o de cualquier planta cortadas en porciones.
Alcohol de 96º (sirve el que utilizamos para desinfectar las heridas)
Un mortero
Dos filtros de café
Un embudo
Un vaso
Una pinza de la ropa
¿Cómo lo hacemos?
Se coloca en el mortero las hojas que se hayan elegido, se añade un poco de alcohol
y se trituran hasta que el alcohol adquiera un tinte verde intenso.
Se filtra el líquido utilizando el embudo en el que se ha puesto el filtro de café.
Se recortan unas tiras de papel del otro filtro y se introducen en el vaso hasta que
toquen su fondo procurando que se mantengan verticales con la ayuda de la pinza
Se esperan 30 minutos y aparecerán en la parte superior de la tira de papel unas
bandas de colores que señalan a los distintos pigmentos.
OTROS MÉTODOS
Medida de pigmentos fotosintéticos en Dunaniella viridis
Extracción de acetona a partir de precipitados y medida espectrofotométrica.
Materiales:
 Espectrofotómetro
 Centrífuga de mesa
 tubos
 acetona
Método de extracción y medida
1. Tomar 5ml de muestra y centrifugar durante 5min
2. Guardar sobrenadante para medir fosfato con método verde malaquita
3. Resuspender el precipitado en 4ml de acetona para extraer pigmentos
4. Mezclar y enrasar a 5ml con H2O destilada
5. Centrifugar 1min
6. Medir la absorbancia del sobrenadante resultante
7. Posibles resultados:
-750nm turbidez
-664nm máximo de absorción de la clorofila A
-480nm máximo de absorción de pigmentos carotenoides
8. Cálculos:
-para clorofila A: multiplicar resultados por factor de 10,3 (mg /ml)
-para carotenoides: multiplicar por factor de 10 (mg /ml)
Otro método para la extracción de pigmentos es el que se describe a continuación:
 Materiales
1 Mortero
1 Embudo de Buchner
1 Matraz de filtración
1 Matraz aforado de 50 ml
Probeta de 100 ml
Vaso de precipitados de 200ml.
Tubos de ensayo
1 Pipeta de 5ml.
1 Embudo
Pipeta pasteur, mechero, tripie y rejilla
Espectrofotómetro y celdas
2 Discos de papel filtro
Gradilla
1 gr de hojas frescas de espinacas.
3gr de pétalos de flores azules
Arena
 Reactivos
Acetona al 80% (v/v)
H2S04 0.1N
NAOH 0.1N
Papel pH 0-14
 Metodología
1. Coloque en el mortero 1 g de hojas de espinacas, sin las nerviaciones, cortadas en
pequeñas porciones.
2. Agregue arena y 4 ml de acetona al mortero, para moler el tejido y obtener una
pasta fina. Adicione 20ml más de acetona.
3. Transfiera cuidadosamente el extracto resultante al embudo de Buchner provisto de
papel filtro, y filtre al vacío.
4. Agregue otros 50ml de acetona a la pulpa de las hojas y reanude la molienda y el
filtrado. Este segundo extracto agréguelo al primero. El tejido debe de quedar sin
clorofila, de lo contrario repita el proceso con otros 20ml de acetona y reúna todos los
filtrados.
5. Lave el mortero y el embudo con 50ml de acetona que se incorporara al filtrado. En
todo el proceso no debe de usar mas de 100ml de acetona; se aconseja aforar a 50ml
en un matraz.
6. Lea la densidad óptica (D) a 645, 652, 663 nm del extracto. usando como
blanco el acetona. Anote las densidades medidas.
Análisis y cuantificación de antocianos
1. Macere 3g de pétalos de flores azules y colóquelos en un vaso de 200ml, con
100ml. de agua y ponga a hervir durante unos minutos.
2. Enfríe un poco el extracto y filtre
3. En 3 tubos de ensayo. coloque 5 ml del extracto
4. En tubo uno mida el pH de la solución, utilizando un papel indicador.
5. Al tubo 2, agregue gota a gota la solución de H2S04 0.1 N y observe cualquier
cambio de color con respecto al original. Determine el pH y continúe la adición del
ácido para ver si ocurren otros cambios.
6. Al tubo 3 añada NAOH 0.1 N gota a gota y mide el pH de la solución al transcurrir
un cambio de color.
 Resultados
Densidad de 645 nm con absorbancia de 0.400
Densidad de 652 nm con absorbancia de 0.550
Densidad de 663 nm con absorbancia de 0.832
CLOROFILA A 0.47452
CLOROFILA B 0.263312
CLOROFILA TOTAL 1 0.737632
CLOROFILA TOTAL 2 0.7971
TRATAMIENTO COLOR pH
Extracto original amarillo 7
Extracto mas H2S04 rosa 3
Extracto más NAOH verde 9
Método de Lichtenthaler y Welburn (1983)
En un mortero se homogeniza 1 gr de hojas con éter dietílico en frío. El
homogeneizado obtenido se filtra a través de un crisol con placa filtrante nº 3 (Pobel),
acoplado, mediante una junta de goma, a un embudo con filtro de vidrio poroso nº 3
(Pobel). El conjunto va encajado a su vez, en un kitasato con un tubo de ensayo
sumergido en hielo, donde se recogió el filtrado. Sobre la placa del primer crisol se
colocó una capa de celulosa nativa en polvo de 1 cm de espesor, para eliminar el agua
del extracto. A este sistema se le conecta una corriente de nitrógeno que se adapta
mediante un embudo invertido a la boca del crisol. En el interior del kitasato se realiza
vacío para acelerar la filtración y evaporar el disolvente, con lo que se arrastra el
nitrógeno y se crea una atmósfera inerte que evita la oxidación de los pigmentos.
El homogeneizado se lava con éter dietílico hasta que éste sale incoloro y, finalmente,
se enrasa a un volumen de 25 ml. Durante todo el proceso la muestra se mantuvo en
penumbra y sumergida en hielo, para evitar la destrucción de los pigmentos
fotosintéticos.
A continuación se midió la absorbancia de la muestra a 600, 644 y 662 nm en un
espectrofotómetro Perkin Elmer 550 SE de doble haz. El contenido en clorofilas se
determinó según las fórmulas :
Cl a :10,5 x Abs (662) – 0,166x Abs (644)
Cl b : 16,37 x Abs (644) – 3,14 x Abs (662)
Cl total : 100,5 x Abs (600)
Los resultados se expresan en mg de clorofila /gr
Utilización del espectrofotómetro:
Las etapas son:
1) El espectrofotómetro debe de encenderse al menos media hora antes de hacer una
medición. Se comprueba que el aparato da una señal estable de ajuste del cero de
absorbancia.
2) Se selecciona la longitud de onda del máximo de absorción del compuesto a medir
con el mando correspondiente.
3) Se selecciona la opción de medir en absorbancia.
4) Se toma una cubeta de plástico de 3 ml, procurando cogerla de manera que no se
manchen las paredes de la cubeta que se expongan al haz de luz del
espectrofotómetro.
5) Se vierte en la cubeta un volumen de la solución del blanco reactivo tal que ocupe
las tres cuartas partes del volumen de la cubeta (~ 2,5 ml).
6) Se coloca la cubeta en el compartimento de cubetas del espectrofotómetro,
procurando que las paredes lisas de la misma se coloquen en la dirección del haz de
luz del espectrofotómetro.
7) Se realiza el ajuste del cero de absorbancia. Este mando no se debe de tocar en las
posteriores etapas.
8) Se saca la cubeta y se devuelve la solución blanco a su correspondiente tubo de
ensayo, procurando que en la cubeta no queden gotas (no es necesario secarla).
9) Se vierte en la misma cubeta la solución que contenga la muestra problema.
10) Se introduce la cubeta en el compartimento de muestra del espectrofotómetro.
11) Se mide la absorbancia de la solución de muestra problema.
Determinación de proteínas
Uno de los métodos mas usados hoy en día es el método de Bradford (1976) .
Método de Bradford (1976)
· Consiste en la formación de un compuesto de adsorción de coloración azul entre los
residuos de aminoácidos básicos de las proteínas y el colorante Azul de Comassie.
· Absorbe luz a 595 nm.
· El rango de determinación de proteína es de 1-10 mg/ml (ensayo micro) y de 0,5 -1,4
mg/ml (ensayo estándar).
· La intensidad de absorción depende del contenido de aminoácidos básicos y
aromáticos
 Reactivos:
Reactivo de Bradford
Disolver 5 mg de azul de Comassie en 2.5 ml de etanol al 96%
Añadir 5 ml de ácido ortofosfórico al 85%
Diluir hasta 50 ml con agua destilada
Dejar reposar 24 h en oscuridad y filtrar 2 veces con papel de filtro o con filtros de 45
nm
Conservar en botella oscura no mas de 15 días
Patron de BSA, 100 microgramos/ ml en agua
 Técnica:
B
P1
P2
P4
P6
P8
Agua
100
90
80
60
40
20
Patrón
10
20
40
60
80
Problema
Bradford
1000 1000 1000 1000 1000 1000
Nota: todas estas cantidades están expresadas en microlitros.
Agitar bien. Esperar 2-3 minutos.
Leer absorbancia a 295 nm.
La reacción es estable durante 1 hora.
Lavar la cubeta con metanol entre medida y medida.
P10
Pr1
Pr2
100
1000
25
1000
50
1000
Método de Makino
En este ejemplo concreto vamos a usar el kiwi como modelo.
Se tritura 1 g material en un mortero con nitrógeno líquido y 1% de
polivinilpirrolidona(PVPP) (p7v) con el fin de eliminar los fenoles. El polvo obtenido se
disolvió en 1 ml de tampón Tris-HCl 0.5 M, pH 6.8. El extracto obtenido se utilizó para
determinar proteínas totales y Rubisco.
El ensayo de proteínas totales se realizó mediante anánlisis colorimétrico, utilizando el
kit Protein Assay © de BIORAD, USA. Antes de cada ensayo se realizó una curva de
calibración con diluciones conocidas de una solución de seroalbúmina bovina (BSA),
entre 2 y 20 microgramos/microlitros.
Para la separación del enzima rubisco ya se llevaron a cabo más pasos y de mayor
complejidad.
Método de Lowry
Para aumentar la sensibilidad de la reacción del biuret, el complejo proteína-Cu2+ se
hace reaccionar con el reactivo de Folin-Ciocalteus, dando una coloración azul, con un
máximo de absorción a 650 nm. Esta coloración se atribuye a la reducción del ácido
fosfomolíbdico/fosfotúngstico a azul de heteropolimolibdeno de composición no
definida, por medio de los residuos tirosilos, triptofanilos, y en menor grado, cisteinilos
e histidilos de las proteínas que forman el complejo con el Cu2+.
Las características del método son:
· La intensidad de la coloración varía con la composición de aminoácidos de la
proteína.
· Es más sensible que el ensayo del biuret. El rango es de 0,1-1 mg/ml.
· La modificación de Hartree incrementa la sensibilidad de 0,015-0,15 mg/ml.
· Presenta muchas interferencias.
Complejo
Complejo
Proteína-Cu
2+
2+
Proteína-Cu
AA red.
AA oxid.
Reactivo Folin
Reactivo Folin
oxid.
red.
AMARILLO
AZUL
Esquema de la reacción de Lowry
Reacción del Biuret
El nombre de la reacción procede del compuesto coloreado formado por la
condensación de dos moléculas de urea con eliminación de amoníaco.
H 2N
CO
NH 2
H 2N
CO
NH 2
Q
H 2N
CO
NH CO NH 2
Biuret
Urea
Reacción del Biuret
Si una solución fuertemente alcalina de sulfato cúprico (CuSO4) se añade a una
solución de proteína se forma una complejo entre el ión cúprico y los enlaces
peptídicos, con aparición de una coloración violeta-púrpura, que presenta un máximo
de absorción a 540 nm.
Las características más importantes de la reacción son:
· La reacción del Biuret se aplica, a partir de los tetrapéptidos, a todos los
péptidos y proteínas.
· Su rango de determinación es de 1 a 6 mg/ml.
· No depende de la composición de aminoácidos.
· Algunos compuestos (NH4+, Tris, etc.) dan la reacción.
O
C
C
NH
O
HN
RC H
H CR
Cu 2+
O
C
NH
RC H
C
O
HN
H CR
Violeta-púrpura
Complejo proteína-Cu(II)
Método del ácido bicincónico
· Está basado en la reducción en medio alcalino de Cu(II) a Cu(I) en medio
alcalino y la formación de un complejo ácido bicincónico:Cu(I), con un máximo
de absorbancia a 562 nm.
· El rango de concentración de proteína es de 0,5-30 mg/ml.
· Más rápido que el método de Lowry.
· Altamente preciso y sensible.